石菖蒲水提物對PC12細胞增殖及細胞突起的作用

姚　娜，梁　迷，林森相，張　琦，譚　琰，王　旭，王淑艷，華　茜

(1. 天津市血液中心檢驗科，天津　300110；2. 北京中醫藥大學基礎醫學院，北京　100029)

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石菖蒲水提物對PC12細胞增殖及細胞突起的作用

姚娜1,2，梁迷2，林森相2，張琦2，譚琰2，王旭2，王淑艷2，華茜2

(1. 天津市血液中心檢驗科，天津300110；2. 北京中醫藥大學基礎醫學院，北京100029)

[摘要]目的研究石菖蒲水提物對PC12細胞增殖及細胞突起的作用，觀察藥物是否具有神經營養功能或促進細胞分化的功能。方法采用細胞計數試劑盒檢測不同濃度的石菖蒲水提物對細胞活力的影響；采用Image J軟件統計PC12細胞的梭型細胞率、細胞分化率、細胞突起長度及陽性細胞分化率，以評價石菖蒲水提物對細胞分化的影響。結果石菖蒲水提物在完全培養條件和低血清培養條件下對PC12細胞增殖有顯著的促進作用，對細胞突起的長出、分支、延伸有明顯的抑制作用。結論石菖蒲水提物具有一定的神經營養功能。

[關鍵詞]PC12；石菖蒲水提物；細胞增殖；細胞突起

大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞系(pheochromocytoma cells，PC12)在形態和功能上都具有類似神經細胞的特征，被廣泛用于研究各種神經系統疾病。神經損傷前期均存在著神經突起萎縮，突觸間聯系變少、消失，神經細胞丟失等現象。雖然成熟神經細胞不可再生，但一些有限的突起再生、突觸重塑的行為還是普遍存在于神經系統中，這給神經系統疾病的治療帶來幫助。因此，改善神經細胞存活環境，促進神經修復已成為研究和治療的熱點。

石菖蒲來源于《神農本草經》，古代文獻記載其具有化濕開胃、開竅豁痰、醒神益智的功能，被用來治療癲癇、痰厥、熱病神昏、健忘等疾病。有學者[1]通過統計1980—2011年治療老年癡呆的臨床文獻發現，臨床上用于改善學習記憶能力的172種中藥中石菖蒲使用頻率最高，說明其可能具有一定的神經保護作用?，F代研究顯示，石菖蒲能明顯改善模型大鼠的學習記憶能力，縮短通過水迷宮的時間，同時使模型大鼠海馬CA區突觸后膜致密物質增厚，使神經細胞的細胞器的病理性改變有一定程度的恢復[2]。其不同部位水提物能顯著改善β-淀粉樣蛋白1-42(amyloid β-protein 1-42，Aβ1-42)致阿爾茲海默病小鼠的學習記憶能力。

本實驗采用PC12細胞作為體外模型，研究石菖蒲水提物對細胞增殖和細胞突起的作用，觀察其是否具有神經營養功能或者促進神經細胞分化的功能。

1材料

1.1細胞PC12細胞購自中國協和醫科大學細胞資源中心。

1.2試驗藥物石菖蒲水提物由北京中醫藥大學

神經免疫實驗室惠贈，由水提醇沉而得干燥粉末，無菌水配置成100 mg/mL的母液，過濾除菌后于4 ℃長期保存。

1.3主要試劑達爾伯克改良伊格爾培養基(dulbecco’s modified eagle medium)：美國Invitrogen；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)：美國Invitrogen；馬血清(horse serum，HS)：美國Hyclone；細胞黏附劑：普利萊，北京；細胞計數試劑盒-8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)：Dojindo，日本；青霉素-鏈霉素混合液：普利萊，北京。

2方法

2.1CCK法測定細胞活力收取預培養的PC12細胞，經1 000 r/min，離心5 min后用完全培養基(DMEM+10% HS+5% FBS)重懸成單細胞懸液，以每孔1 500的密度接種于96孔板中，待細胞完全貼壁后或次日加入石菖蒲水提物(設置6個濃度組，每組5個復孔)，37 ℃、5% CO2細胞培養箱中繼續培養48 h。在檢測細胞活力前將培養基替換成無血清DMEM培養基，每孔加入100 μL(含10 μL CCK-8試劑)，繼續37 ℃孵育1～4 h，采用多功能酶標儀檢測細胞活力，檢測波長為450 nm，參考波長為630 nm。在低血清培養環境下檢測藥物對細胞增殖的作用時，采用低血清培養基(DMEM+1% HS+0.5% FBS)將細胞重懸成單細胞懸液，以每孔2 000的密度接種于96孔板中。

2.2細胞形態學觀察為促進細胞分化，降低血清對細胞增殖的促進作用，且同時模擬神經損傷后腦內營養缺乏的環境，在觀察細胞形態時采用低血清培養條件進行培養。隨著血清濃度的下降，PC12細胞的死亡率將明顯升高，貼壁性進一步下降[3]，因此采用細胞黏附劑對培養皿進行提前包被，即用無菌水或者磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)將200倍的細胞黏附劑稀釋成1倍的工作液，按照試劑盒說明書將所述劑量加入至培養皿中，隨后在37 ℃繼續孵育0.5 h，用無菌水或者PBS清洗1～2遍后使用。

選擇對數期PC12細胞，經1 000 r/min，離心5 min后用低血清培養基重懸成單細胞懸液，以每孔104的密度接種于預先采用細胞粘附劑包被的24孔板中。次日加入不同濃度的石菖蒲提取物，每組設3個復孔，在37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養48 h。觀察細胞形態并在顯微鏡下隨機選擇兩個視野進行拍照，隨后采用Image J軟件統計PC12細胞的形態學指標。①梭形細胞率：梭形細胞(包含梭型、多角形及橢圓形細胞)占總細胞的百分比，觀察藥物對細胞形態的影響。②細胞分化率D1及細胞分化率D2：D1指長出突起的細胞占總細胞數的百分比，D2為長出突起數目>2的細胞占總細胞數的百分比，觀察藥物對細胞分化并長出突起的作用。③突起長度：每個視野選擇具有最長突起的20個細胞，統計其最長突起的平均長度，觀察藥物對突起延伸的作用。④陽性細胞分化率：突起長度>20 μm為陽性細胞，計算陽性細胞占總細胞數的百分比，觀察藥物對突起延伸的作用。

3結果

3.1完全培養環境下石菖蒲水提物對細胞增殖的影響在完全培養環境下，濃度<1 000 mg/L的石菖蒲水提物對細胞活力并無抑制效果。與對照組比較，50、200、1 000 mg/L石菖蒲水提物均能明顯提高細胞活力(P<0.05)，其中200 mg/L的石菖蒲水提物作用效果最明顯(P<0.01)。見圖1。

注：含有相同右上標符號的組別相比較，P>0.05；不含相同右上標符號的組別相比較，P<0.05。

3.2 低血清培養環境下石菖蒲水提物對細胞形態的影響加入石菖蒲水提物后細胞形態發生明顯變化，突起明顯減少甚至消失，細胞變圓，梭型細胞變少，胞體直徑相對較小，細胞數量明顯增多。見圖2。統計學分析結果顯示，與對照組比較，50～500 mg/L石菖蒲水提物能夠明顯抑制細胞形態變為梭型或多角形；10～500 mg/L石菖蒲水提物能夠顯著降低細胞分化率D1，說明其能抑制細胞長出突起；10 mg/L及50～500 mg/L石菖蒲水提物能夠明顯降低細胞分化率D2，說明藥物能夠顯著抑制細胞突起長出分支；100～500 mg/L石菖蒲水提物能夠顯著降低陽性細胞率，50～500 mg/L石菖蒲水提物還能明顯減少細胞突起長度，說明藥物能夠抑制細胞突起延伸。見表1。

圖2　低血清培養環境下石菖蒲水提物對細胞形態的影響(10×20倍)

注：同列含有相同右上標符號的組別相比較，P>0.05；同列不含相同右上標符號的組別相比較，P<0.05。3.3低血清培養環境下石菖蒲水提物對細胞增殖的影響低血清培養條件下，加入高濃度的石菖蒲水提物組細胞數量明顯增多。與對照組相比，50、100 mg/L石菖蒲水提物能夠明顯促進細胞活力(P<0.05)。見圖3。

注：含有相同右上標符號的組別相比較，P>0.05；不含相同右上標符號的組別相比較，P<0.05。

4討論

目前認為，石菖蒲的主要成分在于揮發油中，通常采用揮發油或者β-細辛醚作為實驗藥物，對水提液的研究尤其是在細胞水平上的研究甚少。但多個實驗研究都證明，石菖蒲的水提液和揮發油成分均能改善學習記憶能力[4]，說明水提液及揮發油成分中均含有改善學習記憶能力的物質。有文獻[5-6]報道，石菖蒲提取物能夠抑制缺血再灌注神經細胞的凋亡，具有顯著的神經保護作用，其揮發油中的主要成分β-細辛醚作用于PC12細胞后，高濃度組細胞形態發生變化，突起結構消失，細胞變圓，一定濃度的石菖蒲對PC12細胞和皮質神經細胞的增殖有促進作用。從本課題的實驗結果來看，石菖蒲水提物具有顯著的抑制細胞突起生長，促進細胞增殖的功能，與文獻報道有一定的相似性，說明石菖蒲的水提物和揮發油均具有神經營養的功能。石菖蒲的神經保護作用可能與其增強bcl-2基因的表達，防止神經細胞變性有關[7-8]。

本實驗中石菖蒲水提物具有顯著抑制細胞突起生長、延伸的功能，可能與本實驗采用的是石菖蒲的水提液有關。有文獻報道，石菖蒲水煎劑可以顯著提高小鼠腦內多巴胺和5-羥色胺的含量，說明石菖蒲水煎劑可能是通過降低單胺類神經遞質來起到鎮靜作用[9-10]。石菖蒲去油水煎液具有降低興奮性氨基酸，拮抗大鼠腦皮質N-甲基-D-天冬氨酸受體與其配體的結合，清除自由基，阻止過氧化物形成的功能[11-13]，提示石菖蒲水提物改善學習記憶能力是從突觸功能可塑性及抗氧化應激通路來實現的，可能并不通過改變突觸結構可塑性這一通路。

參考文獻：

[1]張于．老年癡呆中醫研究簡史[D]．哈爾濱：黑龍江中醫藥大學，2012：26-29.

[2]景玉宏，馮慎遠，湯曉琴．石菖蒲對學習記憶的影響及突觸機制[J]．中國中醫基礎醫學雜志，2002，8(6)：38-39．

[3]潘鄧記，張旻，楊明山．血清剝奪致PC12細胞死亡及對細胞周期的影響[J]．華中科技大學學報：醫學版，2004，33(5)：566-568．

[4]田素民，馬宇昕，孫靈芝，等．石菖蒲不同藥效部位改善阿爾茨海默病模型小鼠的認知功能[J]．中國病理生理雜志，2012，28(1)：159-162．

[5]陳奕芝，方永奇，王綺雯，等．β-細辛醚對PC12細胞和乳鼠皮層神經細胞形態學及細胞活力的影響[J]．中藥材，2007，30(3)：317-321．

[6]匡忠生，謝宇暉，李翎，等．石菖蒲提取液對腦缺血-再灌注誘導的神經細胞凋亡的保護作用[J]．廣東醫學，2002，23(5)：459-460．

[7]楊立彬，李樹蕾，黃艷智，等．石菖蒲及其有效成分α-細辛醚對癲癇幼鼠腦海馬神經元凋亡的影響[J]．中草藥，2006，37(8)：1196-1199．

[8]溫中京，陳海委．中藥石菖蒲提取物對記憶障礙小鼠模型的改善作用研究[J]．中華中醫藥學刊，2009，27(10)：2203-2205．

[9]張家?。兴帡椝?、龍齒、石曹蒲對小鼠腦內單胺類神經遞質及其代謝物的影響[J]．北京中醫藥大學學報，1995，18(6)：64．

[10]謝婷婷，王虹，劉屏．中藥石菖蒲對腦內單胺類神經遞質5-羥色胺水平的影響[J]．中國藥物應用與監測，2007，4(3)：15-17．

[11]唐洪梅，席萍，吳敏，等．石菖蒲對小鼠腦組織氨基酸類神經遞質的影響[J]．中藥新藥與臨床藥理，2004，15 (5)：310-311．

[12]唐洪梅，招榮鑑，鄧玉群．石菖蒲揮發油和水溶性成分對癲癇小鼠腦組織SOD、LPO、NO的影響[J]．中國藥師，2005，8(12)：983．

[13]匡忠生，江湧，李志強，等．石菖蒲提取成分對大鼠腦皮質NMDA、M受體與其配體結合的影響[J]．中藥新藥與臨床藥理，2010，21(4)：354-357．

收稿日期：(2014-10-22；編輯：姚實林)

作者簡介：姚娜(1987-)，女，碩士，技師

[中圖分類號]R285.5[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.02.022

基金項目：國家教育部博士點課題博導類項目(20120013110013)