樟葉越桔糖基轉移酶VdUGT1基因克隆及序列分析

宋 健，熊 宏，朱東陽，趙 平，杜 維，劉小燭，丁 勇

（1. 西南林業大學生命科學學院，云南 昆明 650224；2. 西南林業大學 西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點實驗室，云南 昆明 650224）

樟葉越桔糖基轉移酶VdUGT1基因克隆及序列分析

宋 健1，熊 宏1，朱東陽2，趙 平2，杜 維1，劉小燭1，丁 勇1

（1. 西南林業大學生命科學學院，云南 昆明 650224；2. 西南林業大學 西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點實驗室，云南 昆明 650224）

根據樟葉越桔Vaccinium dunalianum葉芽轉錄組測序實驗獲得的糖基轉移酶VdUGT1基因部分cDNA序列設計引物，采用RACE-PCR技術克隆了全長1 620 bp cDNA序列的VdUGT1基因，包括1 398 bp cDNA序列的完整開放閱讀框，推測編碼由465個氨基酸殘基組成、相對分子質量為50.89 kD的糖基轉移酶VdUGT1。序列分析表明，VdUGT1理論等電點為5.53，負電荷殘基（Asp+Glu）總數為53個，正電荷殘基(Arg+Lys)總數為41個，不穩定系數為48.38，屬于不穩定蛋白；其二級結構的主要構件為α-螺旋和隨機卷曲，無跨膜結構域，屬于親水性蛋白質。VdUGT1位于C末端含有尿嘧啶核苷二磷酸糖基轉移酶所特有UDPGT功能域，推測與尿嘧啶核苷二磷酸糖的結合有關。該研究為后期VdUGT1的異源表達和功能研究奠定了基礎。

樟葉越桔；尿嘧啶核苷二磷酸糖基轉移酶；RACE；基因克??；序列分析

糖基轉移酶（glycosyltransferases，GTs；EC 2.4.x.y）是所有生物有機體中存在的專門負責催化糖基化反應的酶，它能將活性糖基從供體分子轉移到受體分子上[1]。植物中常見的糖基供體是尿嘧啶核苷二磷酸（Uridine diphosphate，UDP）糖（葡萄糖、半乳糖、木糖和鼠李糖等）[2-5]，因此GTs也被稱為尿嘧啶核苷二磷酸糖基轉移酶（UDP-glycosyltransferases，UGTs）。糖基化受體包括次級代謝產物、激素、病原菌侵染物、以及內外源毒性物質等植物小分子化合物[4-5]。糖基化是植物小分子化合物較普遍的一種修飾反應，可以改變受體分子的化學穩定性、親水性、轉運性、亞細胞定位，有助于其在細胞內和生物體內的運輸和貯藏[6]。UGTs具有多種生物活性與功能，可催化多種底物，其在植物生長發育、代謝調節、解除內外源毒素毒性、以及次生代謝產物合成與貯存等方面發揮重要功能[7]。

樟葉越桔Vaccinium dunalianum為杜鵑花科Ericaceae越桔屬Vaccinium植物。Zhao[8]等發現云南省野生樟葉越桔是一種富含熊果苷（arbutin，對-羥基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷）及其衍生物的特殊資源植物。天然熊果苷是植物體內的對苯二酚和UDP葡萄糖在UGTs成員之一熊果苷合成酶（arbutin synthase）（EC2.4.1.-）的催化下生物合成而來。推測樟葉越桔中存在高活性表達的糖基轉移酶VdUGT家族，并提示酶基因及其表達產物在該植物生長發育中具有某種重要的、不可或缺的生物學功能。

UGTs在擬南芥Arabidopsis thaliana[6]、蛇根木Rauwolf i a serpentina[9]、小立碗蘚Physcomitrella patens和 江 南 卷 柏Selaginella moellendorff i i[10]、山葡萄Vitis amurensis[11]、水稻Oryza sativassp.Japonica[12]、以及鷹嘴豆Cicer arietinum[13]等物種中都有一定的研究，所對應的基因均已被克隆并測序。但目前尚無樟葉越桔糖基轉移酶及其基因的相關報道。本研究根據前期樟葉越桔葉芽轉錄組測序實驗得到的VdUGT1基因部分cDNA序列設計引物，結合RACE-PCR技術克隆了VdUGT1基因全長cDNA序列，并對VdUGT1蛋白特性進行了分析。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

供試樟葉越桔Vaccinium dunalianumWight葉芽材料采自云南省楚雄彝族自治州武定縣高橋鎮唐家村（海拔2 100 m，北緯25°57′、東經102°24′）。取樟葉越桔新鮮葉芽置于液氮中速凍，帶回實驗室后保存于–80℃冰箱中備用。

植物總RNA提取試劑盒購自Omega公司，RACE-PCR試劑盒購自Clontech公司，逆轉錄試劑和pMD18-T載體購自寶生物工程有限公司，膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司，其他相關試劑購自昆明滇工科技有限公司，大腸桿菌DH5α為本實驗室保存菌種。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取與檢測

參照朱東陽等[14]方法提取樟葉越桔葉芽總RNA，分別用紫外分光光度計法和1.2%瓊脂糖凝膠電泳法檢測總RNA樣品的純度和完整性。

1.2.2 樟葉越桔VdUGT1基因全長cDNA克隆

根據本課題組前期樟葉越桔葉芽轉錄組測序獲得的VdUGT1基因部分cDNA序列設計RACE引物，引物合成由上海生物工程有限公司完成。3′-RACE引物包括反轉錄引物Adaptor-Oligo（dT）17：5′-CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGA GCTCAAGC（dT）17-3′，接頭外側和內側引物分別為 AP-Outer：5′-CCAGTGAGCAGAGTGACG-3′和 AP-Inner：5′-GAGGACTCGAGCTCAAGC-3′，特異性外側和內側引物分別為3′-GS-Outer：5′-GCCCTTCTACCAAGTCCAG-3′和 3′-GSInner：5′-CACCCTCACCGTAAATCGC-3′，第一鏈cDNA合成按照RNA反轉錄試劑盒說明書進行操作。二輪PCR反應程序為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸10 min。

根據VdUGT1基因已知EST和3′RACEPCR克 隆 的3′末 端cDNA序 列， 設 計5′-RACE 特 異 性 巢 式 引 物 5′-GS-Outer：5′-CAAGAACCCGCCCGTACCCGT-3′和 5′-GSInner：5′-GAGGGTAGTTTGGGTATTGGACGG-3′，按照RACE試劑盒說明書進行操作。第一輪Touchdown-PCR反應程序為：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，78℃退火30 s，72℃延伸 2 min，8個循環，每個循環退火溫度降低1℃；94℃變性30 s，70℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個循環。第二輪PCR反應程序為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，70℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸10 min。

1.2.3 PCR產物檢測、回收、T/A克隆與測序

PCR產物在1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測，回收目的片段并連接到pMD18-T載體上，將重組子轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，隨機篩選白色菌落，由上海生工生物工程技術服務有限公司完成陽性克隆測序。

1.2.4 VdUGT1的生物信息學分析

采用NCBI提供的ORF fi nder程序分析基因開放閱讀框；DNAMAN構建ORF核苷酸序列并推導其氨基酸序列；利用ExPASy ProtParam程序分析氨基酸的殘基數目與組成、相對分子質量、理論等電點和穩定性；利用NCBI Blast程序對推導的蛋白質進行相似性比較，Clustalx2和Jalview軟件對同源性高的序列進行多序列比對，MEGA4.1分子進化遺傳分析軟件通過鄰位相連法（Neighbor-joining）構建系統發生樹，系統樹每個統計學顯著性分析以自展法（Boot-strp）進行檢驗，重復1 000次[15]；使用 Siganal V4.0 （http://www.cbs. dtu.dk/services/SignalP-2.0/）分析蛋白信號肽；使 用 TMHMM（http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM） 和 Proscale（http://www.expasy.org/cgibin/protscale.pl）分別檢測其跨膜結構和親水/疏水性特性；利用SOPMA程序（http://npsapbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=/NPSA/ npsa_sopma.html）預測蛋白質序列的二級結構；使用NCBI提供 的 Conserved Domain Search （CD-Search） 服務 器（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進行蛋白功能域分析。

2 結果與分析

2.1 樟葉越桔VdUGT1基因cDNA全長克隆

本實驗獲得的樟葉越桔葉芽總RNA的28S和18S rRNA條帶清晰完整，亮度比約為2∶1，無彌散拖尾且點樣孔無污染，總RNA的A260/A280值處于1.8～2.0之間。以提取的總RNA反轉錄合成的第一鏈cDNA為模板進行RACE-PCR擴增，得到樟葉越桔VdUGT1基因3′末端cDNA和5′末端cDNA（圖1），經回收主條帶、TA克隆測序長度分別為1 315 bp和242 bp，最終拼接得到樟葉越桔VdUGT1基因全長cDNA序列為1 620 bp。

圖1 樟葉越桔VdUGT1基因3’RACE（A）和5’ RACE（B）PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agrose gel electrophoresis analysis of VdUGT1 3’RACE (A) and 5’ RACE (B) PCR products

2.2 序列分析

克隆的樟葉越桔VdUGT1基因mRNA序列長 1 620 bp，包括 57 bp 5′UTR、1 398 bp ORF 和165 bp 3′UTR，推測編碼由465個氨基酸組成的VdUGT1蛋白。VdUGT1基因ORF序列及其推導的蛋白序列如圖2所示。蛋白質理化性質分析結果顯示VdUGT1蛋白相對分子質量為50.89 kD，氨基酸總數為465個，理論等電點為5.53，負電荷殘基（Asp+Glu）總數為53個，正電荷殘基（Arg+Lys）總數為41個，不穩定系數為48.38，推測VdUGT1屬于不穩定蛋白質。

圖2 VdUGT1 ORF核苷酸序列及其推導的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of VdUGT1 ORF

同源性分析結果顯示VdUGT1與枸杞Lycium barbarum（LbUGT，AB360632.1）、 蛇 根 木R.Serpentine（RsUGT，AJ310148.1）、番茄Solanum lycopersicum（SlUGT，XM_004231159.1）等的糖基轉移酶之間具有48%～64%的序列同源性，其中與枸杞LbUGT和蛇根木RsUGT同源性分別高達64%和63%。類似于其他物種的糖基轉移酶，樟葉越桔VdUGT1位于C末端含有尿嘧啶核苷二磷酸糖基轉移酶所特有UDPGT功能結構域PSPG box（圖3）。對圖3中顯示的不同物種的GTs進行系統發生分析，結果顯示樟葉越桔VdUGT1與 羅 漢 果SgUGT2（HQ259621.1） 和SgUGT3（HQ259622.1）聚為一分支（圖4）。

信號肽是分泌性蛋白N端的一段氨基酸序列，是指導分泌性蛋白合成的最重要因素，一般有16～26個氨基酸殘基，在完成自己的功能后被切除[16]。VdUGT1蛋白信號肽分析結果顯示，最大C值（原始剪切位點的分值）為0.144，位于第51個氨基酸殘基；最大Y值（綜合剪切位點的分值）為0.058，位于第46個氨基酸殘基；最大S值（信號肽的分值）為0.217，位于第10個氨基酸殘基；平均S值為0.102，位于第1～45位氨基酸殘基之間；綜合計算信號肽存在的可能性值為0.009，信號錨定的可能性值為0.001，第17～18位氨基酸殘基之間的剪切的值為0.004。推測樟葉越桔VdUGT1為非分泌性蛋白。蛋白質跨膜結構域預測結果（圖5）顯示VdUGT1肽鏈不存在蛋白質跨膜結構域，位于細胞膜外。

圖3 VdUGT1和其他植物GTs的氨基酸序列比對Fig.3 Alignment of deduced amino acid sequences of VdUGT1 and GTs gene from other plants

圖4 VdUGT1和其他植物GTs的進化樹分析Fig.4 Phylogenetic analysis of VdUGT1 and other plant GTs

疏水性一方面可以為二級結構預測結果提供參考，另一方面還可以為結構域以及功能域的劃分提供依據[17]。通過疏水性分析樟葉越桔VdUGT1蛋白質中疏水性最大值是2.286, 位于第115位氨基酸殘基處；親水性最大值是-2.264，位于第189位氨基酸殘基處；綜合分析其親水性氨基酸均勻分布在整個肽鏈中，沒有明顯的疏水區域（圖6）。結合蛋白質性質和跨膜結構域分析結果，推測樟葉越桔VdUGT1為非分泌性的可溶性蛋白質，其在細胞質中合成后不經運轉，直接分布在細胞質特定部位發揮其功能。

圖5 VdUGT1蛋白跨膜結構域預測Fig.5 Prediction of transmembrane regions of VdUGT1

圖6 VdUGT1蛋白質疏水性和親水性分析Fig.6 Prediction of VdUGT1 protein hydroPhobicity and hydroPhilicity prof i le

蛋白質分子的多肽鏈通常折疊和盤曲成比較穩定的空間結構，形成比較穩定的二級結構，進一步才能完成活性功能域構象的構建，以完成特定的生命活動。VdUGT1蛋白質二級結構預測結果（圖7）顯示其由43.01%的α-螺旋、5.81%的β-轉角、14.19%的β-折疊和36.99%的隨機卷曲組成?？梢姦?螺旋和隨機卷曲構成了VdUGT1蛋白的主要二級結構。VdUGT1蛋白結構功能域分析結果表明其含有PLN00164、PLN03015、UDPGT、MGT和COG1819等多種功能域，其中位于C末端含有尿嘧啶核苷二磷酸糖基轉移酶所特有UDPGT功能域，推測與尿嘧啶核苷二磷酸糖（UDP-sugar）的結合有關[18]。

圖7 VdUGT1蛋白二級結構預測Fig.7 Secondary structure prediction of deduced VdUGT1 protein

3 結 論

GTs為高度分歧的多源基因家族，根據蛋白酶的催化特性、氨基酸序列相似性、以及有無保守結構/功能域，目前已將其分為96個家族[19-20]。其中，糖基轉移酶家族1（GT1），又稱UGTs，是GTs中的最大家族[4-5]，可催化激素、類黃酮、以及像殺蟲劑和除草劑等外源物質等次生代謝產物的糖基化[13]。目前已在擬南芥Arabidopsis thaliana中發現有120個UGTs基因[6]，在江南卷柏Selaginella moellendorff i i和小立碗蘚Physcomitrella patens中分別發現有142個和21個UGTs基因[10]，在‘黑比諾’Pinot Noir葡萄Vitis vinifera中發現有99個UGTs基因[21]，在水稻Oryza sativassp. Japonica中發現有213個UGTs基因[12]，在鷹嘴豆Cicer arietinum中發現有96個UGTs基因[13]，所對應的基因全序列或部分序列已被克隆并測序。本課題組前期工作開展了樟葉越桔葉芽轉錄組測序分析研究，通過COG功能分類分析獲得了至少53條樟葉越桔糖基轉移酶基因EST序列。本研究通過RACE-PCR技術克隆了一個全長1 620 bp mRNA序列的樟葉越桔糖基轉移酶基因，命名為VdUGT1，具有真核生物mRNA典型的Poly（A）尾巴結構和完整的ORF區域。

氨基酸序列分析發現來自不同植物的已知UGTs在C末端均具有1個由44個氨基酸殘基組成的與底物供體UDP-sugar結合密切相關的高保守性的特征模體（signature motif），稱為PSPG模 體（Plant Secondary Product Glycosyltransferase Motif），推測與UDP-sugar的結合有關[19-20]。本研究克隆獲得的VdUGT1基因推測編碼的由465個氨基酸殘基組成的樟葉越桔糖基轉移酶VdUGT1在381-384位氨基酸殘基間同樣具有UGTs特征模體—PSPG模體（圖3），保守序列為WAPQIEVLSHGSTGGFLSHCGWNSTIESVVH GVPIIAWPLYA EQ，決定了糖基供體結合位點的微環境。另外，在VdUGT1蛋白的N-末端結構域（N-Terminal Domain，NTD）第18位（圖3）有1個保守的組氨酸殘基，推測與存在于其他植物UGTs的NTD中的保守的組氨酸殘基一樣，可提供堿性微環境（如OH和NH等），對糖基供體和受體分子之間的結合起催化作用，有助于糖基受體去質子化，接受來自于糖基供體分子上的末端異構中心的親核攻擊，這也是UGTs催化糖基轉移反應的基礎[13,22]。

UGTs的亞細胞定位研究表明，UGTs一般為可溶性蛋白質[3]。在植物細胞中不同組分的UGTs活性反應實驗證明，絕大多數UGTs是在細胞質基質中才表現出活性[23-24]。本研究根據蛋白質信號肽預測和跨膜結構域分析結果推測樟葉越桔VdUGT1為非分泌性的可溶性蛋白質，其在細胞質中合成后不經運轉，直接分布在細胞基質特定部位發揮其功能。不同種類的UGTs可能定位于不同細胞或同一細胞的不同細胞器，以催化不同底物的糖基轉移反應[22]。Hefner等[9]研究表明在74種天然或合成化合物中，有45個化合物可以被蛇根木糖基轉移酶RsUGT糖基化，表明UGTs的底物專一性較低。UDPG和對苯二酚在植物體內可被UGTs成員之一熊果苷合成酶催化生成熊果苷，因其能夠競爭性抑制酪氨酸酶活性從而抑制黑色素的形成，熊果苷被國際公認為21世紀天然、低毒、高效的皮膚美白劑，是皮膚美白化妝品中理想的活性添加成分。本課題組Zhao等[8]研究發現在樟葉越桔幼嫩葉芽中熊果苷衍生物含量占植物材料干重的22%，推測在樟葉越桔中存在高活性表達的UGTs。本研究成功從樟葉越桔中分離得到糖基轉移酶基因家族中的VdUGT1基因全長cDNA序列，推導的糖基轉移酶VdUGT1屬于UGTs家族的一個新成員。VdUGT1是否具有與其他UGTs類似的多底物接受特性，則需要開展異源表達和功能驗證等深入研究。

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Cloning and sequence analysis of Glycosyltransferase geneVdUGT1 inVaccinium dunalianum

SONG Jian1, XIONG Hong1, ZHU Dong-yang2, ZHAO Ping2, DU Wei1, LIU Xiao-zhi1, DING Yong1
(1. College of Life Sciences, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China; 2. Key Lab. for Forest Resources Conservation and Use in Southwest Mountains of China, Ministry of Education, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China)

Based on the partial cDNA of geneVdUGT1 isolated by transcriptome sequencing fromV. dunalianumin previous study,the full-length cDNA comprised 1 620 nucleotides consisting of an open reading frame of 1398 nucleotides was cloned by RACE-PCR fromV. dunalianum. The open reading frame encoded a putative VdUGT1 comprising 465 amino acid residues with molecular weight of 50.89 kD and isoelectric point of 5.53. The sequence analysis showed that the total numbers of negative charged residues (Asp+Glu) and charged residues (Arg+Lys) in VdUGT1 were 53 and 41, respectively. VdUGT1 with unstable coeff i cient 48.38 belongs to the unstable protein. It was predictive VdUGT1 had no signal peptide and transmembrane structure. The main parts of predicted secondary structures of VdUGT1 were α-helices and random coils. UDPGT domain, a characteristic functional domain of UDP-glycosyl- transferases existing in the near C-terminus of VdUGT1 plays an important role in combining with UDP-sugar. The results established a foundation for the heterologous expression and functional analysis of VdUGT1in the later period.

Vaccinium dunalianum; UDP-glycosyltransferase; RACE; gene cloning; sequence analysis

S759.95；S663.9

A

1673-923X(2015)06-0080-07

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.06.015

2014-12-03

云南省高校林下生物資源保護及利用科技創新團隊項目；云南省優勢特色重點學科生物學一級學科建設項目（50097505）；國家自然科學基金（21462040, 31460076）

宋 健，碩士研究生 通訊作者：丁 勇，高級實驗師，碩士生導師，E-mail：dingyong@swfu.edu.cn

宋 健,熊 宏,朱東陽,等. 樟葉越桔糖基轉移酶VdUGT1基因克隆及序列分析[J].中南林業科技大學學報, 2015, 35(6):80-86.

[本文編校：吳 彬]