番鴨A—FABP基因內含子多態性與生產性能的關聯分析

秦豪榮++董飚++孫國波等

摘要：采用PCR-SSCP技術對黑羽番鴨A-FABP基因內含子進行多態性檢測，分析多態性與早期體質量、屠宰性能、常規肉品質、肌肉營養成分等指標的相關性。結果表明：黑羽番鴨A-FABP基因第1內含子存在G921C單核苷酸突變，形成了HH、HI、II 3種基因型，H等位基因頻率為0.129 6，I等位基因頻率為0.870 4，群體純合度為0.774 3，多態信息含量為0.200 2；除2周齡公鴨II型體質量顯著高于HI型外，同性別黑羽番鴨早期體質量在不同基因型之間并無顯著差異；公鴨、母鴨均表現為II基因型腹脂質量、腹脂率顯著高于HI基因型，公鴨HI型肝質量、腺肌胃質量顯著高于II型，其他屠宰性能指標在同性別黑羽番鴨不同基因型之間無顯著差異；同性別黑羽番鴨II型胸肌中肌苷酸含量顯著高于HI型，膽固醇含量在不同基因型間無顯著差異；腿肌中同性別不同基因型間膽固醇、肌苷酸含量差異不顯著。綜合分析可知，A-FABP基因內含子1中921位的G-C突變會影響黑羽番鴨脂肪沉積能力、胸肌肌苷酸含量。

關鍵詞：黑羽番鴨；A-FABP基因；多態性；生產性能

中圖分類號： S834.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0030-04

收稿日期：2015-03-31

基金項目：江蘇省農業科技自主創新資金[編號：CX（14）2072]；江蘇省農業三新工程（編號：SXGC[2014]272）。

作者簡介：秦豪榮（1966—），男，山西稷山人，碩士，教授，主要從事水禽品種保護、開發和利用工作。E-mail：391248766@qq.com。目前，我國大部分地區所飼養的肉用型鴨主要是櫻桃谷鴨、北京鴨、番鴨等，均表現為生長速度快、飼料報酬高等特點，可以滿足多層次消費者的需求。其中番鴨原產于美洲中南部的熱帶地區，是棲鴨屬鴨種，與其他類型肉鴨不同屬。番鴨根據羽毛顏色分為白色、黑色、花色3種，其中白羽番鴨體型較大，花羽番鴨體型居中，黑羽番鴨體型較小。番鴨產肉獨特，具野禽風味特點，胴體脂肪含量低，但在番鴨產品加工和烹飪中，適當的脂肪沉積有利于增加鴨肉的風味和品質。禽類脂肪沉積是由遺傳、營養、飼養環境等因素決定的，其中遺傳是最基本的因素[1]。在遺傳因素中，與脂肪沉積相關的功能基因較多，如過氧化物酶體增殖劑激活受體、脂聯素基因、脂肪酸結合蛋白等，它們在脂肪沉積過程中起著重要作用，但是每個功能基因的作用又是微效的。

脂肪酸結合蛋白（fatty acid binding protein，FABP）是一類細胞內蛋白質，可以與脂肪酸結合將其運輸到脂肪酸氧化、甘油三酯及磷脂的合成位置，調節細胞內脂肪合成[2]。FABPs類型較多，其命名是根據分離出的第1種組織來確定的，目前至少有11種，脂肪型脂肪酸結合蛋白（A-FABP）基因就是首先在脂肪組織中被發現、在脂肪組織中高度表達的。櫻桃谷鴨內含子2中的4個單核苷酸突變會顯著影響腹脂質量、腹脂率、皮脂率和腿肌脂肪含量等指標，推測A-FABP基因與鴨脂肪代謝有著密切的關系[3]。A-FABP基因內含子1中T1074G、A1089C突變形成的基因型之間胸肌率、肌肉pH值以及胸肌肌內脂肪含量有顯著性差異[4]。A-FABP含量與雞肌內脂肪（IMP）含量有著密切的關系，A-FABP基因被作為肌苷酸（IMF）含量的候選基因，可影響肌肉的肉質[5-6]。禽類A-FABP基因與脂肪沉積、肌肉品質等方面的研究已經起步，但是其影響程度如何還需繼續開展此方面的工作。本研究運用單鏈構象多態性（SSCP）原理檢測黑羽番鴨A-FABP基因多態性，測定早期體質量、13周齡屠宰性能、常規肉品質和肌肉中營養成分等指標，分析A-FABP基因多態性與生產性能的關聯性，以期為鴨A-FABP基因功能研究提供資料。

1材料與方法

1.1試驗動物

選擇健康、同日齡出雛的黑羽番鴨公鴨96羽、母鴨66羽，分別佩戴翅號，混群飼養。0～3周齡封閉式舍飼育雛，所用飼料代謝能12.0 MJ/kg，粗蛋白質含量20.0%。4～13周齡半封閉式飼養，其中4～7周齡飼料代謝能11.5 MJ/kg，粗蛋白質含量16.5%；8～13周齡飼料代謝能11.0 MJ/kg，粗蛋白質含量16.0%。

1.2數據采集

1.2.1產肉性能測定測定黑羽番鴨初生、2、4、6、8、10、13周齡時體質量，測定13周齡時宰前活質量、屠體質量、半凈膛質量、全凈膛質量、腿肌質量、胸肌質量、肝質量、心質量、腺肌胃質量、腹脂質量等屠宰指標，各指標測定方法及其比例計算公式參考NY/T 823—2004《家禽生產性能名詞術語和度量統計方法》。

1.2.2肉質性能測定在13周齡時，測定胸肌和腿肌的失水率、剪切力（嫩度）及pH值等常規肉質性狀，測定方法參考NY/T823-2004《家禽生產性能名詞術語和度量統計方法》。肌肉中膽固醇的含量采用氣相色譜儀測定。肌苷酸含量采用索氏浸提法提取，用儀器進行HPLC分析。

1.3引物設計

根據A-FABP基因序列在第1、2內含子上分別設計了1對引物，用于多態性檢測（表1）。表1引物基本信息

1.4試驗步驟

1.4.1鴨基因組DNA的制備在13周齡時，每羽鴨翅靜脈采血1mL，肝素鈉抗凝，離心留取紅細胞。血液紅細胞在55 ℃下經過裂解液、SDS、蛋白酶K的混合液過夜消化，用常規酚/三氯甲烷法抽提和乙醇沉淀法獲取基因組DNA，待乙醇揮發后加水溶解，測定DNA質量后將其濃度調整為50～100 ng/μL備用。

1.4.2PCR擴增反應PCR反應體系：反應總體積為20 μL，各組分濃度為：1×buffer（含1.5 mmol/L Mg2+ ）、0.8 mmol/L dNTPs、上下游引物各0.4 pmol/L、0.04 U/μL Taq酶、4 ng/μL DNA模板，用蒸餾水調整確保各成分濃度。PCR反應程序為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸10 min，溫度降低至室溫。

擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，成像條帶清晰，與預期片段大小一致，可用于SSCP檢測。

1.4.3SSCP分析及測序5 μL PCR 產物和4 μL加樣緩沖液混勻（主要成分為去離子甲酰胺），98 ℃變性10 min，然后冰水浴5 min，變性后PCR產物用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳過夜，電壓根據條帶位置進行調整，銀染顯色，進行基因型判別。

對每種純合子基因型的PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠純化回收，通過克隆、測序等流程獲得不同基因型的DNA序列，通過比對獲知基因型之間核苷酸序列發生位置。

1.5數據處理

運用公式計算基因型頻率、等位基因頻率、純合度、雜合度和多態信息含量等遺傳參數，運用SPSS13.0軟件中的單因素方差分析法比較不同基因型間生產性能的差異程度。

2結果與分析

2.1基因型識別和序列比較

所設計的2對引物均可擴增出產物，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測發現條帶單一，經過聚丙烯酰胺凝膠電泳發現，引物P1存在多態性。黑羽番鴨部分樣品引物P1檢測結果見圖1，可以看出形成了3種基因型，分別命名為HH、HI、II。通過測序獲得HH、II純合子的序列，比對發現2個序列之間只有1個位點發生了堿基突變，為第1內含子第921處的G-C突變（圖2）。

2.2群體遺傳信息統計

在所測群體中HH型頻率為0.018 5，HI型頻率為0.222 2，II型頻率為0.759 3，H等位基因頻率為0.129 6，I等位基因頻率為0.870 4，群體純合度為0.774 3，雜合度為0.225 7，多態信息含量為0.200 2。

2.3不同基因型間體質量比較結果

由于公鴨、母鴨HH基因型數量小于3個，故沒有參與基因型和生產性能相關性分析。由表2可知，除2周齡公鴨II型體質量顯著高于HI型外，其他測定點公鴨不同基因型間無顯著性差異；各個測定點母鴨不同基因型間體質量均無顯著差異。

2.4不同基因型間屠宰性能比較結果

由表3可知，HI型公鴨肝質量、腺肌胃質量顯著高于II型公鴨，II型公鴨腹脂質量、腹脂率顯著性高于HI型公鴨，其他指標在公鴨不同基因型之間無顯著性差異。II型母鴨腹脂質量、腹脂率顯著性高于HI型母鴨，其他指標在母鴨不同基因型之間無顯著性差異。

2.5不同基因型間常規肉品質比較結果

由表4可知，HI型公鴨腿肌pH值顯著高于II型公鴨，其他指標在公鴨（或母鴨）不同基因型之間無顯著性差異。

2.6不同基因型間肌肉營養成分比較結果

由表5可知，II型黑羽番鴨胸肌中肌苷酸含量顯著高于同性別HI型，膽固醇在公鴨胸肌中無顯著差異；腿肌中同性別不同基因型間膽固醇、肌苷酸含量差異不顯著。

3結論與討論

在真核生物基因組序列中，只有少數序列在基因轉錄過程中通過一系列過程得以拼接形成能夠翻譯蛋白質的編碼區表5不同基因型間肌肉營養成分含量比較

性別基因型樣本量

（羽）胸肌腿肌膽固醇含量（mg/g）肌苷酸含量（mg/g）膽固醇含量（mg/g ）肌苷酸含量（mg/g）公鴨HI950.18±9.70b2.71±0.32b48.75±6.23a2.56±0.45bII3357.53±9.72ab3.44±0.57a53.98±8.55a2.88±0.78ab母鴨HI1251.82±10.81ab2.46±0.55b49.27±6.97a3.03±0.54abII3058.48±10.86a3.26±0.42a55.09±9.51a3.36±0.54a

序列，而絕大部分序列作為非編碼區序列被切除。研究者發現，基因組中非編碼序列的比例與生物的復雜度成正比[7]。內含子就是非編碼區序列之一，雖然不能直接編碼蛋白質，但是在轉錄和翻譯過程中對基因的表達具有調控作用，還可增強生物對基因突變耐受力，提高物種生存能力[8]。內含子潛在的作用備受廣大研究者的青睞，相關研究已經開展。本試驗在A-FABP基因內含子1、2上各設計了1對引物，采用PCR-SSCP方法檢測了黑羽番鴨A-FABP基因存在的單核苷酸多態，結果在第1內含子第921處發現了G-C突變，形成了HH、HI、II 3種基因型，其中HH基因型含量較低，II基因型含量較高，I等位基因頻率是H型的7倍，占據明顯優勢，其原因可能是在黑羽番鴨培育過程中由于生產性能方面指標的選育使I等位基因頻率被間接地提高了。遺傳參數分析顯示，群體純合度為0.774 3，雜合度為0.225 7，多態信息含量為0.200 2，群體雜合度和多態信息含量數據反映了黑羽番鴨該位點呈現低度多態，此位點的變異程度小，可進行選擇的空間窄。通過常規的育種方法間接提高II型的比例難度很大，但是用分子標記技術可以檢測每羽鴨的基因型，根據需要選擇公、母鴨進行配種得到理想的基因型個體。

動物A-FABP可以作為體內甘油三酯的貯存庫，通過儲存或釋放出大量的脂肪酸來調控甘油三酯的形成和脂解，從而參與脂生產及脂解的生化循環[9-10] 。羅桂芬等報道A-FABP基因突變對雞脂肪沉積有顯著影響[11]。Wang等研究發現 A-FABP 多態性與體質量、腹脂率的關系，表明 A-FABP基因的變異與腹脂率顯著相關[12]。本試驗結果顯示，黑羽番鴨早期體質量在不同基因型之間并無顯著差異；在屠宰性能方面，公鴨和母鴨均表現為II基因型腹脂質量、腹脂率顯著高于HI基因型，公鴨HI型肝質量、腺肌胃質量顯著高于II型，其他屠宰性能指標在同性別不同基因型之間無顯著差異，揭示了A-FABP基因該位點多態性與黑羽番鴨脂肪沉積能力有著密切的關系。

肌肉品質分析包括了常規肉品質和肌肉中營養成分分析。本試驗常規肉品質測定了胸肌、腿肌的pH值、剪切力、失水率 3個指標，發現只有公鴨腿肌pH值在不同基因型之間存在顯著差異，其他指標在同性別不同基因型之間均無顯著差異。肌苷酸是肉質鮮味的重要成分，是衡量肉質鮮味的一項重要指標[13]。在動物被屠宰后，肌肉中ATP酶活化分解ATP成為ADP，ADP在多種酶的作用下生產肌苷酸，并進一步水解產生次黃嘌呤和核糖。肌肉中次黃嘌呤核苷酸及其他分解產物的積累可增加肉的鮮味[14]。膽固醇是人體維持正常生理活動的必需物質，但是過量攝入膽固醇會使血液中膽固醇含量升高，引起心腦血管疾病。本試驗發現，II型黑羽番鴨胸肌中肌苷酸含量顯著高于同性別HI型，公鴨胸肌中膽固醇含量在不同基因型之間無顯著差異；腿肌中同性別不同基因型間膽固醇、肌苷酸含量差異不顯著，說明A-FABP基因內含子1存在多態性對胸肌中膽固醇、肌苷酸含量有顯著影響。

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