我國植物青枯菌遺傳多樣性研究進展

黎妍妍，劉海龍，鄭 露，黃俊斌，李錫宏

(1．湖北省煙草科學研究院，湖北武漢 430030;2．華中農業大學植物科技學院，湖北省作物病害監測和安全控制重點實驗室，湖北武漢 430070)

植物細菌性青枯病是由青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的具有毀滅性的土傳病害。該病原菌廣泛分布于熱帶、亞熱帶和某些溫帶地區，能夠引起超過50科450多種植物青枯?。?－2］，其中包括許多經濟作物如馬鈴薯、煙草、番茄、茄子、香蕉、花生等，造成嚴重的經濟損失［3］。

青枯菌不同的分離株在寄主范圍、地理分布、致病性、流行特征和生理生化等方面存在明顯的多態性。為了描述青枯菌的種內變異性，各國學者對其進行了種以下的分類或分型的各種研究，提出了幾種分類體系來鑒別青枯菌，以此來明確青枯菌的演化過程［4］。傳統的分類體系是根據青枯菌的寄主范圍和對3種雙糖與3種己醇的氧化利用能力，將其劃分為不同的生理小種和生化型［5－6］。隨著分子生物學的快速發展，引入了分子生物技術對不同地理起源的青枯菌進行劃分和鑒定。通過多方面的基因序列分析，對青枯菌種群內的遺傳變異性進行了預測，在應用分子生物學技術明確青枯菌種群內遺傳變異性的基礎上，將青枯菌定義為復合種［7－8］，并提出了一種新的分類體系［9－10］。筆者綜述了我國植物青枯菌的危害、新的青枯菌寄主、青枯菌的分類體系、遺傳多樣性等方面的研究進展，旨在為我國青枯病的防控提供參考。

1 我國植物青枯病的危害現狀

1930年我國出現了青枯菌對花生的毀滅性危害，這是青枯菌危害我國植物的首次報道［6，11］，之后又在一些木本植物木麻黃［12－13］、桉樹［14－15］和桑樹［16］上發現了青枯病的危害。隨后該病迅速擴展蔓延，如今已廣泛分布于我國大部分地區，成為最主要的植物病害之一。在我國，受侵染的植物主要包括煙草、馬鈴薯、番茄、花生、辣椒、茄子、甘薯、姜、木麻黃、油橄欖、桑等，其中尤以煙草和馬鈴薯受害最嚴重［1，17－19］。

目前，在我國有22個省(區、市)種植烤煙，而煙草青枯病在其中14個主要產煙區普遍發生，其中尤以福建、云南、貴州、廣西、湖南煙區發生最嚴重，該病在某些年份常常暴發流行，給煙農造成巨大的經濟損失［20］。近年來，隨著全球氣候條件的改變，煙草青枯病的危害范圍已經開始由南向北擴展，江西、山東、安徽、湖北、陜西等地已經出現青枯菌危害煙草的報道，給我國煙草生產造成了巨大的威脅［21－27］。

我國馬鈴薯種植面積超過533．3萬hm2，而每年因馬鈴薯青枯病造成的馬鈴薯產量損失為10%～15%，發病嚴重的地塊產量損失可達80%甚至絕產，給馬鈴薯生產帶來嚴重威脅［28－30］。隨著我國馬鈴薯種植面積的不斷擴大，馬鈴薯青枯病的發生也日趨嚴重。目前我國已有10個省(市)發生馬鈴薯青枯病，包括山東、福建、云南、湖南、四川、貴州、廣東、湖北、河北和北京，而且有不斷向北蔓延的趨勢［31］。

青枯菌對其他作物造成的危害也不容忽視。番茄青枯病是番茄生產上主要病害之一，在長江以南各地尤其是華南地區發生較普遍［32－33］;桑青枯病在廣東個別地區發病率達80%;木麻黃青枯病使我國廣東沿海的一些林帶遭到毀滅，華南地區桉樹青枯病發生率達30% ～70%［34］;2009～2010年云南省西雙版納廣藿香種植區青枯病發病率達70%［35］。

2 我國新出現的青枯菌寄主

自1930年在我國首次發現青枯病侵染花生［6，11］，至今已報道青枯菌在我國能夠侵染超過22科45種植物，而且還有新的寄主不斷出現。何自福等鑒定出青枯菌在廣東引起空心菜青枯?。?6］;王濤等報道了青枯菌引起羅漢果青枯?。?7］;劉瓊光等鑒定出4種花卉美人蕉、姜花、黃穗和百日草青枯病是由青枯菌引起［38］，此后又發現了青枯菌能夠引起田間雜草涼粉草青枯?。?9］;佘小曼等報道了2種新的病害廣藿香青枯病和勝紅薊青枯病均是由青枯菌引起［40－41］;李鵬等首次報道雪蓮果青枯病是由青枯菌引起［42］，并且用分離自雪蓮果上的青枯菌接種杜氏鼠尾草、曼陀羅和鴨趾草等田間雜草，證明該3種雜草是青枯菌的新的潛在寄主［35］。

3 青枯菌的分類體系

主要根據青枯菌的致病性(寄主范圍)和生化特征(對碳源的利用能力)將其劃分為生理小種和生化型。目前，已報道青枯菌有 5 個生理小種［11，33，43－44］和 6 個生化型［5］。

青枯菌生理小種1號侵染寄主范圍最廣泛，能夠侵染煙草、番茄、花生、馬鈴薯等茄科植物以及涼粉草等田間雜草;生理小種2號主要侵染香蕉(麻口病)和海里康屬植物;生理小種3主要侵染馬鈴薯和番茄，偶爾侵染茄子;生理小種4主要侵染姜和勝紅薊;生理小種5主要侵染桑樹。根據青枯菌對3種雙糖(麥芽糖、乳糖和纖維二糖)和3種己醇(甘露醇、山梨醇和甜醇)的氧化利用能力，將其分為6個生化型(1、2A、2T、3、4、5)。在上述 2 個分類體系中，只有生理小種3和生化型2具有對應關系(R3Bv2)，并可通過特異性引物630-F/631-R 進行 PCR 鑒定［9，31，45］。然而，作為傳統的青枯菌分類體系，生理小種和生化型并不能有效地反映出病原菌在進化及地理起源上的變異［31］。因此，還需更有效的分類系統來詳細地評價青枯菌復合種的遺傳多樣性。

Fegan等提出了一個新的劃分體系，將青枯菌依次劃分為4個分類水平:種、演化型、序列變種和克隆，并分別建立了與之相對應的鑒定方法。演化型的劃分與地理起源緊密相關，即演化型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ［9］。其中，演化型Ⅰ菌株起源于亞洲;演化型Ⅱ菌株起源于美洲，但也在一些亞洲國家如中國、印度等發現該型青枯菌的存在;演化型Ⅲ菌株起源于非洲及其附近島嶼;演化型Ⅳ菌株起源于印度尼西亞，但在日本、澳大利亞、菲律賓等國家也報道了該型菌株的分布。利用青枯菌種特異性引物759/760，結合演化型特異性引物Nmult:21:1F、Nmult:21:2F、Nmult:23:AF、Nmult:22:InF 和 Nmult:22:RR(引物序列見表1)能夠在同一PCR反應中同時鑒別出種和演化型，稱之為演化型復合PCR(Pmx-PCR)。通過演化型復合PCR擴增產物的片段大小能夠確定演化型的分類歸屬。演化型Ⅰ產生280和144 bp的條帶;演化型Ⅱ產生280和372 bp的條帶;演化型Ⅲ產生280和91 bp的條帶;演化型Ⅳ產生280和213 bp的條帶。

青枯菌每一個演化型通過內切葡聚糖酶(egl)基因部分序列和基因組指紋圖譜法(rep-PCR)又可進一步劃分為序列變種和克?。?，31，46］，目前青枯菌已經劃分出 53 個序列變種(圖1)。隨著對青枯菌研究的不斷深入，可能會有新的序列變種出現。除了演化型和序列變種外，多位點序列分型(MLSA)也已被用于青枯菌種內遺傳多樣性的研究［46－50］，Almeida等建立了青枯菌、丁香假單胞桿菌和黃單胞桿菌的MLSA/MLST 的數據庫［51］。

4 我國植物青枯菌遺傳多樣性

植物青枯病菌具有豐富的種內遺傳多樣性，不同地理起源的青枯菌在與寄主協同進化過程中表現出明顯的生理分化和高度的變異性。

對危害我國的植物青枯菌研究結果表明，分布在我國的青枯菌有生理小種1、3和4號，生化型2、3、4和5(表2)。根據Fegan等［9］提出的青枯菌分類系統，可將我國青枯菌分為演化型Ⅰ和Ⅱ，其中演化型Ⅰ包括10個序列變種，演化型Ⅱ包括2 個序列變種［11，31，41，50，52－53］，到目前為止在我國尚未發現演化型Ⅲ和Ⅳ型菌株。

寄生于我國大多數植物上的青枯菌屬于演化型Ⅰ，只有來自于馬鈴薯上的部分菌株以及1個分離自茄子和2個分離自木麻黃上的菌株屬于演化型Ⅱ［29］。另外，分離自臺灣番茄上的1株青枯菌也屬于演化型Ⅱ。采用BOX-PCR指紋圖譜分析法對來源于我國的15個省、14種寄主上的319個青枯菌菌株進行多樣性分析，在相似系數為75%時將其分為29 個不同的類群［53］。

4．1 我國煙草青枯菌多樣性 我國煙草青枯菌屬于生理小種1號，生化型3或4，演化型Ⅰ以及4個序列變種(15、17、34和 44)［2，21－27，31，54］。其中煙草青枯菌生化型 3 分布于所有 14個產煙區，而生化型4僅分布于福建和廣西煙區。潘哲超等對福建、廣東、廣西和貴州煙區煙草青枯病序列變種進行鑒定，序列變種15和44分布于廣西和福建，序列變種17分布在廣東、廣西、福建和貴州，序列變種34僅存在于福建［31，54］。周訓軍等采用MLSA研究方法對我國11個主要產煙區的93株煙草青枯菌進行種內遺傳多樣性分析，93個菌株被分為51個序列型(ST)，并運用eBURST-V3軟件共享5/7基因標準將所有供試菌株分為4個亞群和4個單一群［49］。上述結果揭示了雖然我國煙草青枯菌地理分布廣泛，具有豐富的種內遺傳多樣性，但煙草青枯菌的組群劃分與菌株的地理區域和煙草品種無明顯相關性。

表1 用于多重PCR、egl基因和mutS基因擴增的引物序列

4．2 我國馬鈴薯青枯菌多樣性 我國馬鈴薯青枯菌菌株屬于2個生理小種(小種1和小種3)，3個生化型(2、3和4)和2個演化型(Ⅰ和Ⅱ)。其中生理小種3(生化型2和演化型Ⅱ)是優勢小種，在10個省(區)均有分布;生理小種1(生化型3或4，演化型Ⅰ)只在山東、湖南、湖北和四川有發現［31］。我國馬鈴薯青枯菌演化型Ⅰ和演化型Ⅱ還可以進一步分為不同的序列變種，其中演化型Ⅰ包括序列變種13、17和18，而演化型Ⅱ包括序列變種 1［29，31，50，52，55］。

目前在我國尚未發現演化型Ⅳ侵染馬鈴薯，但是在菲律賓、日本、印度、澳大利亞等亞洲國家已報道引起馬鈴薯青枯病的青枯菌屬于演化型Ⅳ［56－57］，而且該型菌株對馬鈴薯具有很強的致病力，可能會成為我國馬鈴薯生產上的潛在威脅，因此，我國需要通過加強海關檢疫等來防止演化型Ⅳ青枯菌侵入我國馬鈴薯產區。

5 植物青枯病防治

由于青枯菌具有廣泛的寄主、獨特的致病機理以及極強的變異能力，青枯病的防治一直是植物病害防治的難題。盡管各國學者一直在從事相關方面的研究，并且在各領域中的研究結果對青枯病的防治取得一定成效，但是仍有很多問題需要解決。人們難以用1種方法從根本上解決青枯病的防治問題，只能多種防治方法相結合，盡量減輕青枯病的危害。

表2 我國青枯菌菌株復合群的演化型、序列變種、寄主、地理來源、生理小種和生化型

5．1 農業防治 實行合理輪作、高壟栽培，及時清理田間雜草和病株;選育、推廣抗青枯病的品種［18，33］以及抗病砧木嫁接［58］是防治茄科植物青枯病最理想的方法，抗病品種的選育和利用要根據病菌的致病型因地制宜，做好抗病品種的合理布局，避免品種單一化。然而由于林木發達的維管系統以及多年生特征，上述方法對林木青枯病的防治是行不通的或難以實現的［34］。

5．2 化學防治 盡管化學防治有誘導抗性、無選擇滅殺天敵、環境污染等諸多缺點，但在植物病害的實際防治中還是起著重要作用。目前，我國對于青枯病的防治主要依靠化學藥劑?；瘜W藥劑防治主要圍繞農作物展開，農用硫酸鏈霉素［59］、青枯靈、青萎散［60－61］、康地蕾得［62］等在煙草、番茄等農作物青枯病的防治中都有一定效果，但在林木青枯病防治中應用較少。對林地土壤進行消毒是林木青枯病防治中比較實用有效、容易操作的處理措施，多數是對拔除病株的根坑部土壤進行消毒，能有效防止青枯病的蔓延與擴散，20%石灰水、石灰粉、福爾馬林溶液、高錳酸鉀等都可用于土壤消毒，其中石灰水和石灰粉是實際生產中較常用的藥劑［15］。

5．3 生物防治 青枯病的生物防治是對環境友好的防治方法，越來越引起國內外學者的重視。目前，對青枯病有良好防效的微生物主要有無致病力青枯菌、假單胞菌、芽孢桿菌、益生真菌等。董春等研究表明，自發突變的無致病力番茄青枯菌株Tm3對番茄青枯菌Tm46具有較強的抑菌作用，且能誘導煙草產生過敏性反應［63］;王羽等從番茄青枯病苗中分離出198株無致病力青枯菌，其中2株在溫室防治試驗中對番茄青枯病起到較好的防治效果，20 d后防效分別為43%和47%［64］;彭細橋等從煙株中分離了32株拮抗細菌，其中3個菌株對青枯菌具有強的拮抗作用且有較好的內生性和定殖力，經鑒定1株為枯草芽孢桿菌，2株為短芽孢桿菌［65］;朱紅惠等發現叢枝菌根真菌(AM)對番茄青枯菌有抑制作用［66］;弓明欽等研究發現在有AM菌存在的情況下，桉樹幼苗不發青枯病或發病較輕［67］。

6 結語

青枯菌在世界范圍內分布廣泛，引起多種植物青枯病，在現有研究成果的基礎上，還需要繼續對其研究，為青枯病檢測和防治尋找最佳著力點。從我國青枯病的發生情況來看，盡管青枯病主要在長江以南地區發生普遍，但隨著氣候條件的變化以及南北地區貿易的日益緊密，青枯病的發生已有由南向北擴展的趨勢，因此需要采取有效措施防止青枯病繼續擴展危害。對于青枯病的防治，無論采取哪一種單一的防治方法都很難奏效，只有將抗病品種利用、各項農業措施、化學藥劑以及生物防治等防治方法相結合，才能將青枯病的危害降低到最低限度。

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