促進自體脂肪移植血管形成的研究進展

王明龍, 章建林

作者單位：200003 上海，第二軍醫大學附屬長征醫院 整形外科

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促進自體脂肪移植血管形成的研究進展

王明龍, 章建林

脂肪移植； 血管形成； 自體脂肪

臨床上對于外傷、腫瘤、先天性發育不良等原因導致的軟組織缺失，或正常情況下的美容手術，常用的治療方法有皮瓣移植、假體置入、軟組織填充等。軟組織填充由于創傷小、效果佳、可塑性強，而成為較常用的治療手段之一。臨床常用的填充物，如硅膠、膠原蛋白和玻璃酸鈉等均存在排斥反應，或術后療效不持久的缺點。自體脂肪移植則是解決以上問題的有效辦法，自體脂肪組織具有來源豐富、取材方便、無免疫排斥反應等優點。但目前自體脂肪移植的臨床效果并不理想，游離脂肪細胞移植，早期受區血供差等原因，導致其存活率低，部分液化、壞死、鈣化，吸收率為30%～70%，限制了其在臨床上的廣泛應用。因此，如何促進移植脂肪細胞血管化，從而提高存活率成為臨床脂肪細胞移植迫切需要解決的問題。脂肪組織血液供應特點：⑴成熟的脂肪組織中，僅10%單房成熟脂肪細胞占據超過90%的空間體積，其余90%細胞占據10%空間體積。體積龐大的脂肪細胞垂掛在血管支架上，每個細胞都有單獨的血管供應系統與主干相連，有學者形象地將脂肪組織結構比喻為“葡萄串”樣結構。⑵成熟脂肪細胞是高能耗細胞，非常脆弱，對血液供應的要求很高。⑶在移植物與宿主建立充分的血供之前，脂肪組織只能靠周圍組織液的浸潤和滲透來維持營養供應，這種供應的距離極為有限，僅為150～ 200 μm，超過200 μm會出現缺血壞死。由于脂肪組織血供的特殊性，也為脂肪移植血管化的研究帶來了很大困難。

對于脂肪移植存活率及血管化的影響大致與以下4點有關：⑴移植脂肪的供區；⑵移植的脂肪的質量；⑶受區(即手術脂肪移植區)的術前處理；⑷術后護理等。目前各種研究主要在前3個方面。以下就前3點，對目前各種促進自體脂肪游離移植成血管化的研究進行文獻復習。

1 不同供區脂肪的對移植脂肪血管化的影響

有學者對機體各部位皮下脂肪組織的研究發現，脂肪細胞的活性、移植后移植物的質量及組織形態學均無明顯差別。但下腹部與大腿內側脂肪組織中的脂肪細胞和脂肪間充質干細胞數量較高，并且這些部位的脂肪細胞具有α2受體[1]，其具有抗脂肪分解及對營養反應較低的特性，其移植后存活的可能性較大。目前研究證明，脂肪來源干細胞分泌多種細胞因子，如血管內皮生長因子、轉化生長因子、肝細胞生長因子、胎盤生長因子、胰島素樣生長因子和血管生成素等[2]。有研究發現，脂肪來源干細胞具有促血管化和抗凋亡的潛能。因此，不同部位脂肪對于移植脂肪血管化具有一定的影響。

2 移植脂肪的質量

移植脂肪的質量不同對移植后脂肪血管化的影響起決定性作用，目前，大部分對于促進移植脂肪血管化的研究也主要集中在增強移植脂肪的質量方面，主要方法大致為：⑴利用各種細胞因子、生長因子輔助脂肪移植血管化。⑵各種細胞因子+脂肪來源干細胞輔助脂肪移植及各種細胞因子基因轉染的脂肪來源干細胞輔助脂肪移植。⑶組織工程方法增強脂肪移植血管化。

2.1 各種細胞因子輔助血管化的研究

2.1.1 胰島素對移植脂肪組織成血管的促進作用 近年來研究發現，胰島素具有促進血管內皮細胞分裂增殖的作用。增加血管內皮生長因子的分泌，并能有效地促進大鼠前脂肪細胞的增殖和分化。研究表明，低濃度胰島素對細胞的增殖分化和血管內皮細胞的增殖，以及血管內皮細胞生長因子的表達具有明顯的促進作用，而高濃度的胰島素反而有抑制作用[3-4]。鄧穎等[5]研究表明，微血管免疫組化觀察顯示，脂肪移植10、20 d兩組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，微血管密度隨著時間的推移增多，微血管增生在移植后前20 d增加較快，20～28 d新生血管增加速度變緩。胰島素微血管密度組明顯大于對照組(P<0.01)，實驗結果顯示，脂肪移植后10 d，可見明顯的微血管重建現象，胰島素組在移植后20 d，血管生長達到高峰，28 d時仍有血管生長，但生長變緩慢。對照組微血管生長在移植后28 d達到高峰，遲于胰島素組。本研究證明，胰島素對自體脂肪移植組織的血管再生起到促進作用。2.1.2 成纖維細胞生長因子輔助移植脂肪血管化 目前對酸性成纖維細胞生長因子和堿性成纖維細胞生長因子進行研究。申在旭等[6]在脂肪移植隆乳術中應用酸性成纖維細胞生長因子預處理的脂肪干細胞輔助脂肪組織移植，通過與對照組未處理的脂肪干細胞輔助脂肪移植對比，結果表明，治療組術后1、3個月，隆起增加值分別為(13.8±2.9) mm，(12.9±3.6) mm；隆起維持率分別為86.7%、80.0%。對照組術后1、3個月隆起增加值分別為(12.4±1.7) mm，(11.2±1.4) mm；隆起維持率分別為66.7%，59.5%。對照組脂肪隆起減少更明顯。2組比較差異有統計學意義(P<0.05)。另有研究顯示，酸性成纖維細胞生長因子可刺激脂肪細胞增殖分裂，減少脂肪細胞凋亡，促進血管內皮細胞增殖，促進血管生長，增加脂肪的供血。2000年，E Yuksel等認為，除了各種因子的促前脂肪細胞分化增殖作用外，堿性成纖維細胞生長因子促血管再生的活性，為移植體構建了良好的生存環境，也可能在促進移植體存活方面起到了重要作用。靳元嶸和楊瑟飛[7]的研究也證明，堿性成纖維細胞生長因子可以更好地促進脂肪移植體早期血運重建。

2.1.3 血管內皮生長因子對移植脂肪組織成血管的促進作用 對血循環重建而言， 血管內皮生長因子作為血管內皮細胞的特異性絲裂原，是血管形成重要的調節因子，在新生血管形成過程中起著重要的作用。并且在一些血管內皮生長因子撤退性研究中發現，血管內皮生長因子撤退后，出現生理性及病理性的血管退化現象，進一步證明血管內皮生長因子在成血管機制中的重要作用。血管內皮生長因子可促進移植組織內的血管增生和脂肪細胞的分化增殖。2011年，JG Rasmussen等研究腺病毒介導的血管內皮生長因子對血管生成的影響，及對游離脂肪移植物存活率的影響，結果證明，血管內皮生長因子誘導血管的生成，提高了脂肪移植存活率。Chung等[8]將血管內皮生長因子包裝到微球體緩釋裝置中，分為3組：血管內皮生長因子微球體組、空微球體組、脂肪提取物對照組，皮下注射，第3、6周組織檢測顯示，血管內皮生長因子組質量和體積都有增加，另兩組質量和體積減少；CD31+、伊紅和蘇木精染色觀察，血管內皮生長因子微球體組血管密度明顯多于另兩組。有研究表明，血管內皮生長因子和血小板源性生長因子共同作用，可以促進脂肪組織血管化。

2.1.4 富血小板血漿對移植脂肪組織成血管的促進作用 富血小板血漿是通過離心自體全血，而獲得的血小板濃縮物。富血小板血漿中生成血管的生長因子成分包括：間質細胞衍生因子-1、胰島素樣生長因子-1、堿性成纖維細胞生長因子和血管內皮生長因子等。而其含有的因子也均被研究證明，具有促進移植脂肪血管化的作用。Li等[9]的動物研究結果發現，移植組織無炎癥和膿腫形成；實驗組在血管再生、脂肪液化壞死方面都要好于對照組；在l5、30和90 d后，實驗組的移植脂肪的質量和體積，均顯著大于對照組(P<0.05)；組織學觀察得出，在15、180 d后，實驗組的微血管數量顯著多于對照組(P<0.05)。Willemsen等[10]通過問卷調查獲取患者的滿意度和結果。以上研究表明，富血小板血漿混合自體顆粒脂肪組織移植，能加速移植組織早期血管重建，避免纖維化和脂肪細胞凋亡。

2.1.5 其余對移植脂肪組織血管化具有促進作用的細胞因子研究 此外，如在紅細胞生成素、雌激素[11]、血小板源性生長因子、轉化生長因子B、血管生長素、肝細胞生長因子、透明質酸水凝膠等的研究中，大部分研究都得出了可促進移植脂肪組織血管化加速的結論，但對各種生長因子及細胞因子來說，主要有作用的持續性和劑量的把控問題。有學者研究出多次注射及各種微量控釋裝置，將所用的細胞因子放入控釋裝置，從而減少降解率，并控制局部濃度，最終延長其效用時間。如可降解多孔層結構或預包埋的微球生物材料等。

2.2 與脂肪干細胞聯合移植及各種輔助細胞因子的作用

2006年，K Yoshimura等提出脂肪來源干細胞協同自體脂肪移植的概念。此后對于脂肪來源干細胞的研究紛紛展開。2.2.1 血管基質組分輔助脂肪組織移植血管化 血管基質組分是一種混合組分，其中包含多種細胞、干細胞和祖細胞[12]。Kim等[13]的研究表明，血管基質組分與脂肪來源干細胞對于脂肪移植成活起到一定的作用，對移植脂肪的血管化起到了促進的作用，雖然脂肪來源干細胞具有多重分化功能，可分化為脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞等[14]，但本研究顯示，其新生血管并非脂肪來源干細胞分化而成。

2.2.2 脂肪來源干細胞+血管內皮細胞生長因子 2007年， CG Yi等利用腺病毒做血管內皮細胞生長因子的載體，并混合人類脂肪組織后注入到動物頭皮下。2組對照組則分別注入綠色熒光蛋白基因-人類脂肪組織混合物和生理鹽水。經過一系列處理后結果顯示，實驗組的毛細血管密度顯著增高(P<0.01)，其脂肪移植組織的質量和體積明顯高于對照組(P<0.05)。Lu等[15]利用血管內皮細胞生長因子基因轉染的脂肪來源干細胞輔助脂肪移植血管化實驗，注入裸鼠背部皮下4個區域，6個月后，毛細血管計數結果實驗組移植物質量較大，脂肪液化壞死及鈣化均明顯少于其他組，差異有統計學意義(P<0.05)。楊波等[16]用血管內皮細胞生長因子165基因轉染脂肪來源干細胞，促進移植脂肪血管化，同樣證明了其有效性。

2.2.3 脂肪來源干細胞復合各種細胞因子促進移植脂肪血管化的方法 脂肪來源干細胞復合富血小板纖維蛋白促進移植脂肪血管化[17]，肝細胞生長因子轉染的脂肪來源干細胞促進移植脂肪血管化，重組人血管內皮細胞生長因子的脂肪來源干細胞和前列腺素E1促進移植脂肪等。還有多種細胞因子及生長因子以復合或轉染脂肪來源干細胞的方式，用于促進脂肪移植的血管化，其中大部分研究都得出了可促進移植脂肪組織血管化加速的結論，且解決了單獨細胞因子早期降解及最適劑量等時效問題。

2.3 組織工程方法促進脂肪移植血管化的方法

2.3.1 脂肪組織工程促進脂肪移植血管化 組織工程技術已經應用于脂肪移植術，但核心問題仍然是血管化的問題，機體脂肪組織高度血管化，血流供應和毛細血管密度是骨骼肌組織的2～3倍。因此，學者們達成了一種共識：組織工程組織的構建受限于構建組織的血管化程度。如何解決組織工程脂肪組織的血管化問題，學者們做出了不同的嘗試。有研究發現，血管內皮細胞生長因子和堿性成纖維細胞生長因子在纖維素支架材料中聯合應用，能夠明顯促進組織工程脂肪血管化，而這正是脂肪細胞再生和維持所必需的。利用轉基因技術可使種子細胞表達重組促血管生成生長因子，并釋放促血管生成生長因子，提高組織工程脂肪血管化水平。1999年，LO Shea等將編碼血小板源性生長因子的質粒DNA引入聚乳酸乙酸共聚物支架中，體內外實驗均觀察到組織血管形成加速。2000年，MJ Wissink等利用肝素與堿性成纖維細胞生長因子結合，特性構建堿性成纖維細胞生長因子控釋體系；將堿性成纖維細胞生長因子控釋體系結合到膠原支架上埋植于大鼠皮下，支架內血管長入明顯加快。

2.3.2 組織工程室 2003年，SO Hofer等將在體血管放入生物惰性材料，制作有一定硬度的組織工程室，為培養組織提供血管基礎、營養物質和生長所需空間，稱為血管化的組織工程室。2007年，JH Doldercr等在大鼠體內構建了以腹壁下淺動脈為蒂的脂肪瓣在組織工程室內自發生長模型，6周后組織工程室內脂肪瓣體積從0.08 ml增加到1.20 ml。ML Moya等將成纖維細胞生長因子-1添加到軟藻酸鹽微支架上，發現與加入單純FGF-1相比，能觀察到更明顯的血管化。組織工程室不僅為室內組織生長提供所需空間，促進血管出芽，增加室內組織的體積，構建出相對獨立空間，還可進行進一步的實驗干預，如局部應用一些生長因子或誘導因子加速室內組織生長。

2.3.3 組織工程共培養體系 脂肪組織工程中的共培養策略，主要是將種子細胞與內皮或內皮祖細胞共同培養，以在工程脂肪中建立良好的血供為目的。一種細胞釋放一種特定的物質，與另一種細胞表面受體結合，促進其產生一定的生物性效應[18]。Strassburg等[19]的研究顯示，脂肪來源干細胞增強了內皮祖細胞的成血管能力。2011年，JH Choi等的研究表明，人臍靜脈內皮細胞對脂肪來源干細胞的成脂功能具有促進作用。雖然共培養體系促進移植脂肪的血管化更有優勢，且近期也應用到多領域，但脂肪組織共培養體系中內皮祖細胞較難獲取，兼容兩種細胞特性的生物支架較少，及2種細胞的培養比例等問題仍待解決。

3 受區(即手術脂肪移植區)的術前處理

采用負壓真空隆乳裝置隆乳已有100多年歷史。最近的brava負壓真空隆乳裝置聯合脂肪移植在臨床的應用取得了可觀的效果。 Heit等[20]的基礎研究解釋了以上實驗成功的原因。以小鼠為實驗對象，通過連續長時間的負壓真空吸引結果顯示，外擴張21 d局部組織出現腫脹；28 d是時皮下脂肪層厚度倍增，MRI結果一樣。擴張部位皮下層細胞倍增，脂肪細胞數增至原來的2.2倍；血流灌注顯示，28 d時，實驗組皮下組織血管密度為對照組的1.9倍，處理組7 d時，觀察到機械刺激作用導致血管構筑，血管以再定位和官腔增大的形式發生強烈重塑。

4 討論

通過以上文獻復習，無論是供區的選擇，添加各種細胞因子提高移植脂肪質量，脂肪組織工程技術，還是術前受區的真空負壓擴張處理，最終目的都是以促進脂肪移植的血管化，提高脂肪移植存活率。以上總結了近年來較有潛力的促自體脂肪移植組織血管再生的物質及其研究方法，大部分都取得了一定的成果，但有很多的問題尚未解決：⑴超早期血管化，超早期移植脂肪缺氧與營養供應。⑵移植脂肪中心壞死區的保存。人類脂肪組織抽吸物在移植后3～4周按組織學分類可分為3種區域：外周區域(活性脂肪細胞)、過渡區域(炎性過程)和中央區域(壞死區域)。移植早期的外周區細胞由周圍原有組織滲透的血漿提供的代謝環境保持活性，其滲透的范圍為距離軟組織300 μm內[21]。⑶移植的脂肪最終細胞是原移植細胞存活,還是新生的脂肪細胞，再生細胞的數量、比例、最大可達到的體積和數量及其機制問題。大多數研究顯示,在最初移植的脂肪經歷體積減小后一般在5～7 d會有體積的增加。綜上所述,盡管我們已經做了很多研究探索脂肪移植血管化的問題，盡管取得了一些成果，但上述關鍵問題仍亟待解決。

目前研究普遍認為，內皮祖細胞(endothelial progenitor cells, EPC)是血管內皮細胞的前體細胞，因此,又稱為血管內皮干細胞,是參與生理性及病理性血管形成最主要的細胞。然而EPC生理狀態下較少存在于外周，EPC的體外培養較困難，而且長期培養后易分化,失去成血管能力,限制了其應用。大量研究表明，基質細胞衍生因子-1α是EPC的強大趨化劑，其通過與EPC表面的特異性基質細胞衍生因子-1α特異性受體結合，在短時間內即可迅速動員骨髓中EPC進入外周血，并介導外周血中EPC遷移、歸巢到缺血缺氧組織局部，從而參與了血管新生及損傷血管的重新內皮化[22]。由此我們設想，可以構建一種承載基質細胞衍生因子-1α基因的病毒轉染脂肪來源干細胞，將轉染的脂肪來源干細胞混合脂肪顆粒共同移植，在受區缺氧刺激下，脂肪來源干細胞大量分泌基質細胞衍生因子-1α，從而趨化EPC進入移植區參與血管構建，加速移植物早期血管建立，最終提高移植脂肪存活率。

[1] Shiffman MA. 自體脂肪移植[M]. 孫家明, 譯. 北京:人民衛生出版社, 2012:10.

[2] Hsiao ST, Lokmic Z, Peshavariya H, et al. Hypoxic conditioning enhances the angiogenic paracrine activity of human adipose-derived stem cells[J]. Stem Cells Dev, 2013,22(10):1614-1623.

[3] Hiemann NE, Meyer R, Wellnhofer E, et al. Non-HLA antibodies targeting vascular receptors enhance alloimmune response and microvasculopathy after heart transplantation[J]. Transplantation, 2012,94(9):919-924.

[4] Wang Y, Lian F, Li J, et al. Adipose derived mesenchymal stem cells trans dianlation viaportal vein improves microcirculation and ameliorates Iiver fibrosis jnducedbv CC14 in rats[J]. J TransI Med, 2012,10:133.

[5] 鄧 穎, 曾令寰, 李 偉, 等. 吳一島素促進大鼠移植脂肪微血管的形成[J]. 中國組織工程研究, 2013,17(18):93-99.

[6] 申在旭, 徐云輝, 何春光, 等. 重組人酸性成纖維細胞生長因子預處理脂肪干細胞聯合自體脂肪移植用于隆乳術的多中心、隨機臨床對照試驗[J]. 中國美容醫學, 2014,23(11):893-896.

[7] 靳元嶸, 楊瑟飛. 堿性成纖維細胞生長因子緩釋體系誘導脂肪移植體早期血運重建[J]. 中國組織工程研究, 2013,7(44):7745-7750.

[8] Chung CW, Marra KG, Li H, et al. VEGF microsphere technology to enhance vascularization in fat grafting[J]. Ann Plast Surg, 2012,69(2):213-219.

[9] Li J, Shi X, Chen W. Influence of repeatedly injecting platelet-rich plasma on survival and quality of fat grafts in nude mice[J]. Zhong guo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi, 2013,27(4):454-459.

[10] Willemsen JC, Lindenblatt N, Stevens HP. Results and long-term patient satisfaction after gluteal augmentation with platelet-rich plasma-enriched autologous fat[J]. Eur J Plast Surg, 2013,36:777-782.

[11] Oruc M, Ozer K, Turan A. The role of estrogen in the modulation of autologous fat graft outcomes[J]. Plast Reconstr Surg, 2015,136(1):112e.

[12] Bourin P, Bunnell BA, Casteilla L, et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the international federation for adipose therapeutics and science (IFATS) and the international society for cellular therapy (ISCT)[J].Cytotherapy, 2013,15(6):641-648.

[13] Kim DY, Ji YH, Kim DW, et al. Effects of platelet-Rich plasma, adipose-derived stem cells, and stromal vascular fraction on the survival of human transplanted adipose tissue[J]. J Korean Med Sci, 2014,29 Suppl 3:S193-S200.

[14] Choi J, Minn KW, Chang H. The efficacy and safety of platelet-rich plasma and adipose-derived stem cells: an update[J]. Arch Plast Surg, 2012,39(6):585-592.

[15] Lu F, Li J, Gao J, et al. Improvement of the survival of human autologous fat transplantation by using VEGF-transfected adipose-derived stem cells[J]. Plast Reconstr Surg, 2009,124(5):1437-1446.

[16] 楊 波, 高建華, 魯 峰, 等. VEGF165岱基因轉染脂肪組織來源干細胞后目的基因表達[J].南方醫科大學學報, 2008,28(5):852-854.

[17] 李 龍, 劉 斌, 劉彥普. ASCs復合PRF促進自體移植脂肪血管化的實驗研究[D]. 第四軍醫大學, 2012.

[18] Strassburg S, Nienhueser H, Bjorn Stark G, et al. Co-culture 0f adipose-derived stem cells and endothelial cells in fibrin induces angiogenesis and vasculogenesis in achorioallantoic membrane model[J]. J Tissue Eng Regen Med, 2016,10(6):496-506.

[19] Strassburg S, Nienhueser H, Stark GB, et al. Human adipose-derived stem cells enhance the angiogenic potential of endothelial pmgenitor cells, but not of human umbilical vein endothelial cells[J]. Tissue Eng Part A, 2013,19(1-2):166-174.

[20] Heit YI, Lancerotto L, Mesteri I, et al. External volume expansion increases subcutaneous thickness, cell proliferation, and vascular remodeling in a murine model[J]. Plast Reconstr Surg, 2012,130(3):541-547.

[21] Eto H, Kato H, Suga H, et al. The fate of adipocytes after nonvascularized fat grafting: evidence of early death and replacement of adi-pocytes[J]. Plast Reconstr Surg, 2012,129(5):1081-1092.

[22] He W, Ye L, Li S, et al. Construction of vascularized cardiac tissue from genetically modified mouse embryonic stem cells[J]. J Heart Lung Transplant, 2012,31(2):204-212.

上海市自然科學基金資助項目(124119a0701)

作者單位：200003 上海，第二軍醫大學附屬長征醫院 整形外科

王明龍(1987-)，男，遼寧朝陽人，碩士研究生.

章建林，200003，第二軍醫大學附屬長征醫院 整形外科，電子信箱:zhangjianlin9@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.11.016

2016-09-21)