木質素降解酶系在畢赤酵母中的表達及降解木質素的活性

劉金雷　劉天佳　于瑩等

摘要：自然界中的木質素是潛在的豐富的可再生資源，近年來利用生物法降解木質素成為研究的熱點。利用RT-PCR克隆了黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）木質素過氧化物酶基因（LiP）、錳過氧化物酶基因（MnP）、黑曲霉（Asperillus niger）葡萄糖氧化酶基因（gox）及白腐真菌（White Rot Fungi）漆酶基因（Lac），并構建了畢赤酵母（Pichia pastoris）表達載體，電轉化入Pichia pastoris X-33宿主菌中，獲得轉化子并進行微培養，通過測定培養液的酶活，篩選出高酶活菌株。對4種重組菌株進行發酵，以經過處理的玉米皮作為底物，分別加入4種酶的發酵液及4種酶的混合液，于30 ℃反應后測定不同反應時間木質素的降解量，反應24h，木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶、葡萄糖氧化物酶、漆酶吸光度D280nm的降低幅度分別為45%、39%、9%、57%；復合酶降解木質素的活性明顯高于單一酶，吸光度的降低幅度為78%，說明木質素降解酶系的相互協同作用，提高了木質素的降解效率，為木質素酶解提供了新方法。

關鍵詞：木質素；降解酶系；新方法；異源表達；畢赤酵母；酶活性

中圖分類號： S188+.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0058-05

收稿日期：2014-11-16

作者簡介：劉金雷（1988—），男，河北邯鄲人，碩士研究生，研究方向為分子定向進化與生物催化。E-mail：1060083086@qq.com。

通信作者：李天明，碩士，助理研究員，研究方向為分子定向進化與生物催化。E-mail：iamltm2000@hotmail.com。木質素是一種豐富的天然可再生的有機高分子化合物，廣泛存在于植物體中，它包圍著纖維素，和半纖維素一起填充于微原纖維之間，與纖維素、半纖維素一起構成植物細胞壁的主要成分，是自然界中植物光合作用制造的總量僅次于纖維素的碳素資源[1]。據估計，全世界每年由植物生長產生的木質素達1 500億t，其中造紙工業廢液中產生的工業木質素有3 000萬t[2]，因此對大自然給予人類的木質素等豐富的可再生天然資源予以充分重視并加以研究和利用，對于可持續發展具有重要意義。

木質素的結構復雜，不易分解[3-4]，從20世紀開始，國內外的學者一直尋找木質素降解的最佳途徑，研究內容主要包括物理法、化學法、物理化學法、生物降解法[5]。木質素的微生物降解不僅可以緩解環境污染、變廢為寶，而且對生物質資源的充分利用有重大的現實意義，因此對木質素的生物降解已經成為當今世界國內外學者的研究熱點[6-9]。木質素的降解是由一系列酶協同完成的，目前已知，在降解木質素過程中起主導作用的主要是漆酶（laccase，LAC）、木質素過氧化物酶（lignin peroxidase，LIP）、錳過氧化物酶（manganese peroxidase，MNP）這3種酶[10]。此外，葡萄糖氧化酶（glucose 1-oxidase，GO）、芳醇氧化酶（aryl-alcohol oxidase，AAO）、乙二醛氧化酶（gyoxaloxidase，GLOX）等也對木質素的降解產生一定的影響或者直接參與其降解[11]。

木質素降解的相關酶最早是在白腐真菌的胞外培養液中發現的，近年來隨著國內外學者對木質素降解酶系的研究進展，發現在自然界中木質素的降解是由真菌、細菌、放線菌三者共同作用的結果，其中真菌起主要作用[12]。自然界中降解木質素能力最強的一類真菌是白腐菌[13-16]，白腐菌雖然有廣譜的酶系統，但是由于其生理代謝的特殊性以及近乎苛刻的對環境因子的要求，對于實現工業化產酶產生了嚴重阻礙。隨著分子生物學的發展，基因工程菌的構建和木質素酶系的異源表達成為從根本上解決這一問題的一種可能的途徑。本研究主要利用基因重組技術，利用畢赤酵母（Pichia pastoris）分泌表達了不同來源的木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、漆酶基因，利用工程菌的發酵液降解天然木質素，并通過木質素降解酶系的協同作用，增強了木質素的降解效率，為木質素酶解提供了新方法。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌種和質粒大腸桿菌Trans 5α菌株購自北京全式金生物技術有限公司，P. pastoris X-33菌株和表達質粒pGAPZαA由河北科技大學分子生物學實驗室保存，黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）、黑曲霉（Asperillus niger）、白腐真菌（White Rot Fungi）為筆者所在實驗室保藏的野生型菌株。

1.1.2培養基LB、YPDS、YPD培養基均按照《Invitrogen公司操作手冊》推薦的方法配制。

1.1.3試劑限制性內切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、BcabestTM RNA PCR試劑盒，購自寶生物工程（大連）有限公司（TaRaKa）；Trizol Reagent，購自Gibco公司；DNA回收試劑盒、質粒提取試劑盒、瓊脂糖，購自天根生化科技（北京）有限公司；PMD-18克隆載體，購自北京全式金生物技術有限公司；PCR引物由上海英駿生物技術有限公司合成；DNA測序由寶生物工程（大連）有限公司完成。如無特別說明，所有的化學試劑均為分析純產品。

1.2試驗方法

1.2.1基因的操作質粒提取、酶切反應、DNA片段回收、連接以及大腸桿菌轉化等均參照試劑盒提供的方法進行操作。

1.2.2基因的克隆采用液氮研磨-SDS法提取黃孢原毛平革菌、黑曲霉和白腐真菌總RNA，以合成的cDNA第1鏈為模板進行PCR擴增，PCR產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，純化PCR產物，與PMD-18連接，構建PMD-18-LiP、PMD-18-MnP、PMD-18-gox、PMD-18-Lac質粒，轉化E.coli Trans5α感受態細胞，涂布于含150 μg/L 氨芐青霉素、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、X-gal的LB平板，37 ℃培養過夜。挑取白色菌落，提質粒，PCR驗證，對陽性克隆進行DNA序列測定。

1.2.3重組表達載體的構建載體pGAPZαA用EcoRⅠ、KpnⅠ雙酶切，產生的3.1 kbDNA片段用DNA回收試劑盒回收純化。以測序驗證正確的含有Lac基因的PMD-18-Lac質粒作模板PCR，PCR片段用EcoRⅠ、KpnⅠ雙酶切，1.5 kb片段用上述方法純化，將片段與用EcoRⅠ/KpnⅠ酶切后的pGAPZαA片段用T4連接酶于16 ℃過夜連接；連接液轉化E.coli Trans5α，涂布于含有博萊霉素（Zeocin）（100 mg/L）的LB平板上，37 ℃培養過夜，隨機選取轉化子提取質粒，PCR分子驗證，PCR驗證正確的轉化子用EcoRⅠ、KpnⅠ雙酶切再次驗證，將重組質粒送相應公司測序。LiP、MnP、gox、Lac基因表達載體的構建方法一樣，只是酶切位點不同，LiP基因的酶切用EcoRⅠ/NotⅠ，MnP基因的酶切用EcoRⅠ/NotⅠ，gox基因的酶切用KpnⅠ/NotⅠ，Lac基因的酶切用EcoRⅠ/KpnⅠ，從而得到表達載體GAPZαA-LiP、pGAPZαA-MnP、pGAPZαA-gox、pGAPZαA-Lac。

1.2.4酶活測定

1.2.4.1木質素過氧化物酶（LIP）酶活的測定[17]2 mL反應體系中含0.4 mL發酵液（或稀釋酶液）、10 mmol/L藜蘆醇、50 mmol/L酒石酸緩沖液（pH值2.5），加入0.4 mmol/L H2O2 啟動反應，30 ℃反應2 min后，以不加發酵液、用蒸餾水補齊的2 mL反應液作對照，用酶標儀在310 nm處測定吸光度D310 nm。

1.2.4.2錳過氧化物酶（MNP）酶活的測定[18]2 mL反應體系中含0.4 mL 發酵液（或稀釋酶液）、100 μmol/L MnSO4、0.01%苯酚紅、0.1%牛血清蛋白、25 mmol/L乳酸鋰、50 mmol/L 酒石酸緩沖液（pH值4.5），加入0.1 mmol/LH2O2 啟動反應，于30 ℃反應5 min后，加入100 μL 2mol/L NaOH溶液終止反應，以先加終止劑的作對照，測610 nm處的吸光度D610 nm。

1.2.4.3葡萄糖氧化酶（GO）酶活的測定[19]5 mL反應體系含0.7 mL發酵液（或稀釋酶液）、0.04 mol/L葡萄糖、3 mL 0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH值 4）、1.3 mL靛藍胭脂紅溶液（1.0×10-3 mol/L），于37 ℃條件下反應10 min，再于100 ℃水浴13 min，用流水冷卻5 min以終止反應，以不加發酵液用蒸餾水補齊的等量體系作對照，測615 nm處的吸光度D615 nm。

1.2.4.4漆酶（LAC）酶活的測定[20-21]3 mL反應體系中含有2.95 mL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（pH值3.4）、1 mL 1 mol/L ABTS、0.05 mL稀釋后的酶液，于25 ℃反應3 min后，對照為未加ABTS同體積的反應混合液，用酶標儀在420 nm下測定吸光度D420 nm。

1.3畢赤酵母重組菌株的獲得及鑒定

將重組質粒用BspH I酶切，使其完全線性化，電擊轉化至畢赤酵母X33感受態細胞中，感受態細胞及電轉化過程參照《Invitrogen公司操作手冊》[22]。電轉化液均勻涂布到含100 mg/L Zeocin的YPDS培養基上，于30 ℃培養2～3 d至長出重組子。將平板上生長的重組子分別挑取到含有3 mL YPD培養基的24孔板中，于30 ℃、200 r/min搖床培養，漆酶重組菌株培養5 d，木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶、葡萄糖氧化酶重組菌株培養3 d，根據上述方法測定酶活。高溫裂解高酶活酵母轉化子，獲得其DNA，以此為模板，用目的基因引物進行PCR擴增，用瓊脂糖電泳進行鑒定。

1.4重組菌株對天然木質素玉米皮的酶解

將木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、漆酶的重組酵母工程菌株和轉有空質粒的對照酵母菌株于25 mL YPD培養基中30 ℃振蕩培養（200 r/min），木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶及葡萄糖氧化酶工程菌株培養3 d，漆酶工程菌株及轉有空質粒的對照酵母菌株培養5 d，4 000 r/min離心 5 min，得到上清液。取1 mL 5株菌的上清液加入到4mL經0.1 mol/L氫氧化鈉溶液預處理的玉米皮上清液中，另各取250 μL木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、漆酶的工程菌株發酵上清液混合，加入到4 mL用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液浸泡24 h的玉米皮上清液中，置于 30 ℃ 恒溫培養箱中降解木質素。用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調零，于280 nm處測吸光度D280nm，吸光度的降低值表征木質素的降解量。為了降低誤差，平行做3組玉米皮的酶解試驗。

2結果與分析

2.1LiP、MnP、gox、Lac基因表達載體的構建及序列測定和分析

LiP基因的純化回收片段與載體pGAPZαA用EcoRⅠ/NotⅠ酶切，MnP基因的純化回收片段用EcoRⅠ/NotⅠ酶切，gox基因的純化回收片段用KpnⅠ/NotⅠ酶切，Lac基因的純化回收片段用EcoRⅠ/KpnⅠ酶切。T4連接酶于16 ℃過夜連接，連接液轉化到感受態細胞E.coli Trans5α，構建pGAPZαA-LiP、pGAPZαA-MnP、pGAPZαA-gox、pGAPZαA-Lac質粒。挑選陽性克隆，提質粒，分別用4種基因的限制性內切酶對構建的質粒進行酶切驗證，從圖1可以看出，LiP、MnP、gox、Lac基因與載體連接成功；重組陽性質粒pGAPZαA-LiP、pGAPZαA-MnP、pGAPZαA-gox、pGAPZαA-Lac經測序結果表明，LiP基因長1 003 bp，MnP基因長1 100 bp，gox基因長1 963 bp，Lac基因長1 563 bp。將基因序列用DNAclub翻譯為氨基酸序列后，在NCBI數據庫中進行Blast比對，LiP、MnP基因與黃孢原毛平革菌的同源性達100%，gox基因與黑曲霉的同源性達100%，Lac基因與白腐真菌的同源性達100%，說明構建pGAPZαA-LiP、pGAPZαA-MnP、pGAPZαA-gox、pGAPZαA-Lac成功。

2.2轉化與高表達工程菌株的篩選

用電轉化方法分別將重組表達載體pGAPZαA-LiP、pGAPZαA-MnP、pGAPZαA-gox、pGAPZαA-Lac和空載體pGAPZαA轉化到畢赤氏酵母中，電轉化液均勻涂布到YPDS培養基上，Zeocin濃度為100 mg/L，在平板上分別獲得轉化子。采用24孔板微培養抗性轉化子，以酶活性為篩選指標，依據上述測定酶活方法等比例縮小反應體系為200 μL，采用96孔板測定吸光度，篩選陽性轉化子。木質素過氧化物酶工程菌株發酵3 d，共篩選了561個轉化子，篩選出酶活力較大且酶活穩定的2株工程菌株（表1）；錳過氧化物酶工程菌株發酵3 d，共篩選了632個轉化子，篩選出酶活力較大且酶活穩定的5株工程菌株（表2）；葡萄糖氧化酶發酵3 d，共篩選了731個轉化子，篩選出酶活力較大且酶活穩定的2株工程菌株（表3）；漆酶發酵5 d，測定酶活，共篩選了863個轉化子，篩選出酶活力較大且酶活穩定的3株工程菌株（表4）。

2.3工程菌株的鑒定

篩選出的酶活較高的工程菌株經分離純化后，用PCR方法對篩選得到的工程菌株進行鑒定，pGAPZαA-LiP轉化畢赤酵母X-33所得到的陽性轉化子的PCR鑒定結果見圖2；pGAPZαA-MnP轉化畢赤酵母X-33所得陽性轉化子的PCR鑒定結果見圖3；pGAPZαA-gox轉化畢赤酵母X-33所得陽性轉化子的PCR鑒定結果見圖4；pGAPZαA-Lac轉化畢赤酵母X-33所得陽性轉化子的PCR鑒定結果見圖5。

2.4單一酶和復合酶對天然木質素的降解效果

玉米皮水溶性差，直接加入降解酶會影響酶的降解效果，OH-能夠減弱纖維素與半纖維素之間的氫鍵，并且皂化半纖維素與木質素分子之間的酯鍵，使木質素釋放出玉米皮結構組織，因此應先將玉米皮用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液浸泡24 h。將高酶活表達的木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、漆酶基因的工程菌株發酵液于4 000 r/min離心，取上清液。將4種酶及轉有空質粒的對照酵母菌株的上清液分別加入玉米皮上清液中，將4種酶的上清液等比例配

合后也加入到玉米皮的上清液中，置于30 ℃的恒溫培養箱中降解木質素，用酶標儀在280 nm處測0、6、12、18、24 h的吸光度，吸光度的下降幅度表征木質素的降解量，詳見圖6。根據木質素降解造成的吸光度遞減數據可知，4種酶均對木質素有一定的降解作用，其中木質素過氧化物酶、漆酶的降解活性高于錳過氧化物酶、葡萄糖氧化酶；木質素與過氧化物酶、錳過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、漆酶反應24 h，D280nm的降低幅度分別為45%、39%、9%、57%，復合酶降解木質素的活性明顯高于單一酶，D280nm的降低幅度為78%，說明復合酶增強了木質素的降解效率。

3討論

Raymond報道用Pichia methanolica表達系統表達木質素過氧化物酶，產生的蛋白量達到500 mg/L[23]；國際上亦曾報道畢赤酵母中漆酶基因的最高酶活達到11.5 U/mL[24]；關于錳過氧化物酶基因在Pichia pastoris中異源表達的報道較少，Gu等在2000年發表的會議論文中報道，重組錳過氧化物酶的酶活力為7 U/L[25]。目前，葡萄糖氧化酶的研究主要集中在來源于青霉和黑曲霉的基因，Whittington等在釀酒酵母中成功表達了來源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶基因[26-27]；母敬郁等采用瑞式木霉表達了黑曲霉來源的葡萄糖氧化酶基因[28]；國內外的研究人員也在畢赤酵母中成功表達了來源于青霉和黑曲霉的葡萄糖氧化酶基因[29-30]。本研究采用RT-PCR方法克隆了黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）來源的木質素過氧化物酶基因（LiP）、錳過氧化物酶基因（MnP），黑曲霉（Asperillus niger）來源的葡萄糖氧化酶基因（gox）及白腐真菌（White Rot Fungi）來源的漆酶基因（Lac），氨基酸序列與NCBI報道的同源性達到100%。

對于木質素降解酶系的異源表達，研究人員嘗試了不同的表達系統，包括昆蟲桿狀病毒表達系統、大腸桿菌表達系統、黑曲霉表達系統以及酵母表達系統[31]。結果表明，相比較而言木質素降解酶系在酵母中的表達比較成功。釀酒酵母是最早用于表達的酵母菌，但它有一定的局限性，因此科研工作者將焦點轉移到畢赤酵母上，畢赤酵母有其他表達系統不可比擬的優勢，它既有原核生物易于培養、生長速度快、培養基廉價和試驗過程簡單等特點，而且有強有力的啟動子，可對異源蛋白進行加工折疊和翻譯后修飾，然后分泌到胞外，具有典型的真核生物表達體系的特點[32]。畢赤酵母表達系統表達量高，易于大規模培養，同時生產成本低，能進行蛋白質翻譯后修飾，且生物安全性高，到目前為止已經有超過500種蛋白在畢赤酵母中得到了高效表達[33]。隨著畢赤酵母基因測序工作的完成[34]，畢赤酵母的代謝調控信息會更加明晰，所以重組蛋白的畢赤酵母表達系統會得到進一步的發展。本研究分別構建了4種酶的畢赤酵母表達載體，轉化宿主X33，采用24孔板微培養轉化子，再利用酶標儀測定酶活力，高酶活菌株再做PCR進一步確認，提高了篩選效率，建立了1種簡單快速、高通量篩選方法，提高了異源蛋白在畢赤酵母中表達的效率。

本研究利用畢赤酵母成功分泌表達了漆酶、木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶和葡萄糖氧化酶，借鑒其他研究者酶活的測定方法，采用特定底物，都分別表現了各自的酶活性。與其他研究者不同的是，本研究采用了玉米皮作為底物，與4種酶的發酵液及其混合液反應，研究其發酵液對天然木質素的降解效果。試驗結果顯示，4種酶對玉米皮中的木質素成分均有降解作用，而且復合酶的酶活水平比單一酶的酶活明顯提高，降解效率提高了2倍左右。木質素降解酶系的協同作用，提高了木質素的降解效率，這在國內外相關研究中未見報道，為探索木質素酶解的新方法、新途徑提供了一個全新思路。

參考文獻：

[1]Leonowicz A，Cho N S，Luterek J，et al. Fungal laccase：properties and activity on lignin[J]. Journal of Basic Microbiol，2001，41（3/4）：185-227.

[2]Karels A E，Niemi A. Fish community responses to pulp and paper mill effluents at the southern Lake Saimaa，Finland[J]. Environmental Pollution，2002，116（2）：309-317.

[3]趙紅霞，楊建軍，詹勇. 白腐真菌在秸稈作物資源開發中的研究[J]. 飼料工業，2002（11）：40-42.

[4]Kersten P，Dan C. Extracellular oxidative systems of the lignin-degrading Basidiomycete Phanerochaete chrysosporium[J]. Fungal Genetics and Basidiomcete，2006，44（2）：77-85.

[5]楊長軍，汪勤，張光岳. 木質纖維素原料預處理技術研究進展[J]. 釀酒科技，2008，03（3）：85-89.

[6]Dashtban M，Schraft H，Syed T A，et al. Fungal biodegradation and enzymatic modification of lignin[J]. International Journal of Biochemistry and Molecular Biology，2010，1（1）：36-50.

[7]Xu C，Ma F，Zhang X，et al. Biological pretreatment of corn stover by Irpex lacteus for enzymatic hydrolysis[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58（20）：10893-10898.

[8]Qu Y，Wu D，Lan J，et al. High efficient degradation of dyes with lignin peroxidase coupled with glucose oxidase[J]. Journal of Biotechnology，2006，123（4）：483-490.

[9]Strom P F. Identification of thermophilic bacteria in solid-waste composting[J]. Applied and Environmental Microbiology，1985，50（4）：906-913.

[10]Kirk T K，Cullen D. Environmentally friendly technologies for the pulp and paper industry[M]. New York：John Wiley and Sons Inc，1997：273-300.

[11]張輝，戴傳超，朱奇，等. 生物降解木質素研究新進展[J]. 安徽農業科學，2006，34（9）：1780-1784.

[12]劉晨娟，蔡皓，李慶，等. 桑粒肩天牛腸道木質纖維素分解細菌的分離和鑒定[J]. 化學與生物工程，2010（7）：66-68，91.

[13]任克寧，張福元. 木質素酶及其生產菌株選育的研究進展[J]. 飼料與畜牧，2010（6）：36-39.

[14]許云賀，張莉力，曹新民. 秸稈利用中白腐真菌的作用研究[J]. 安徽農業科學，2008，36（34）：15172-15173.

[15]劉坤，李會宣，李敬. 白腐真菌菌株共培養降解玉米秸稈的研究[J]. 安徽農業科學，2008，36（4）：1327-1329.

[16]李春鳳，王力生. 白腐真菌降解木質素酶系特性及其應用[J]. 現代農業科技，2009（11）：274-275.

[17]Tien M，Kirk T K. Lignin-degrading enzyme from Phanerochaete chrysosporium：Purification，characterization，and catalytic properties of a unique H2O2-requiring oxygenase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1984，81（8）：2280-2284.

[18]Kuwahara M，Glenn J K，Morgan M A，et al. Separation and characterization of two extracellular H2O2-dependent oxidases from ligninolytic cultures of Phanerochaete chrysosporium[J]. FEBS Letters，1984，169（2）：247-250.

[19]Keyser P，Kirk T K，Zeikus J G. Ligninolytic enzyme system of Phanaerochaete chrysosporium：synthesized in the absence of lignin in response to nitrogen starvation[J]. Journal of Bacteriology，1978，135（3）：790-797.

[20]Niladevi K N，Sukumaran R K，Jacob N，et al. Optimization of laccase production from a novel strain-Streptomyces psammoticus using response surface methodology[J]. Microbiological Research，2009，164（1）：105-113.

[21]Pazarliogˇlu N K，Sarii

瘙 塂 ik M，Telefoncu A. Laccase：production by Trametes versicolor and application to denim washing[J]. Process Biochemistry，2005，40（5）：1673-1678.

[22]Tien M，Kirk T K. Lignin-Degrading enzyme from the hymenomycete phanerochaete chrysosporium burds[J]. Science，1983，221（4611）：661-663.

[23]Raymond C K. Recombinant protein expression kit in Pichia methanolica[J]. Gene Expression Systems，1999：4-5.

[24]Hong F，Meinander N Q，Jnsson L J. Fermentation strategies for improved heterologous expression of laccase in Pichia pastoris[J]. Biotechnology and Bioengineering，2002，79（4）：438-449.

[25]Gu L，Kelly C，Lajoie C. Cloning of the white rot fungus Phanerochaete chrysosporium manganese peroxidase gene （MnP2）into the methylotrophic yeast Pichia pastoris[C]//Wood and Cellulose：Building Blocks for Chemicals，Fuels and Advanced Materials. Syracuse，New York，USA：Second Annual Partnerships for Environmental Improvement and Economic Development Conference，2000：19-31.

[26]Whittington H，Kerry-Williams S，Bidgood K，et al. Expression of the Aspergillus niger glucose oxidase gene in A. niger，A. nidulans and Saccharomyces cerevisiae[J]. Current Genetics，1990，18（6）：531-536.

[27]Frederick K R，Tung J，Emerick R S，et al. Glucose oxidase from Aspergillus niger. Cloning，gene sequence，secretion from Saccharomyces cerevisiae and kinetic analysis of a yeast-derived enzyme[J]. The Journal of Biological Chemistry，1990，265（7）：3793-3802.

[28]母敬郁，王嶠，楊純中，等. 瑞氏木霉表達黑曲霉葡萄糖氧化酶[J]. 生物工程學報，2006（1）：82-86.

[29]周亞鳳，張先恩，劉虹，等. 黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其在酵母中的高效表達[J]. 生物工程學報，2001，17（4）：400-405.

[30]Crognale S，Pulci V，Brozzoli V，et al. Expression of penicillium variabile P16 glucose oxidase gene in Pichia pastoris and characterization of the recombinant enzyme[J]. Enzyme and Microbial Technology，2006，39（6）：1230-1235.

[31]Jin F L，Xu X X，Yu X Q，et al. High-level expression of active recombinant ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase of Drosophila melanogaster in Pichia pastoris[J]. Protein Expression and Purification，2009，65（2）：115-121.

[32]Otterbein L，Record E S，Asther M，et al. Molecular cloning of the cDNA encoding laccase from Pycnoporus cinnabarinus 1-937 and expression in Pichia pastoris[J]. European Journal of Biochemistry，2000，267（6）：1619-1625.

[33]Macauley-Patrick S，Fazenda M L，Mcneil B，et al. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system[J]. Yeast，2005，22（4）：249-270.

[34]de Schutter K，Lin Y C，Tiels P，et al. Genome sequence of the recombinant protein production host Pichia pastoris[J]. Nature Biotechnology，2009，27（6）：561-566.孟婷婷，彭艷玲，王鈺璽，等. 烏拉爾甘草懸浮細胞培養物有效成分的提取[J]. 江蘇農業科學，2015，43（11）：63-66.