響應面法優化真菌蛋白酶嫩化馬肉的工藝

蔣小鋒，任雯雯，達迪拉·買買提，張 文，孔令明

（新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊830052）

響應面法優化真菌蛋白酶嫩化馬肉的工藝

蔣小鋒，任雯雯，達迪拉·買買提，張 文，孔令明*

（新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊830052）

為了改善馬肉（半腱?。┑哪鄱?，以蒸煮損失率、剪切力和感官評分為評價指標，結合滾揉處理，研究了真菌蛋白酶在不同的添加量、處理溫度、處理時間和pH值對馬肉嫩度的影響，并利用響應面優化出了真菌蛋白酶的最佳嫩化條件。結果表明：真菌蛋白酶的添加量對馬肉的嫩度影響極顯著，處理溫度和處理時間影響顯著；最佳的嫩化條件是：真菌蛋白酶添加量20.63U/g，處理溫度53.12℃，處理時間98.88 m in，pH值為6.86。

馬肉；真菌蛋白酶；嫩度

隨著人們生活水平的提高，人們對肉的品質的要求也越來越高，不僅要求肉制品外觀好看，口味鮮美，而且要富有營養。為了改善肉的加工特性和食用品質，通常在肉品加工過程中添加一些蛋白酶類[1]。真菌蛋白酶是來源于微生物的蛋白酶，如枯草芽孢桿菌蛋白酶、米曲霉蛋白酶等，具有較強的蛋白水解作用，最具有代表性的枯草芽孢桿菌中性蛋白酶，它能在中性范圍內將大分子蛋白質迅速水解成肽類和部分游離氨基酸，廣泛的應用于食品工業[2]，近幾年來，由于歐洲國家盛行瘋牛病、口蹄疫等疾病，馬肉在歐美許多國家都大受歡迎，國內市場對馬肉的需求量呈現逐年上升的趨勢，各種馬肉制品深受大家的喜愛[3]。馬肉具有高蛋白、低膽固醇、高不飽和脂肪酸的特點[4]，但是，馬肉肉質較為粗糙，口感不好，嫩度較差，需要對其采取一些措施改善其嫩度，提高其食用品質。SULLIVAN G A等[5]應用芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌蛋白酶和米曲霉蛋白酶對牛肉進行處理，發現所有的蛋白酶均可以增加肌原纖維和膠原蛋白的降解，顯著提高了牛肉的食用品質，ASHIE I N A等[9]研究發現，來自米曲霉的天冬氨酸蛋白酶的最佳pH值為2.6～6.0，說明天冬氨酸蛋白酶不易受外界的環境的影響。YEH C M等[10]發現微生物蛋白酶和植物性蛋白酶相比，對肌原纖維蛋白質的降解能力低，但具有更強的水解膠原蛋白的能力。目前國內對馬肉的研究較少，還未見使用真菌蛋白酶的報道和相關文獻。

肉的食用品質特性中，色澤、持水力及其氣味在蒸煮前后都可以進行測定，給消費者較為持久的感官印象，而多汁性、質地、嫩度、滋味和香味只能在咀嚼過程中獲得，持續的時間較為短暫。其中，肉的嫩度反映了肉的質地，是消費者評價肉質優劣的常用指標[11]；一般評價肉食用品質的方法有客觀評價法和感官評價法。感官評價簡單易行，但誤差大，可靠性差[12]；利用物性儀測量的剪切力值是客觀反映肉嫩度的重要的方式[13]。本實驗結合感官評價和物性儀兩者的優點，以馬肉（半腱?。樵?，通過注射真菌蛋白酶液和滾揉處理，以蒸煮損失、剪切力和感官評定為評價指標，研究了真菌蛋白酶添加量、處理溫度、處理時間和pH值對馬肉嫩度的影響，并利用響應面試驗方法優化了真菌蛋白酶嫩化馬肉的最佳嫩化工藝，為改善馬肉的食用品質提供了一些可靠的實驗數據。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

馬肉：新疆昭蘇縣綠源食品有限責任公司；真菌蛋白酶（10萬U/g）：澳大利亞Enzyme Solutions Pty.有限公司；干酪素（純度99%）：上海酶聯生物科技有限公司；三氯乙酸（分析純）：上海邁瑞爾化學技術有限公司。

1.2 儀器與設備

Testo-205便攜式pH計：德圖儀表（深圳）有限公司；NSE-11063數字顯示溫度計：美國Delta TRAK公司；DZKWS-6電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫療儀器有限公司；TA-XT2i型物性儀：英國Stable Micro System公司；GL-16G-Ⅱ高速冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；Tu-1810型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；GR-20真空滾揉機：諸城市美邦機械有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 真菌蛋白酶活力的確定[14]

采用紫外分光光度法測定，蛋白酶溶液1.0 m L與酪蛋白溶液5.0 m L混合，置（37±0.2）℃水浴中反應10 m in，加三氯乙酸溶液終止反應，用干燥濾紙過濾，濾液在2 h內采用分光光度法以水為空白，在波長275nm處測定吸光度值A；酪蛋白溶液和三氯乙酸溶液順序互換，其他操作相同，測定吸光度值A0；另取酪氨酸對照溶液，以0.1 mol/L鹽酸溶液為空白，在波長275 nm處測定吸光度值An。

式中：W3為對照品溶液中含酪蛋白的量，μg/m L；W為供試樣品的取樣量，mg；11為測定總體積，m L；N為供試樣品的稀釋倍數。

蛋白酶活力定義：在一定溫度和pH值條件下，每分鐘水解酪蛋白生成1 μg酪氨酸所需粗蛋白酶的量為1個酶活力單位（U）。

1.3.2 馬肉嫩化處理的方法

將真菌蛋白酶溶于不同的pH值緩沖溶液中，使用一次性注射器將蛋白酶液注入肉中（注射量∶肉質量=1∶10，空白組注入等量的水），用自封袋包裝好放置于滾揉機中滾揉30 min，取出放置于不同溫度的恒溫水浴鍋中保溫不同時間，最后取出待測，肉塊的大小3 cm×3 cm×4 cm。

1.3.3 真菌蛋白酶最佳嫩化條件的確定

在單因素試驗的基礎上進行響應面優化試驗，采用Design-Expert 8.0.5軟件中的Box-Behnken Design方法設計試驗，對酶添加量、處理溫度、處理時間、pH值4個因素進行探討，以馬肉剪切力（Y1）和感官評分（Y2）作為評價指標，確定真菌蛋白酶的最佳嫩化條件。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Fac tors and levels of response surface design

1.3.4 測定方法

（1）蒸煮損失的測定[15]：稱取50 g左右的馬肉切分成小塊，放于蒸煮袋中，置于90℃水浴鍋中加熱。用數顯式溫度計測量肉的中心溫度，當肉的中心溫度達到75℃時，取出樣品，冷卻至常溫，用濾紙擦干表面水分，然后稱質量。蒸煮損失率按下式計算：

（2）剪切力：取適量大小的肉塊置于蒸煮袋中，盡量將蒸煮袋中的空氣排出，將袋口密封，在80℃恒溫水浴鍋中加熱，當馬肉中心溫度達到70℃時，維持約30 m in，然后冷卻至室溫取樣。沿著肌纖維方向切取1 cm厚、1 cm寬的肉條，然后在TA-XT2i型物性儀上測定其剪切力，重復測量5次并取其平均值。

剪切力測定參數：探頭HDP/BSW；測試模式TPA；測試前速度2.00 mm/s；測試速度2.00 mm/s；測試后速度10.00 mm/s；下壓距離30.00 mm；負載類型Auto-20g；數據獲得率500數據包/s；樣品規格5 cm×1 cm×1 cm。

其他物性測定參數同上。

（3）感官分析：將經過處理的馬肉置于蒸煮鍋中蒸制2 h，自然冷卻至室溫后切塊品嘗，20位品嘗者在評定前進行專業細致的培訓，品嘗實驗在獨立的安靜隔間內進行，對嫩度、咀嚼性、風味、顏色四項分別打分，滿分為100分，取20位品嘗者平均分為馬肉感官評分，評價標準見表2。

表2 馬肉感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standard o f horse meat

1.3.5 數據分析

實驗數據由Design-Expert 8.0.5進行分析，剪切力采用Stable M icro System所帶的Exponent處理分析，其他數據采用Excel軟件進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 不同真菌蛋白酶添加量對馬肉嫩度的影響

在真菌蛋白酶添加量分別為0、5 U/g、10 U/g、15 U/g、20 U/g、25 U/g和30 U/g，處理溫度為55℃，處理時間為80 m in，pH值為6.0的條件下分別測量馬肉的蒸煮損失率、剪切力和感官評價3個評價指標，結果如圖1所示。

圖1 真菌蛋白酶添加量對馬肉蒸煮損失率(a)、剪切力和感官評分(b)的影響Fig.1 Effects of different fungal protease addition on cooking loss(a) and shear force and sensory evaluation(b)of horsemeat

由圖1a可知，與未處理組相比，隨著真菌蛋白酶添加量的逐漸增加，蒸煮損失率呈現先減小后增加的趨勢；當真菌蛋白酶的添加量達到20 U/g時，蒸煮損失率減小最為明顯，隨著添加量的為進一步增大，馬肉的蒸煮損失率明顯增大；原因是低濃度的蛋白酶可以提高肉的持水能力，增加肉的保水性和多汁性；如果蛋白酶液添加量過大，就會導致水解過度，肉的保水性能會發生顯著下降。由圖1b可知，馬肉的剪切力和真菌蛋白酶添加量呈現顯著地相關性，隨著真菌蛋白酶添加量的不斷增加，馬肉的剪切力值呈現顯著下降的趨勢；當真菌蛋白酶的添加量為15 U/g時，馬肉的剪切力值為4.613 kg，已經達到了中等嫩度的水平，此時的馬肉軟硬適中，易于咀嚼，又不失嚼勁，鮮嫩可口，從感官評價中也可以看出，此時的感官評分為84分，說明此時馬肉的嫩度已經很受消費者喜愛，當量增加至20 U/g時，剪切力進一步減小，此時的感官評分最高；當進一步提高真菌蛋白酶的添加量，馬肉的剪切力雖然更小，但此時的感官評分開始顯著下降；原因是由于蛋白酶添加量過大，水解蛋白過度，使肌原蛋白和肌原纖維蛋白過度水解，導致馬肉的外觀和質地很大破壞，同時肉的保水性能也顯著下降，失去了馬肉具有的嚼勁和多汁性，嫩化效果不好。因此，真菌蛋白酶液的添加量為20 U/g最為合適。

2.2 不同處理溫度對馬肉嫩度的影響

在處理溫度分別為35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃，真菌蛋白酶添加量20 U/g，處理時間80 m in，pH值為6.0的條件下分別測定馬肉的蒸煮損失率、剪切力和感官評價3個評價指標，結果如圖2所示。

圖2 處理溫度對馬肉蒸煮損失率(a)、剪切力和感官評分(b)的影響Fig.2 Effects of treatment temperature on cooking loss(a)and shear force and sensory evaluation(b)of horsemeat

由圖2a可知，真菌蛋白酶液的處理溫度對蒸煮損失率的影響也很大，隨著處理溫度的升高，蒸煮損失率會逐漸減小，當處理溫度為55℃時，此時的蒸煮損失率是最小的；當進一步提高處理溫度，蒸煮損失率會變大；原因是真菌蛋白酶的活性受溫度影響很大，當真菌蛋白酶所處環境的溫度在其最適范圍內時，真菌蛋白酶的活性最大，水解能力最強，反之真菌蛋白酶的活性就會下降，水解能力減弱。由圖2b可以看出，隨著處理溫度的升高，剪切力值下降明顯，在55℃時達到最小值；當溫度繼續升高，剪切力值發生明顯升高；原因是此時的處理溫度過高，導致蛋白酶部分失活，水解蛋白能力下降；由感官評分可以看出，剪切力值過高或過低，都會影響消費者的感官評價，當處理溫度為55℃時，感官評分較高，因此處理溫度在55℃是較為合適的處理溫度。

2.3 不同處理時間對馬肉嫩度的影響

在處理時間分別為20 m in、40 m in、60 m in、80 m in、100 min、120 min，真菌蛋白酶添加量為20 U/g，處理溫度55℃，pH值為6.0的條件下，分別測定馬肉的蒸煮損失率、剪切力和感官評價3個評價指標，結果如圖3所示。

圖3 處理時間對馬肉蒸煮損失率(a)、剪切力和感官評分(b)的影響Fig.3 Effects of different treatment time on cooking loss(a)and shear force and sensory evaluation(b)of horsemeat

由圖3a可知，使用真菌蛋白酶處理馬肉的時間對蒸煮損失率的影響也很大，因為處理時間直接影響著真菌蛋白酶水解蛋白的時間；隨著處理時間的增大，馬肉的蒸煮損失率逐漸減小，當處理時間為100 min時，此時的蒸煮損失率達到了最小值，為28.7%；當進一步增加處理時間，蒸煮損失率則會增加，原因是蛋白酶的水解作用時間越長，水解蛋白質就越充分，當處理時間過長時，就會出現水解過度的現象，此時不僅不會增加肉的保水性能，相反還會導致不必要的水分流失，影響肉的多汁性。由圖3b可以看出，處理時間和剪切力呈現顯著地負相關性，處理時間越長，剪切力值越小，當作用時間為100 m in左右時，此時的剪切力值適中，感官評分也最高，當進一步增加處理時間，感官評分有所下降，由于蛋白酶作用時間過長，嫩化效果不佳。因此綜合各個因素，選擇處理時間100min為宜。

2.4 不同pH值對馬肉嫩度的影響

在pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，真菌蛋白酶添加量為15 U/g，處理溫度55℃，處理時間為80 min的條件下分別測定馬肉的蒸煮損失率、剪切力和感官評價3個評價指標，結果如圖4所示。

圖4 處理時間對馬肉蒸煮損失率(a)、剪切力和感官評分(b)的影響Fig.4 Effects of different pH value on cooking loss(a)and shear force and sensory evaluation(b)of horsemeat

由圖4a可知，不同pH值的真菌蛋白酶液對馬肉的蒸煮損失率影響不顯著，基本都在32.5%左右，但在偏酸性的環境中真菌蛋白酶的活性也會受到影響。由圖4b可以看出，pH值對剪切力值得影響也不明顯，在pH值為7.0時的剪切力是4.548 kg，但剪切力的總體變化不明顯，說明真菌蛋白酶的pH值使用范圍較大，不容易受到外界酸堿性的影響；由于剪切力值得范圍變化不大，感官評分變化也不大，說明在這個范圍內，消費者對馬肉嫩度的可接受性比較相似。因此，真菌蛋白酶在pH值在6.0左右是最佳的。

2.5 真菌蛋白酶最佳嫩化條件的篩選

在單因素試驗的基礎上，以真菌蛋白酶添加量、處理溫度、處理時間和pH值為自變量，分別以剪切力（Y1）和感官評分（Y 2）為響應值，進行響應面優化試驗。由于剪切力和感官評價可以更為直觀準確地對馬肉的食用品質進行評價，所以響應面試驗中未將蒸煮損失率作為評價馬肉食用品質的最終指標。響應面試驗設計及結果如表3所示，方差分析結果見表4。

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface methodology

表4 真菌蛋白酶嫩化馬肉工藝優化數學模型方差分析Table 4 Mathematical model variance analysis for fungal protease tenderization conditions optimization

由表4可知，以剪切力（Y1）為響應值的二次方程具有極顯著性（P＜0.01），一次項中蛋白酶添加量、處理溫度和處理時間極顯著，pH值影響不顯著，這和單因素的試驗結果也是一致的；各個因素的交互作用不顯著，二次項中真菌蛋白酶添加量和處理溫度影響顯著，說明真菌蛋白酶的添加量和處理溫度對剪切力的影響極顯著，處理時間顯著，各因素對剪切力值的影響大小因素為真菌蛋白酶添加量＞處理溫度＞處理時間＞pH值。以感官評分（Y2）為響應值的二次方程也具有極顯著性（P＜0.01），一次項中真菌蛋白酶添加量和處理時間影響顯著；真菌蛋白酶和處理溫度的交互作用影響極顯著，處理溫度和處理時間的交互作用影響顯著；二次項中真菌蛋白酶的影響極顯著，各因素對感官評分的影響大小因素為處理時間＞真菌蛋白酶添加量＞pH值＞處理溫度。

采用響應面方法分析試驗結果，得到以剪切力及感官評分為響應值的回歸方程：

根據響應面分析建立的數學模型，得到的最佳工藝條件是：真菌蛋白酶添加20.63 U/g，處理溫度53.12℃，處理時間98.88 min，pH值為6.86。在此條件下剪切力的預測值為4.1 kg，感官評分為86.53分。

2.6 驗證試驗

通過響應面分析，得出真菌蛋白酶嫩化馬肉（半腱?。┑淖罴压に噮凳牵赫婢鞍酌柑砑恿?0.63 U/g，處理溫度53.12℃，處理時間98.88 min，pH值為6.86。在此條件下剪切力的預測值為4.1 kg，感官評分為86.53分。在給出的模型中，按實際操作確定的是真菌蛋白酶添加量20 U/g，處理溫度為55℃，處理時間為100 m in，pH值為7.0的條件下馬肉進行處理，在此條件下做5組平行試驗，檢驗模型的準確性；得出的剪切力值為4.3 kg，感官評分為82分，試驗驗證值接近模型的預測值，證明模型可以較好的預測真菌蛋白酶嫩化馬肉（半腱?。┑哪刍に?。

2.7 嫩化效果對比

利用TA-XT2i型物性儀對空白組和處理組的各項物性進行檢測，檢測結果見表5。

表5 真菌蛋白酶嫩化馬肉最優條件對其物性的影響Table 5 Physical characteristics of horse meat with fungal protease under the optimum condition

由表5可知，馬肉（半腱?。┙涍^真菌蛋白酶嫩化處理后，剪切力值明顯下降，幾乎減少了一半，肉質明顯變軟，由于蛋白酶的水解作用，肉質的膠著性和咀嚼性弱化，但也在可接受的范圍內，肉質的彈性也有所減弱，但變化不明顯?？傊?，經過真菌蛋白酶嫩化后的馬肉肉質鮮嫩，保水性好，具有很好的口感。

3 結論

通過響應面試驗結果可知，真菌蛋白酶的添加量對剪切力值的影響最為顯著，處理溫度次之，然后是處理時間，最后是pH值；通過響應面試驗得出的真菌蛋白酶嫩化馬肉的最佳條件是真菌蛋白酶添加量20.63 U/g，處理溫度53.12℃，處理時間98.88 min，pH值為6.86。在此條件下處理的馬肉軟硬適中，多汁性好，嫩化效果很好，顯著提高了馬肉的食用品質。

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Optimization of fungal protease treatment for horsemeat tenderization by response surface methodology

JIANG Xiaofeng,REN Wenwen,DADILA·Maimaiti,ZHANG Wen,KONG Lingming*
(College of Food and Pharmaceutics,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China)

To improve the tenderness of horsemeat(semitendinosus),using cooking loss rate,shear force and sensory evaluation as the evaluation index,combining with rolling treatment,the effects of different fungal protease addition,treatment time,temperature and pH on horse meat tenderness were studied,and then the optimal meat tenderization conditions were optimized by response surface methodology.The results showed that fungal protease had highly significant effects on horsemeat tenderness,and the treatment temperature and time had significant effects.The results showed that the optimal condition was fungal protease addition 20.63 U/g,treatment temperature 53.12℃,time 98.88 min,and pH 6.86.

horse meat;fungal protease;tenderness

TS251

A

0254-5071（2015）03-0038-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.009

2015-01-21

“十二五”國家科技支撐計劃課題（2014BAD04B11）

蔣小鋒（1989-），男，碩士研究生，研究方向為農產品加工及貯藏。

*通訊作者：孔令明（1976-），男，副教授，碩士，研究方向為農產品加工及綜合。