桉樹葉片雙向電泳體系的建立及優化

陳慧潔，郭朦朦，馮麗貞，2，林燕萍，許 諾，鄒霖湘

(1.福建農林大學林學院;2.福建農林大學森林保護研究所，福建福州350002)

桉樹是桃金娘科(Mytaceae)桉樹屬(Eucalyptus)、杯果木屬 (Angophora)和傘房屬(Corymbia)植物的統稱[1]，具有許多優良的生物學特性，環境適應性強，生長速度快，病蟲害少，木材用途廣，是世界上著名的經營利用樹種之一，具有重要的經濟價值.近年來隨著經濟和需求的日益增長，桉樹人工引種和造林面積迅速擴大，桉樹種類的局限性、林木遺傳組成的單一化及粗放式的栽培和經營管理導致桉樹病害頻發，發生面積也不斷擴大.桉樹焦枯病主要為害桉樹苗木以及4 a以下的幼林和萌芽林，是桉樹苗木生產極具毀滅性的病害之一[2-3].熱帶和亞熱帶地區的桉樹密集種植區是該病害的高發區，病害一旦爆發可導致桉樹林大面積枯萎死亡.

從蛋白質領域入手研究病原菌脅迫下植物的抗病防御機制是目前最為有效的研究方法之一.在病原菌脅迫下，植物啟動抗病防御機制是一個復雜的動態過程，而蛋白質作為基因功能的執行者具明顯的動態性，可直觀地掌握這一復雜動態互作過程[4-5]，有助于更全面系統地認識病原菌脅迫下植物的抗病特點及細胞代謝的多個生物學過程[6-7].本研究對桉樹葉片蛋白制備、裂解液成分、裂解條件及上樣量進行探討，建立一套重復性好、分辨率高且適用于桉樹葉片的雙向電泳技術體系，為后期研究焦枯病菌脅迫下其蛋白質組的變化、深入了解桉樹響應焦枯病機理，以及開展桉樹誘導抗病性研究奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 供試材料

桉樹種系“巨尾桉廣9”(E.grandis×E.urophylla guang 9)由福建永林集團種苗中心提供.將苗高20 cm桉樹組培苗種植在福建農林大學科技園內.取頂葉下完全展開的成熟度一致的功能葉片，迅速放入液氮中，并保存在-80℃備用.

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑包括 2-Me、Acr、AP、Bis、BSA、CHAPS、DTT、甘油、甘氨酸、硫脲、尿素 SDS、TEMED、Tris、溴酚藍等(上海生工提供);IAA、瓊脂糖由Amresco公司提供;G-250、Tris飽和酚由Solarbio公司提供;IPG buffer、IPG膠條由GE公司提供;低分子量蛋白由Takara公司提供;TCA、硝酸銀、冰醋酸、丙酮等均為國產分析純試劑.

主要儀器有等電聚焦儀、垂直電泳槽(SE600和Ettan DALTⅡ)、凝腔掃描儀、圖像分析軟件(Image Master 2D Platinum 7.0)，均由GE 公司提供.

1.3 樣品制備

1.3.1 桉樹葉片總蛋白的提取 分別采用TCA/丙酮沉淀法[8]、苯酚抽提法[9]、TCA/丙酮沉淀/苯酚抽提法[10]提取桉樹葉片總蛋白.

1.3.2 蛋白裂解 裂解緩沖液Ⅰ包括 7 mol·L-1尿素、2 mol·L-1硫脲、0.04 g·mL-1CHAPS、60 mmol·L-1DTT、0.5%(體積分數)IPG Buffer.裂解緩沖液Ⅱ包括 9 mol·L-1尿素、0.04 g·mL-1CHAPS、60 mmol·L-1DTT、0.5%(體積分數)IPG Buffer.同時蛋白重溶解條件設置為:(1)將蛋白溶液置于超聲波清洗器中室溫超聲處理，每超聲處理1.5 min，即振蕩蛋白溶解液30 s，重復10次，控制超聲波清洗器中水的溫度在35℃以下;(2)30℃恒溫水浴中重溶解蛋白1 h，不斷振蕩.

1.3.3 蛋白定量 采用Bradford法進行蛋白定量.

1.4 雙向電泳

預試驗結果表明，采用18 cm、pH 4-7的IPG線性膠條進行雙向電泳，蛋白分離效果好.

1.4.1 樣品上樣及等電聚焦 在蛋白定量的基礎上，每根膠條通過300、150、100、50 μg的上樣量梯度來確定樣品2-DE的最佳上樣量.20℃室溫下，將膠條置于泡漲盤中被動水化18 h后，轉移至聚焦盤進行等電聚焦.等電聚焦參數見表1.

1.4.2 膠條的平衡 從-20℃冰箱中取出平衡液Ⅰ、Ⅱ，在室溫下

解凍，然后向其中加入1%(質量分數)DTT和2.5%(質量分數)IAA.等電聚焦結束后，取出IPG膠條，先后在平衡液Ⅰ、Ⅱ中各平衡15 min.

1.4.3 SDS-PAGE 將IPG膠條轉至事先灌好的10%(質量分數)分離膠上，并按如下參數進行電泳:恒流10 mA下運行1 h，恒流30 mA電泳至溴酚藍指示線距膠底部1-2 cm.

1.4.4 凝膠染色 采用銀染法對凝膠進行染色[11].

1.4.5 圖像掃描與分析 染色后的凝膠用掃描儀按要求進行掃描，采用Image Master 2D Platinum 7.0軟件進行分析.

表1 等電聚焦參數Table 1 Parameters of isoelectro focusing

2 結果與分析

2.1 提取方法對蛋白分離效果的影響

通過比較圖1中a、c抽提法得到的電泳結果可看出，采用這2種方法得到的條帶總體清晰度較一致，但a電泳圖譜上分子質量為70 ku以上的條帶模糊，分子質量為40 ku以下的背景較深，條帶直接分離效果不佳.圖1中b抽提法得到的電泳條帶總體分布情況與c的較一致，但其圖譜背景較深，條帶總數及清晰度都不如c抽提法.圖1中c抽提法得到的圖譜背景最淺，分辨率最高，蛋白條帶最多，條帶比a、b抽提法的清晰.此外，雖然圖1中c抽提法得到的條帶在50 ku左右存在高豐度蛋白，但并不影響其整體效果.由此可見，TCA/丙酮沉淀/苯酚抽提法較適用于桉葉蛋白的提取.

圖1 蛋白不同提取法對桉樹葉片蛋白SDS-PAGE圖譜的影響Fig.1 Effects of different extraction methods on the SDS-PAGE map of eucalyptus leaves protein

2.2 裂解緩沖液及裂解條件對蛋白分離效果的影響

從圖2可看出，采用裂解液Ⅱ(b)裂解的蛋白凝膠圖譜的背景淺，豐度低的蛋白條帶較模糊，蛋白重溶解的溶解度較低;而采用裂解液Ⅰ(a)裂解的蛋白圖譜整體背景較深，但整體條帶較清晰，蛋白重溶解的溶解度較前者有所提高.因此，裂解液Ⅰ(a)為較優選擇.

通過比較圖3中a和b條件下得到的桉樹葉片蛋白質SDS-PAGE圖譜可知，采用相同裂解緩沖液溶解蛋白時，室溫超聲處理(a)與30℃恒溫水浴處理(b)所得的結果無明顯差異.

2.3 上樣量對蛋白分離效果的影響

上樣量對電泳結果的清晰程度有很大影響，它直接決定了蛋白點的分布和檢測.上樣量太多，則高豐度蛋白會掩蓋周圍的蛋白點，影響等電聚焦，導致凝膠圖譜產生橫縱向條紋、蛋白點拖尾及銀染時點飽和等現象;上樣量太少，則低豐度蛋白點較模糊，甚至無法在凝膠上顯示，嚴重影響蛋白點的檢測和電泳的準確性.從圖4可看出，圖4C的2-DE圖譜背景色深，橫縱條紋多，蛋白分離效果差，高豐度蛋白成片出現，圖譜分辨率低，清晰可辨的蛋白點非常少;圖4D的2-DE圖譜背景色較均勻，分離蛋白點較多，但仍然可見較多的高豐度蛋白交叉、重疊，造成蛋白點橫縱向拖尾及邊緣低豐度蛋白表達受限，尤其是Rubisco高度表達使凝膠堿性端清晰可見的蛋白點減少;圖4E的2-DE圖譜橫紋、拖尾等情況較圖4D有明顯改善，但仍有較多的高豐度蛋白，Rubisco所造成的影響仍存在;圖4F的2-DE圖譜背景色淺，分辨率高，橫縱條紋少，蛋白點之間邊界清晰，分離效果較好.因此，在高豐度Rubisco存在的情況下，為獲得蛋白分離均勻、分辨率高的凝膠圖譜，確定50 μg為最佳上樣量.

圖2 不同裂解液對桉樹葉片蛋白質SDS-PAGE圖譜的影響Fig.2 Effect of lysis buffers on SDS-PAGE map of eucalyptus leaves protein

圖3 不同裂解條件下桉樹葉片蛋白質SDS-PAGE圖譜的影響Fig.3 Effect of different dissolving conditions on SDS-PAGE map of eucalyptus leaves protein

3 討論

3.1 蛋白樣品的制備及裂解

蛋白質樣品制備是雙向電泳技術的關鍵步驟之一.桉樹葉片含有較多的黃酮類、有機酸類、多酚類、油脂等次生代謝產物，容易造成雙向電泳凝膠圖像的拖尾、背景色深等問題[12-13].因此，本研究在進行桉葉液氮研磨時加入適量PVPP以吸附酚類化合物，減弱其對電泳的干擾.本試驗比較了TCA/丙酮沉淀法、苯酚抽提法和TCA/丙酮沉淀/苯酚抽提法提取桉樹葉片蛋白的SDS-PAGE電泳結果，發現采用TCA/丙酮沉淀/苯酚抽提法提取蛋白得到的電泳圖譜背景淺，條帶清晰，數量較多;采用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白的電泳圖譜，70 ku以上的高分子質量蛋白減少，分子質量低于40 ku的背景較深，表明蛋白樣品含較多雜質，且在蛋白重溶解中有部分高分子質量的蛋白損失;苯酚抽提法提取蛋白的電泳圖譜背景色較深，表明蛋白樣品中仍有雜質未得到有效去除[14-18].因此，宜選擇TCA/丙酮沉淀/苯酚抽提法.

TCA/丙酮沉淀/苯酚抽提法是將TCA/丙酮沉淀法與苯酚抽提法有機結合，兼具二者的優點，可有效去除蛋白樣品中的有機物等雜質，從而得到較清晰的凝膠圖譜.但該方法的步驟繁多，易導致蛋白損失.因此蛋白提取過程中應適當減少重復步驟和縮短相應時間.

蛋白重溶解時蛋白樣品的溶解度和離子強度是可否獲得較清晰的凝膠圖譜的關鍵.本研究比較了蛋白樣品在加硫脲和不加硫脲的裂解液中重溶解的電泳結果，發現加硫脲的裂解液所重溶解的蛋白條帶較清晰，溶解度較高.表明裂解液中加入硫脲和尿素，可打開蛋白的三維結構并抑制蛋白聚集，提高蛋白的溶解度，適用于桉葉蛋白的重溶解.在蛋白裂解過程中，需將裂解溫度控制在37℃以內，以防因尿素在37℃時發生降解致使蛋白發生氨基甲?；?，引起蛋白點的等電點改變，在凝膠圖譜上形成成串的點[9，19].

圖4 不同上樣量對桉樹葉片2-DE圖譜的影響Fig.4 Effects of protein-loading amount on 2-DE map of eucalyptus leaves protein

3.2 上樣量的確定

IPG膠條的上樣量是影響2-DE圖譜質量的重要因素之一，它因樣本類型、水化方式、膠條長度及其pH范圍和凝膠的染色方法等的不同而有所差異[20-21].一般情況下，長且窄的pH范圍的膠條需要較高的上樣量.此外，采用考馬斯亮藍染色時其上樣量要比銀染的多.本試驗比較了300、150、100、50 μg 4種不同上樣量的雙向電泳結果，發現在上樣量為50 μg時，得到圖譜的分辨率高，橫縱條紋少，蛋白點之間邊界清晰，分離效果較好;而增加上樣量受高度表達Rubisco的影響，出現蛋白點的橫縱向拖尾及邊緣低豐度蛋白表達受限等問題.因此，上樣量以50 μg為最佳.

綜上所述，桉樹葉片最適雙向電泳體系為:采用 TCA/丙酮沉淀/苯酚抽提法制備蛋白質;以7 mol·L-1尿素、2 mol·L-1硫脲、0.04 g·mL-1CHAPS、60 mmol·L-1DTT、0.5%(體積分數)IPG buffer作為蛋白裂解裂解緩沖液;對于18 cm、pH 4-7的線性膠條，每根膠條的上樣量為50 μg，并采用銀染.

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