包頭市春小麥不同部位內生真菌的分離與初步鑒定

劉建青(內蒙古科技大學包頭師范學院生物科學與技術學院，內蒙古包頭014030)

內生真菌是指在植物體內完成其生活史的部分或全部，分布于植物各個組織和器官中，但又不引起任何病癥的微生物，與植物是一種互利互惠的共生關系［1］。由于內生菌普遍存在于植物體內，在生物防治方面比葉圍、根圍等微生物更具有應用潛力，因此，用內生菌來防治植物細菌病害、線蟲病害和真菌病害的研究報道較多［2－3］，且越來越受到植物病理學家的重視。然而，目前有關小麥內生菌分離、應用方面的報道很少［4－6］，在國內亦是空白。為此，筆者選用7種培養基，對內蒙古包頭市土右旗小麥不同部位的內生真菌進行分離純化，探討了內生真菌在小麥種子及根、莖、葉等不同部位的分布情況，旨在為進一步研究小麥內生菌的應用以及內生菌對小麥主要病害的生物防治作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料與試劑。水溶性淀粉、KH2PO4、K2HPO4、NaCl、NaOH、葡萄糖、蔗糖、MgSO4·7H2O、麥芽糖等購自天津永大化學試劑開發中心;蛋白胨、維生素、瓊脂、硝酸鈉、氯化鉀、硫酸亞鐵、梭甲基纖維素、NH4NO3、酵母膏、孟加拉紅培養基、牛肉膏等購自北京奧博星生物技術有限責任公司;馬鈴薯購自包頭市場。

1.1.2 主要儀器。尼康YS100型生物顯微鏡，北京博翔興旺科技有限公司;YXQ-LS-50型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業有限公司;HHBⅡ型恒溫培養箱，天津實驗儀器廠;SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺，蘇凈集團安泰有限公司;電熱恒溫水浴鍋，北京市長風儀器儀表公司。

1.1.3 培養基。該驗共選用7種培養基:基礎培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)、察氏培養基、梭甲基纖維素培養基、孟加拉紅培養基、水瓊脂培養基、牛肉膏蛋白胨培養基。另外，為防止細菌污染，培養基倒平板時，待溫度冷卻到45℃左右時，加100 μg/ml硫酸鏈霉素。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集。從包頭市土右旗7個地塊分期、分部位取樣，根據試驗目的選取樣品進行菌種分離。

1.2.2 小麥各部位表面消毒［7］。選用次氯酸鈉作為消毒劑。用自來水沖洗小麥種子后，在75%乙醇中浸泡1 min，無菌水沖洗3次，用3.0%次氯酸鈉浸泡9 min，75%乙醇浸泡30 s，無菌水清洗3次，用無菌濾紙吸干表面水分后備用。小麥的根、莖、葉等其他部位的次氯酸鈉消毒時間為7 min。

1.2.3 小麥內生真菌分離純化。

1.2.3.1 分離。初步清洗小麥的種子或組織，在無菌操作臺進行表面消毒，接種到培養基平板上，25℃培養，待長出菌落，對單菌落進行分離和保存，顯微觀察，鑒定各種內生真菌。

1.2.3.2 純化。內生真菌長出菌絲或者孢子后，用接種針挑取菌絲或孢子轉接到PDA的培養基平板對其進行純化，分離出單菌落。

1.2.4 內生真菌形態鑒定［8－10］。內生真菌形態鑒定包括菌落形態觀察以及顯微鑒定。其中，菌落形態包括菌落大小、質地、顏色、菌絲粗細和長短等;顯微鑒定用臨時裝片法，顯微特征包括菌絲的性狀、有無隔、寬度、是否分支等。

2 結果與分析

2.1 小麥各部分內生真菌分離率 小麥有5個不同生長期(出苗期、分蘗期、拔節期、乳熟期、臘熟期)，對小麥拔節期各部分內生真菌的分離率進行統計。由圖1可知，種子部位的內生真菌分離率較高，為28.03%。原因可能是有些小麥種植初形成時內部就帶有真菌，隨著種子的成熟，種子內部帶菌率逐漸提高。而內生真菌在莖、葉等部位的定殖率遠遠低于在種子的定殖率，因此，在小麥生長的拔節期則表現為種子內部的內生真菌分離率較高。

2.2 小麥內生真菌的鑒定 通過對分離得到的真菌的菌落形態分析及顯微鑒定，初步鑒定出以下幾個屬。

2.2.1 鏈格孢屬菌(Alternaria sp.)。PDA培養基上比較菌絲發達，菌落初期白色，后期變為灰色或不同程度的褐色;菌絲有隔，多分枝，大量產孢子，淡褐色至褐色;分生孢子梗單生或簇生(圖2)。

2.2.2 木霉屬(Trichoderma sp.)。其菌絲體為無色，初期白色，后期變白色夾雜青綠色;分生孢子梗分枝;分生孢子近球形、倒卵形、橢圓形，單胞，無色，在瓶梗頂端聚集成孢子頭(圖3)。

2.2.3 青霉屬(Penicillium sp.)。菌絲體比較發達，初期白色，后期呈藍綠色;分生孢子梗直立，頂端具對稱或不對稱的單輪、二輪至多輪掃帚狀分枝，頂層為瓶狀小梗;分生孢子多為球形、柱形、橢圓形，無色或淡色(圖4)。

2.2.4 根霉屬(Rhizopus sp.)。其菌絲粗且較長，經常迅速長滿整個培養皿，生長迅速，產生菌落不定形，初期為白色，后期會出現黑色顆粒;菌絲無隔、多核、分枝狀;孢子囊梗單生或叢生，頂端著生球狀的孢子囊，囊內有許多孢囊孢子(圖5)。

2.2.5 離蠕抱屬(Bipolaris sp.)。其菌落為深灰色或深褐色，與鏈格孢屬相類似，但邊緣整齊;其菌絲體呈暗色;分生孢子梗單生或者簇生，上部膝狀折曲;分生孢子紡錘形，微彎(圖6)。

2.2.6 曲霉屬(Aspergillus sp.)。其菌絲體比較發達，顏色變化較大，由淡黃色至黃綠色或黑色;分生孢子梗頂端膨大成球形、半球形或棍棒狀的頂囊，上生單層或雙層瓶狀小梗;分生孢子橢圓形，卵圓形，無色(圖7)。

2.2.7 類酵母菌(Saccharomyces)。無菌絲，為白色圓點，孢子有核(圖8)。

2.2.8 未知菌。初期為白色，生長時間長后為淡黃色，蓮花狀，無菌絲(圖9)，未鑒定出何種菌。

2.3 小麥內生真菌在宿主中的分布規律分析 在小麥生長過程中，根與種子的內生真菌分離率最高，莖部次之。葉內生真菌含量最少，原因可能是，隨著小麥生長，植株體內可利用營養物質逐漸增多，感染的真菌在植株體內不斷生長繁殖，故生物量逐漸增多，到小麥成熟期，植株組織己經開始老化，各組織表面通透性增強，外界菌群極易進入植株體內，導致真菌分離率很高［11］。

3 結論

試驗采用經典的內生真菌研究方法，對包頭市土右旗小麥各時期、各部位內生真菌多樣性進行了系統研究，在顯微鏡下觀察到一些內生真菌并對其進行了鑒定。但是傳統的分離方法具有一定的局限性，因此，要想分離觀察到全部內生真菌，還需要配合分子生物學方法來研究內生真菌多樣性，如直接提取小麥組織的DNA，特異性PCR后，進行序列分析，可以鑒定無法分離培養的內生真菌。試驗結果說明小麥內生真菌的分離是可以實現的，為進一步研究內生真菌與小麥之間的相互作用關系提供了實踐經驗。

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