使用多普勒超聲成像比較櫛孔扇貝與蝦夷扇貝循環生理特征*

郝杰華 許 強① 汝少國 楊紅生

(1. 中國海洋大學海洋生命學院 青島 266003; 2. 中國科學院海洋研究所海洋生態與環境科學重點實驗室 青島 266071)

櫛孔扇貝(Chlamys farreri)和蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)是我國近海重要的養殖貝類。近年來, 全球氣溫的變化和海水溫度異常波動對近海扇貝的不利影響日趨嚴重(高菲, 2005)。掌握不同溫度下扇貝的血液循環生理特征, 是揭示扇貝生理代謝機能變化的有效途徑, 也是制訂應對策略、優化養殖管理的必然需求。循環系統生理學是動物生理學重要組成部分, 主要研究動物心臟、血管的生理特征、活動規律及其影響因素等, 研究的指標主要包括心率、血管收縮舒張特征、血流動態(流向、流速、流量、阻力)等(楊秀平等, 2002)。能反映心血管機能的循環系統生理學指標是指示新陳代謝水平和機體機能狀態的有效參數(Trueman, 1967; Campbell et al, 2007)。但是由于缺乏適用的技術, 貝類血液循環生理的研究遲遲無法開展, 國外也僅對貽貝、腹足類等心率指標的生理節律變化開展研究(Bakhmet et al, 2006; Braby et al,2006; Kholodkevich et al, 2009; Burnett et al, 2013),對其它循環生理功能的研究尚不多見。

多普勒超聲成像技術是高等動物循環生理學研究的核心技術之一, 可清晰呈現組織器官內部的血流信息, 包括血流方向、速度、加速度等, 從而實現血流狀態的無損實時監測(Braby et al, 2006; Novelo et al, 2012)。近年來, 該技術正逐步應用于魚類、兩棲類和其它水生動物的循環生理研究, 但超聲成像技術在雙殼貝類研究中的應用還很少, 僅見于Haefner等(1996)針對貽貝的研究, 闡述了不同溫度下貽貝心率和血流速度的變化特征。

本研究將多普勒超聲成像技術引入貝類循環生理研究中, 選取我國北方重要的扇貝種類——櫛孔扇貝和蝦夷扇貝, 解析并量化了不同溫度下兩種扇貝循環生理指標特征, 以期揭示兩種不同適溫性的扇貝在循環生理功能方面的適應性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1齡櫛孔扇貝(C.farreri)和蝦夷扇貝(P.yessoensis)分別在青島膠州灣筏式養殖區和大連獐子島底播養殖區獲得。清除扇貝表面的污物及附著生物, 控溫水箱內暫養兩周, 暫養期間溫度為(10±1)°C; 鹽度為31.3。每天上午10點全量換水1次, 并定量投喂小球藻(Chlorellasp.)、金藻(Chrysophytasp.)和三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)。馴養1周后, 櫛孔扇貝和蝦夷扇貝分別隨機挑選 6—10只健康及規格相近的個體用于實驗(見表1)。

表1 櫛孔扇貝和蝦夷扇貝基礎生物學指標Tab.1 Basic biological indices of C. farreri and P. yessoensis

1.2 實驗方法

1.2.1 溫度處理 實驗設置10、15、20和25°C 4個溫度梯度, 從 10oC緩慢逐步加溫(2°C/d)達到設定溫度, 到既定溫度后保持1h, 使扇貝處于相對穩定的狀態, 然后測定血液循環生理學指標。采用控溫水族箱水浴控制溫度, 誤差為±0.5°C。

1.2.2 儀器設備 實驗所用儀器為Z6 Vet型便攜式彩色多普勒超聲診斷儀(中國深圳 Mindray公司),探頭頻率為8—14MHz。

1.2.3 測定方法 在測定扇貝時, 用萬向支架固定超聲探頭, 使探頭沒入水中且可自由調節探頭方向; 用塑料夾固定扇貝于塑料水族箱底, 待其自然張口后調節探頭的聲波切面與扇貝貝殼面平行, 微調探頭方向, 使超聲面切過扇貝出鰓血管, 此時儀器顯示屏上出現扇貝血流的穩定圖像, 穩定30s后保存至少1min的動態錄像待后續分析。

1.2.4 彩超圖像 在多普勒彩超模式下保存的扇貝血管彩超圖和心率波動圖, 見圖 1。圖中不同顏色的血管代表不同的流動方向, 其中藍色代表入鰓血管, 紅色代表出鰓血管; 在心率波動曲線中, 每個周期代表一次心臟的收縮過程, 波動的高低代表血管中血液的瞬時流速, 波峰處為其最大瞬時流速; 其中“62/170”表示在該分析錄像時長共 170s, 圖像停留在62s處, 左側縱坐標表示套頭的位置, 右側縱坐標表示血流速度和方向。

圖1 多普勒彩超模式下扇貝血管的彩超圖和心率波動圖Fig.1 The Doppler color picture showing scallop vascular and heart rate fluctuation

1.2.5 指標體系 實驗扇貝的血流指標、計算方法及其循環生理學意義指征如下:

(1) 心率(Heart Rate, HR, 次/min)

每分鐘的心動周期即為扇貝的心率(HR), 心率的大小能反映心臟的泵血能力。

(2) 收縮峰值速度(Peak Systolic Velocity, PS,cm/s)

代表所測量血管內血液瞬時峰值流速。

(3) 舒張末期速度(End-Diastolic Velocity, ED,cm/s)

代表所測量血管內血液最低瞬時速度。

(4) 血流加速度(Acceleration of Blood Flow,ABF, cm/s2)

單位時間內血流速度的提升率, 即 ABF=(PSED)/t, 能反映血流速度變化快慢和心臟的泵血機能。

(5) 血液最大瞬時流量(Maximum Instantaneous Blood Flow, Max-IBF, mL/s)

Max-IBF表示扇貝血流收縮峰值速度對應的血管的瞬時最大血流量, 與血管的直徑和血液流速相關。

(6) 血液最小瞬時流量(Minimum Instantaneous Blood Flow, Min-IBF, mL/s)

Min-IBF表示扇貝血流舒張末期速度對應的血管的瞬時最小血流量, 與血管的直徑和血液流速相關。

(7) 阻力指數(Resistive Index, RI)

阻力指數的意義為RI=(PS-ED)/PS, 其值的大小可以用來判斷血液或血管的機能是否異常。

(8) S/D

S/D表示血管收縮峰值速度與血管舒張末期速度的比值, 即S/D=PS/ED; 其值的大小可以用來判斷扇貝的血管是否受到損傷。

1.3 統計方法

使用SPSS 19.0進行單因素方差分析, 顯著性差異定義為 P＜0.05, 數據以平均值±標準差(Mean±SD)表示。同時分別對不同扇貝基礎循環指標進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 溫度對櫛孔扇貝和蝦夷扇貝HR的影響

溫度對櫛孔扇貝和蝦夷扇貝 HR的影響總體相似。櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的HR與溫度正相關, 且溫度對櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的 HR均影響顯著(圖 2,P＜0.05)。在同一溫度下, 櫛孔扇貝的HR大于蝦夷扇貝; 在 10—25°C之間, 櫛孔扇貝變化范圍為 16—39次/min, 蝦夷扇貝變化范圍為 14—31次/min。在10—20°C范圍內相鄰兩個溫度設置下, 櫛孔扇貝HR有顯著差異(P＜0.05), 20°C與最高溫25°C無顯著差異(P＞0.05); 在 15—25°C 范圍內相鄰兩個溫度設置下,蝦夷扇貝 HR 有顯著差異(P＜0.05), 15°C 與最低溫10°C 無顯著差異(P＞0.05)。

圖2 不同溫度下櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的心率Fig.2 The HR of C. farreri and P. yessoensis in different temperatures

2.2 溫度對櫛孔扇貝和蝦夷扇貝ABF的比較

櫛孔扇貝和蝦夷扇貝 ABF與溫度呈正相關, 且溫度對櫛孔扇貝和蝦夷扇貝 ABF均影響顯著(圖 3,P＜0.05)。櫛孔扇貝 ABF整體大于蝦夷扇貝; 在10—25°C內, 櫛孔扇貝變化范圍為1.75—15.84cm/s2,蝦夷扇貝變化范圍為 0.99—7.41cm/s2(P＜0.05)。櫛孔扇貝在15—25°C范圍內, 相鄰兩個溫度設置下ABF無顯著差異(P＞0.05), 與最低溫 10°C 差異顯著(P＜0.05); 蝦夷扇貝則在10—20°C范圍內, 相鄰兩個溫度設置下 ABF無顯著差異(P＞0.05), 與最高溫25°C 差異顯著(P＜0.05)。

圖3 不同溫度下櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的ABFFig.3 The ABF of C. farreri and P. yessoensis in different temperatures

2.3 溫度對櫛孔扇貝和蝦夷扇貝血管PS及ED的影響

櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的PS值隨溫度的增加呈上升趨勢(見圖4)。在同一實驗溫度下, 櫛孔扇貝的PS大于蝦夷扇貝; 在 10—25°C 內, 櫛孔扇貝變化范圍為 3.54—8.09cm/s, 蝦夷扇貝變化范圍為 2.32—8.85cm/s。櫛孔扇貝在 10—20、15—25°C 內, 相鄰兩個溫度設置下PS無顯著差異(P＞0.05), 20°C與最低溫10°C 差異顯著(P＜0.05); 蝦夷扇貝則在 10—20°C 范圍內, 相鄰兩個溫度設置下 PS有顯著差異(P＜0.05),20oC與最高溫25°C無顯著差異(P＞0.05)。

溫度對櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的 ED影響不明顯(見圖 5)。在 10—25°C 內, 櫛孔扇貝變化范圍為1.51—3.15cm/s, 蝦夷扇貝變化范圍為1.09—4.23cm/s。櫛孔扇貝在10—20°C內, 相鄰兩個溫度設置下ED無顯著差異(P＞0.05), 20°C 和 25°C 與最低溫 10°C 差異顯著(P＜0.05); 蝦夷扇貝則在10—20°C內, 相鄰兩個溫度設置下ED無顯著差異(P＞0.05), 20°C和25°C與最低溫 10°C 差異顯著(P＜0.05)。

2.4 溫度對櫛孔扇貝和蝦夷扇貝瞬時血流量的影響

圖4 不同溫度下櫛孔扇貝和蝦夷扇貝血管的PSFig.4 The PS of C. farreri and P. yessoensis in different temperatures

圖5 不同溫度下櫛孔扇貝和蝦夷扇貝血管的ED的比較Fig.5 The ED of C. farreri and P. yessoensis in different temperatures

櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的 Max-IBF隨溫度升高呈增加的趨勢(見圖6); 同一溫度下, 蝦夷扇貝的Max-IBF大于櫛孔扇貝。在實驗溫度梯度內櫛孔扇貝的Max-IBF, 在10°C下最小值為0.098mL/s, 25oC下的最大值為 0.210mL/s, 20°C、25°C 與 10°C 間差異顯著(P＜0.05)。蝦夷扇貝在實驗溫度梯度內, 10°C下的最小值為0.226mL/s, 20°C下出現峰值0.297mL/s, 25°C又略呈下降趨勢, 實驗溫度梯度范圍內血流量差異不顯著(P＞0.05)。

櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的 Min-IBF變化趨勢與最大瞬時趨勢相近(見圖 7)。在實驗溫度內, 櫛孔扇貝在 10°C 下為其最小值, 25°C 為其最大值, 分別為0.047、0.071mL/s, 且溫度范圍內血流量差異不顯著(P＞0.05)。櫛孔扇貝在 10°C 下為其最小值, 25°C 為其最大值, 分別為 0.084、0.133mL/s, 且溫度范圍內血流量差異不顯著(P＞0.05)。

2.5 溫度對櫛孔扇貝和蝦夷扇貝RI及S/D的影響

圖6 不同溫度下櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的Max-IBFFig.6 The Max-IBF of C. farreri and P. yessoensis in different temperatures

圖7 不同溫度下櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的Min-IBFFig.7 The Min-IBF of C. farreri and P. yessoensis in different temperatures

溫度對櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的RI影響不明顯(圖8,P＞0.05); 在10—25°C內, 櫛孔扇貝RI變化范圍為0.49—0.69, 蝦夷扇貝 RI變化范圍為0.42—0.54。櫛孔扇貝在4個溫度點的RI無顯著的差異(P＞0.05); 在蝦夷扇貝中, RI整體差異不大, 但15°C與20°C之間的RI具有顯著性差異(P＜0.05)。

溫度對櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的 S/D影響不明顯(圖9,P＞0.05), 10—25°C內, 櫛孔扇貝S/D變化范圍為2.28—2.83, 蝦夷扇貝S/D變化范圍為1.75—2.12。櫛孔扇貝在4個溫度點的S/D無顯著的差異(P＞0.05);在蝦夷扇貝中, S/D 整體差異不大(P＞0.05), 但 15°C與20°C之間的S/D具有顯著性差異(P＜0.05)。

2.6 櫛孔扇貝和蝦夷扇貝生理指標相關性對比分析

對四種基礎生理指標進行相關性分析發現, 兩種扇貝存在十分相近的規律。心率與血流加速度、收縮峰值血流速度均呈顯著正相關, 即心率越快, 血流加速度越大, 收縮峰值血流速度越高。血流加速度與收縮峰值血流速度呈極顯著正相關, 即血流加速度越大, 收縮峰值血流速度越高(表2, 表3)。

圖8 不同溫度下櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的RIFig.8 The RI of C. farreri and P. yessoensis in different temperatures

圖9 不同溫度下櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的S/DFig.9 The S/D of C. farreri and P. yessoensis in differenttemperatures

表2 櫛孔扇貝循環生理指標相關性分析Tab.2 Correlation result of the circulatory physiological index of C. farreri

表3 蝦夷扇貝循環生理指標相關性分析Tab.3 Correlation result of the circulatory physiological index of P. yessoensis

3 討論

3.1 多普勒超聲成像技術的應用

反映心血管機能的循環系統生理學指標可有效地指示生物新陳代謝水平和機體機能狀態。但是受監測技術的限制, 以往對貝類循環生理指標的研究僅限于心率, 研究方法多采用呼吸描記法(Trueman,1967; Brabyetal, 2006)、體積描記法(Dietzetal, 1980)和直接觀察法(Harrison, 1977a, b), 其缺點是只能間接測定, 且需要破壞貝殼結構, 會對測定指標產生影響。本研究創新引入醫用多普勒超聲成像技術, 準確測量了扇貝心臟搏動特征、血液動力學以及血管機能等多個指標, 該技術對待測生物無創傷, 可重復連續獲得血流生理數據, 具有安全、方便等優點。該技術的應用大大方便了貝類循環生理學的研究, 為下一步雙殼貝類的循環生理學研究開辟了新出路。

3.2 溫度變化對兩種扇貝心臟機能和血流動力學特征的影響

扇貝心率的高低能反映出扇貝心臟的泵血能力,本實驗中扇貝的心率與實驗溫度呈正相關, 這與其它雙殼貝類(紫貽貝、河蚌、紫踵劈蚌)的研究結果一致(Nicholson, 2002; Pandolfoetal, 2009)。心率的高低與兒茶酚胺類激素的調控密切相關。溫度升高可以顯著提高櫛孔扇貝和牡蠣血淋巴中兒茶酚胺的含量(Lacosteetal, 2001a, b; Chenetal, 2008), 兒茶酚胺通過兒茶酚胺-β受體-cAMP系統刺激心臟, 可刺激心肌細胞, 使心率加快, 收縮力增強, 傳導速度增快,心輸出量增加(Schlaichetal, 2005) 。該現象也已在魚類、蟹類等其它生物的研究中得以證實, Campbell等(2007)研究結果表明魚類心率提高能直接導致單位時間的心輸出量增加, 血液循環速度加快, 使魚類可應對較高的機體代謝水平。De Wachter等(1996)在研究不同溫度對螃蟹心率、每搏輸出量、動脈血管的流量中發現, 當溫度從12°C升至20°C時, 心率、每搏輸出量、動脈血管的流量顯著增加。

與扇貝心率提升對應的是動脈血液加速度提高,繼而血液循環速率提升。相對于血流加速度的顯著增加, 在 15—25°C之間, 櫛孔扇貝 PS、ED、Max-IBF和Min-IBF均基本保持穩定, 表明盡管血液輸送總量增加, 但仍保持相對穩定的動力學狀態; 蝦夷扇貝在該溫度段內血液動力學穩定狀況相對較差, 收縮期峰值血流速度僅在 20—25°C下保持穩定, 舒張期血流速率在 25°C時已有顯著升高, 最高血流量也出現下降趨勢, 表明其血液動力學已出現異常跡象, 扇貝機體可能已進入高溫脅迫應激狀態。

3.3 溫度變化對兩種扇貝血管機能的影響

RI指標能反映血管某一橫斷面血流彈性阻力狀態, 可以對血管機能和是否出現異常進行定量評價,當血液或血管機能異常時, 血管阻力增加, 舒張期血流減少, RI值增大; 當RI值增大至0.8以上時, 可以斷定血液或血管已受到損害(胡慶鷹等, 2009)。S/D值已廣泛應用于胎兒動脈狀態的監測, 當 S/D≥3時,表明臍動脈血管出現異常(劉瑛等, 2005; 李仲瑞等,2012)。本實驗結果表明, 櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的 RI和 S/D值隨著溫度的升高而增大, 但變動范圍較小,RI值在0.6以下, 變動范圍0.1以內, S/D值變動范圍在0.3—0.5, 結合其它循環生理指標可確定測得的RI和S/D值應處于扇貝的正常范圍內, 扇貝血管沒有器質性損傷, 血液循環機能正常。但指示扇貝血管出現異常的RI和S/D閾值是多少、脊椎動物的正常值范圍是否適用于扇貝還需要開展進一步實驗進行界定。

4 結論

一般來說, 生活在寒冷區域的無脊椎動物其新陳代謝速率較溫暖區域的偏低, 其生態學意義是最大程度減少身體的能量損耗, 有助于其適應低溫環境。櫛孔扇貝為暖溫型種類, 主要分布于我國黃渤海到東海沿岸以及日本(北海道)以南和朝鮮沿海(王禎瑞, 2002a), 適溫范圍為4—26°C, 20°C左右為其最適生長溫度(王玲玲, 2006); 蝦夷扇貝則為典型的冷水性種類, 自然分布區較櫛孔扇貝更偏北, 主要分布在我國黃海北部和日本北部沿海、俄羅斯遠東海及朝鮮半島海域(王禎瑞, 2002b), 適溫范圍為 0—25°C,15°C為其最適生長溫度(常亞青等, 2007)。兩種扇貝的耐溫性在循環系統生理特征上明顯體現。蝦夷扇貝HR、ABF和 PS均低于櫛孔扇貝, 而 Max-IBF和Min-IBF均高于櫛孔扇貝, 蝦夷扇貝的血流阻力也要低于櫛孔扇貝, 表明蝦夷扇貝在較低的心臟和血流搏動節律下保持了高效的血液流通, 從而以相對較少的能量消耗維持了其機體代謝對血液循環的需求,這也與其冷水性的生態習性相適應。

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