酸性亞硫酸鹽預處理對棉桿糖化效率的影響

朱文遠， 姜 波， 寇佳文， 金永燦

（南京林業大學 江蘇省制漿造紙科學與技術重點實驗室，江蘇 南京 210037）

酸性亞硫酸鹽預處理對棉桿糖化效率的影響

朱文遠， 姜 波， 寇佳文， 金永燦

（南京林業大學 江蘇省制漿造紙科學與技術重點實驗室，江蘇 南京 210037）

采用酸性亞硫酸鹽法預處理棉桿進行生物質轉化，研究了硫酸用量、亞硫酸氫鈉用量、預處理溫度和保溫時間等對棉桿底物酶水解效率和棉桿組分溶出的影響，并研究了棉桿酶水解過程中添加木素磺酸鹽對棉桿底物酶水解效率的影響。結果表明，硫酸用量的增加可以明顯提高半纖維素的降解溶出，亞硫酸氫鈉用量的提高可以增加木素的磺化溶出，一定的預處理溫度和保溫時間是必要的，但過高的預處理溫度和過長的保溫時間對棉桿酶解效率沒有益處。綜合考慮，酸性亞硫酸鹽預處理棉桿的最佳條件為：硫酸用量2.2%，亞硫酸氫鈉用量8.0%，預處理溫度170℃，保溫時間40 min。纖維素酶用量為15 FPU/g（絕干底物）時，棉桿底物酶水解糖化率為83.9%。只添加商品木素磺酸鹽，添加量為3.0%（對絕干底物），棉桿底物纖維酶水解轉化率達到93.4%，基本達到工業生產的標準；黑液可以取代部分商品木素磺酸鹽，但全部取代，效果略差。

亞硫酸鹽；棉桿；酶解；木素磺酸鹽；預處理

隨著全球經濟的快速發展，人們對能源的需求量越來越多。石化燃料作為不可再生能源，終究會枯竭。因此，各國研究者都對可再生的的生物質能源進行了大量的研究。木質纖維原料主要成分是纖維素、半纖維素和木素，木素將纖維素和半纖維素包裹起來，半纖維素填充其間。纖維素和半纖維素通過化學降解或者酶解為單糖，進一步發酵轉化成生物酒精等。因此，進行木質纖維素進行生物質轉化之前，需要通過預處理盡量將纖維素暴露出來，以便酶和微生物能夠接觸到纖維素進行生物質轉化。中國是農業大國，木材資源匱乏，而農業廢棄物豐富，每年秸稈產量約6.5億噸[1]。棉花作為我國極為重要的農業經濟作物，分布非常廣闊。經過長期的不斷演化和發展，我國棉田正逐步向黃河流域、長江流域和新疆三大產棉區集中[2]。棉桿作為棉花的主要剩余物，每年產量超過2 500萬噸[3]。棉桿長期用作燃料或者堆放腐爛掉，既造成了環境污染也是資源浪費。棉桿皮含雜質較多，制成紙漿存在白度低、塵埃度高等缺點，難以成為高檔紙漿。棉桿用作生物質資源轉化，既是對環境保護的貢獻，也不與傳統造紙等形成資源競爭。

目前，針對棉桿預處理的研究不多。Silverstein等[4]研究燒堿法、稀酸與臭氧預處理棉桿，其中臭氧法預處理后的纖維水解轉化效率達到49.8%；另外，Jian Shi[5]采用微生物預處理法，Ayse Eren Pütün[6]采用快速裂解法，鄧輝等[7]對比了燒堿法與稀酸法，這些方法預處理后的底物酶水解轉化效率均不高。齊臨冬等[8]采用酸性亞硫酸鹽預處理棉桿，研究了pH值、預處理溫度、化學藥品用量等對棉桿酶水解效率的影響，結果表明當體系pH值在2.65、預處理溫度180℃、保溫20 min時底物酶水解轉化效率最高為70.1%。這明顯比前面幾種方法的纖維素酶水解轉化效率高，但仍有約30%的底物纖維素不能酶解轉化。酸性亞硫酸氫鹽溶液中含有H+、HSO3-和SO32-等，磺酸根離子可以進攻木素使其磺化溶出，酸性環境下半纖維素可以降解成單糖溶于廢液中，從而使纖維素盡可能多的暴露出來。因此，酸性亞硫酸鹽作為木質纖維生物質轉化的預處理方法，不僅能夠具有較高的酶解轉化效率，而且具有降低磨漿能耗等優點。本研究采用酸性亞硫酸鹽法預處理棉桿，繼續優化條件，并充分利用預處理廢液中溶出的磺化木素在底物酶水解過程中作為催化劑提高底物纖維素酶水解轉化效率。

1 實驗

1.1實驗材料

棉桿取自山東臨沂，風干后的棉桿切斷成長20～40 mm，厚度2～6 mm，收集密封于封口袋內平衡水分。分析得出，水分8.3%，葡聚糖（纖維素）35.87%，聚戊糖（半纖維素）15.49%，木素26.30%。

實驗用纖維素酶是novozymes Cellic CTec2，為復合纖維素酶，濾紙酶活為250 FPU/mL，由諾維信公司提供。

其他，如硫酸、亞硫酸氫鈉、無水乙酸鈉、冰醋酸等均為分析純，購自南京大光明化學品有限公司；木素磺酸鹽為工業級。

1.2儀器和方法

1.2.1 水分測定

參見文獻[9]。

1.2.2 化學組分分析（酸水解法）

稱取0.3 g（絕干）試樣，放于25 mL小燒杯中，加入3 mL的72%濃硫酸，置于常溫下使其充分潤脹，其間不停地用玻璃棒攪拌；2.5 h后補加84 mL的蒸餾水，調節酸濃度至4%，攪拌均勻后將處理后的試樣全部轉移到封口藍蓋瓶中，將藍蓋瓶置于滅菌鍋中，在121℃的條件下水解1 h；水解完成后，用G3砂芯漏斗抽吸過濾，將G3砂芯漏斗和其上面留著的固體一同放入烘箱在105℃烘4 h，計算木素含量；分離得到的液體，通過用帶有0.22 μm孔徑聚四氟乙烯微孔濾膜的注射過濾器進行真空抽濾，用移液槍移取1 mL于2 mL的塑料封口試管，同時加入40 μL 50% NaOH溶液搖勻，調節pH值；冷藏試樣，準備送HPLC測成分得出葡聚糖和聚戊糖的含量。

1.2.3 預處理過程

實驗設備為旋轉式油浴加熱蒸煮器，選用1.25 L的不銹鋼蒸煮罐8個，每罐取棉桿片100 g（絕干量），根據實驗條件加入配好的化學藥品液體，并補加夠量的水，擰緊后置于油浴蒸煮器加熱和保溫；蒸煮后的混合物，用200目漿袋過濾分離蒸煮廢液，固體棉桿調節到10%濃度，均勻連續的加入盤磨磨漿機，盤磨間隙為0.4 mm；磨漿后的漿料用200目漿袋洗滌兩次，手動擰干撕碎置于塑料密封袋中，準備測量水分和實驗用；另外，將盤磨齒盤上的殘留棉桿也取出，測量水分后，與磨后漿加一起計算化學預處理得率。

1.2.4 底物酶水解過程

棉桿底物酶水解的條件是：漿料濃度為2g/100 mL，50 mL乙酸/乙酸鈉緩沖溶液，纖維素酶15.0 FPU/g（對絕干底物）；體系pH為4.8，水解在恒溫培養振蕩器內進行，水解溫度保持在50℃，轉速定為180 r/min。酶解72 h時取樣，每次取2 mL，用G3過濾漏斗抽吸過濾，將分離得到的液樣溶液，用移液槍移取5 mL至注射器內，然后通過帶有0.22 μm孔徑的聚四氟乙烯微孔膜的注射過濾，抽取0.2 mL的上層清液加0.8 mL的去離子水混合，將溶液稀釋5倍，轉移進入進樣瓶。放入冰箱，準備送HPLC測量糖含量。

2 結果與討論

棉桿結構接近木材，但是一年生植物，因此其結構和化學組分介于木材和禾本科之間。酸性亞硫酸鹽中酸可以提供酸性環境，降解溶出半纖維素；而磺酸根離子攻擊木素使其成為磺化木素而溶出。因此，經過酸性亞硫酸鹽預處理后的棉桿底物纖維素盡可能的暴露易于接觸到纖維素酶，從而提高底物酶水解轉化效率。實驗也研究了不同化學藥品用量、預處理溫度和保溫時間對底物纖維素酶水解效率的影響；另外，磺化木素具有親水性基團（磺酸根）和疏水性基團（苯環結構），具有表面活性劑的性質，實驗也研究了酶解過程中添加商品木素磺酸鹽和預處理廢液（含有預處理過程中溶出的木素磺酸鹽）。

2.1硫酸用量對棉桿酶水解糖化效率的影響

酸性亞硫酸鹽預處理木質纖維原料過程中，硫酸濃度可以調節體系pH值，在一定的溫度和保溫時間下，木質纖維原料半纖維素降解為單糖溶于預處理廢液；當然，這個過程中不可避免的也有纖維素的降解溶出和木素的縮合反應，以及溶出的單糖進一步產生糠醛和羥甲基糠醛，糠醛和羥甲基糠醛對后續發酵產生抑制作用。因此，選擇合適的硫酸用量對優化酸性亞硫酸鹽預處理棉桿很重要。實驗固定了固液比為1∶4，預處理溫度150℃，升溫時間30 min，保溫40 min，亞硫酸氫鈉用量6.0%（對絕干原料，下同）。硫酸用量從0到4.4%（對絕干原料，下同），結果如圖1和圖2所示。

圖1 硫酸用量對棉桿酶解轉化效率影響

圖2 硫酸用量對棉桿組分溶出的影響

從圖1可以看出，無論是低亞硫酸氫鈉用量還是高的亞硫酸氫鈉用量，硫酸用量對棉桿酶解轉化效率影響明顯。隨著硫酸用量的增加，棉桿底物纖維的酶水解轉化效率提高明顯，但較高亞硫酸氫鈉用量時（6.0%）增速沒有低亞硫酸氫鈉用量（3.0%）快。這可能是二者的相互作用的原因，亞硫酸氫鈉的加入，一方面可以增加棉桿木素的溶出，但另一方面亞硫酸氫鈉的分解，也消耗了部分硫酸，導致體系pH值略有上升，從而影響了半纖維素（聚木糖）的降解。增加硫酸用量，降低了預處理體系的pH值，從而影響了棉桿組分（半纖維素、木素）的溶出，結果如圖2所示。圖2表明，酸性亞硫酸鹽預處理棉桿過程中，隨著硫酸用量的增加，半纖維素（聚木糖）溶出明顯，但超過2.2%以后，上升幅度變緩。這說明當半纖維素降解到一定程度以后，進一步提高半纖維素的溶出就比較困難了。這個結果與文獻關于酸性亞硫酸鹽預處理木材原料相差較大[10-12]，這可能也是目前棉桿原料酶解效率無法進一步提高的原因。硫酸用量對木素的溶出先增加后減少，硫酸用量在1.1%的時候木素溶出最高為41.4%（對原料，下同）。在酸性亞硫酸鹽處理棉桿過程中，和等攻擊木素使其磺化降解溶出，但酸性條件卻導致木素縮合，pH越低，縮合越嚴重，結果造成木素隨著硫酸用量的增加反有下降趨勢。綜合考慮，硫酸用量在1.1%～2.2%較佳。

2.2亞硫酸氫鈉用量對棉桿酶水解糖化效率的影響

預處理的目的是脫出部分半纖維素和木素，盡量提高酶和微生物與纖維素接觸的機率。亞硫酸氫鈉可以為體系提供HSO3-和SO32-等離子，這些離子可以進攻木素基團使其磺化降解。因此，亞硫酸鹽與硫酸協同作用降解溶出木素和半纖維素，提高纖維素暴露的面積。實驗過程中，選擇固定了硫酸用量為2.2%，液比4，預處理溫度170℃，升溫40 min，保溫40 min，亞硫酸氫鈉用量0%～8.0%。亞硫酸氫鈉用量對棉桿底物纖維酶水解效率的影響如圖3所示，對棉桿組分溶出影響如圖4所示。

從圖3可以看出，隨著亞硫酸氫鈉用量的增加，棉桿底物纖維酶水解效率一直提高，超過6.0%以后增加趨勢減緩。當硫酸用量2.2%時，亞硫酸氫鈉用量8.0%時，棉桿底物最高酶解轉換率最高83.9%。雖然本實驗沒有進一步提高亞硫酸氫鈉用量，但參考齊臨冬等[8]研究結果可知，亞硫酸氫鈉用量提高到8.0%以后，對酶解效率增加效果不明顯。亞硫酸氫鈉對棉桿組分溶出如圖4所示。圖4結果表明，亞硫酸氫鈉對聚戊糖的溶解先增加后降低，這可能是因為適當增加亞硫酸氫鈉，提高了木素的溶出，暴露出半纖維素，從而提高了半纖維素的降解，但隨著亞硫酸氫鈉用量的增加，消耗了更多的硫酸，導致體系pH提高，從而減弱了半纖維素的降解；木素的溶出隨著亞硫酸氫鈉用量的增加而增加，超過6.0%以后木素溶出減緩。參考齊臨冬等研究結果，亞硫酸氫鈉用量增加到8.0%以后不必再提高用量。

圖3 亞硫酸氫鈉用量對棉桿酶解轉化效率影響

圖4 亞硫酸氫鈉用量對棉桿組分溶出的影響

2.3預處理時間和溫度對棉桿酶水解糖化效率的影響

預處理過程中，化學藥品要在一定的溫度下經過一定反應時間對木質纖維原料組分才起作用。實驗研究了不同溫度隨著預處理時間的延長，對棉桿底物纖維素酶水解效率和棉桿組分溶出的影響，固定的預處理條件為：液比4∶1，硫酸用量2.2%，亞硫酸氫鈉用量8.0%，結果如圖5所示。

從圖5可以看出，預處理溫度和保溫時間對棉桿纖維酶水解轉化效率均有明顯影響。預處理溫度越高，棉桿底物纖維酶水解率越高；預處理溫度一定時，保溫時間延長可以提高底物纖維酶水解轉化率。預處理溫度超過170℃后，溫度的增加對提高棉桿底物纖維素酶解率影響不大；而預處理溫度越高，預處理過程中降解的單糖在酸性條件下會被衍生化為糠醛和羥甲基糠醛等抑制劑，這些對后續的發酵形成抑制作用。因此，在保證棉桿底物酶水解效率的同時，盡量降低預處理溫度。實驗選擇的最佳預處理溫度為170℃。保溫時間的延長，可以提供化學藥品與半纖維素和木素的充分反應。由圖5發現，預處理溫度170℃和180℃在保溫40 min時，其底物纖維素酶解轉化率基本相同，再延長時間，170℃反而效果更好。這可能是因為較高的預處理溫度隨著保溫時間的延長，縮合的木素重新沉淀在底物表面阻礙了酶與纖維的接觸造成的。

圖5 預處理溫度/時間對棉桿酶水解效率的影響

圖6 預處理溫度/時間對棉桿組分溶出的影響

進一步研究預處理溫度和保溫時間對棉桿組分溶出，結果如圖6所示。虛線表示的是不同溫度木素隨保溫時間延長的溶出趨勢，實線表示的是聚戊糖（半纖維素）隨保溫時間延長的降解趨勢。從圖6可以看出，木素和半纖維素的降解溶出均隨著預處理溫度和保溫時間增加而提高；較高的預處理溫度（超過170℃），保溫超過40 min后，提高均不明顯。這也與前面的酶解效率變化規律一致，說明確實是組分溶出受到限制導致很難進一步提高棉桿的酶水解轉化效率。

2.4添加木素磺酸鹽對棉桿酶水解糖化效率的影響

木素磺酸鹽具有親水性基團和疏水性基團，具有表面活性劑性質，親水性基團易于吸附酶，而疏水端易于沉淀到棉桿底物上。前期探索實驗發現在酶水解過程中添加一定量的木素磺酸鹽可以提高棉桿纖維素酶水解轉化效率。實驗選擇使用商品木素磺酸鹽和預處理溶出廢液。預處理過程中，一次絕干原料100 g，預處理條件：硫酸用量2.2%，亞硫酸氫鈉用量6.0%，溫度170℃，保溫時間40 min，液比4∶1，理論黑液400 mL。磨漿后的得率58%，絕干固體底物58 g，溶出木素按照35%的溶出率計算，黑液木素濃度為100×35%×29.8%/1 000 g/mL＝0.026 g/mL。酶解過程中，用理論木素黑液濃度的量取代最佳條件木素磺酸鹽量，黑液以補加水的形式加入。結果如表1所示。

表1 木素磺酸鹽對棉桿酶水解糖化效率影響

（續表1）

從表1可以看，在棉桿底物酶解過程中添加木素磺酸鹽可以明顯改善棉桿底物纖維素酶解轉化效率。1#～5#添加的是商品木素磺酸鹽，隨著木素磺酸鹽用量的增加，棉桿底物纖維素酶解效率先增加后減小，用量3.0%（對絕干棉桿底物）為最佳用量，此時的棉桿底物纖維素酶解效率為93.4%，基本達到可以工業化的指標。分析原因，可能是適量的木素磺酸鹽由于其表面活性劑的性質增加了酶與底物纖維接觸的效率，或者木素磺酸鹽具有一定的催化作用；過量的木素磺酸鹽可能吸附在棉桿底物表面，堵塞了其表面開孔通道，反而阻礙了酶與纖維素接觸。6#是按照計算的相當于3#木素磺酸鹽用量（最佳用量）的黑液體積，7#是用黑液取代了部分商品木素磺酸鹽。由表1可以看出，添加蒸煮黑液也可以提高棉桿底物纖維素酶水解效率，但效果沒有商品木素磺酸鹽效果好；部分取代效果好于全部取代，但低于全部商品木素磺酸鹽。這可能是因為黑液含有抑制酶作用的抑制劑，或者是預處理過程中產生的木素磺酸鹽的磺化度沒有商品木素磺酸鹽的磺化度高?？偟膩碚f，添加木素磺酸鹽以及用黑液部分取代商品木素磺酸鹽可以提高棉桿底物纖維素酶水解效率。

3 結論

酸性亞硫酸鹽預處理棉桿可以有效提高棉桿纖維酶水解糖化效率，硫酸用量、亞硫酸氫鈉用量、預處理溫度和保溫時間，以及酶解過程中添加木素磺酸鹽，均可影響棉桿酶水解效率。具體結論如下：

1）硫酸用量的增加可以降低體系pH值，增加半纖維素的降解溶出，可以適當提高木素溶出，從而提高棉桿底物酶水解效率；亞硫酸氫鈉用量增加可以明顯提高棉桿木素的溶出，對半纖維素的降解不明顯，可以明顯改善棉桿底物纖維素酶解效率；一定的溫度和保溫時間是保證預處理反應的必要條件，但溫度和時間也不宜過高和過長，否則不但不能提高酶解轉化效率，反而產生較多的抑制劑。綜合考慮，酸性亞硫酸鹽預處理棉桿的最佳條件為：硫酸用量2.2%，亞硫酸氫鈉用量8.0%，預處理溫度170℃，保溫時間40 min。纖維素酶用量為15 FPU/g（絕干底物）時，棉桿底物酶水解糖化率為83.9%。

2）添加木素磺酸鹽可以提高棉桿底物纖維素酶水解效率，用黑液取代部分商品木素磺酸鹽也可以。只添加商品木素磺酸鹽，添加量為3.0%（對絕干底物），棉桿底物纖維酶水解轉化率達到93.4%，基本達到工業生產的標準；黑液可以取代部分商品木素磺酸鹽，但全部取代的話，效果略差。

總的來說，酸性亞硫酸鹽預處理棉桿效果優于其他方法，而且預處理過程中產生的木素磺酸鹽可以在后續的酶解糖化過程中加以利用。亞硫酸鹽制漿技術成熟，可以利用現有技術和設備進行改進，容易實現工業化。

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Effects of Bisulfite Pretreatment
on Enzymatic Saccharification of Cotton Stalk

ZHU Wen-yuan, JIANG Bo, KOU Jia-wen, JIN Yong-can

（Jiangsu Key Laboratory of Pulp and Paper Science and Technology, Nanjing Fotestry University, Nanjing 210037, China）

Bisulfite pretreatment (SPORL) on bioconversion of cotton stalk was investigated. The dosages of H2SO4and NaHSO3, pretreatment temperature, and duration time were the main factors of bisulfite pretreatment on enzymatic saccharification of cotton stalk and compositions’ dissolution from cotton stalk. The effects of adding lignosulfonate during enzymatic hydrolysis of cotton stalk were also studied in this study. Hemicelluloses’degradation was significantly improved by increasing the dosage of sulfuric acid, and lignin dissolution was improved by increasing the amount of sodium bisulfite. The suitable pretreatment temperature and duration time was necessary. Considering all factors, the optical pretreatment conditions were as follows: sulfuric acid dosage of 2.2%, sodium bisulfite charge of 8.0%, pretreatment temperature of 170℃, and duration time of 40 min. The highest cellulose conversion of 83.9% from cotton stalk substrate pretreated by the above optical conditions by adding enzyme dosage of 15 FPU/g (on o.d. substrate). It was also found that the cellulose enzymatic hydrolysis yield of 93.4% was obtained by adding market lignosulfonate of 3.0%, and the waste liquor from pretreatment could take part of market ligosulfonate.

bisulfite; cotton stalk; enzymatic hydrolysis; lignosulfonate; pretreatment

TQ353.42

A

1004-8405(2015)04-0023-07

10.16561/j.cnki.xws.2015.04.07

2015-08-20

國家自然科學（青年）基金（31200454）；南京林業大學2013年大學生實踐創新訓練計劃項目。

朱文遠（1978～），男，博士，講師；研究方向：農業廢棄物生物質精煉及造紙濕部脫水機理及器材等研究。ppzhuwy12@126.com