甘肅地區“平涼45號”冬小麥NRX基因的克隆及表達分析

朱占東， 劉學鋒，柴守璽*　(.甘肅農業大學農學院，甘肅蘭州 730070；.新疆生產兵團第十四師一牧場，新疆和田 848306)

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甘肅地區“平涼45號”冬小麥NRX基因的克隆及表達分析

朱占東1， 劉學鋒2，柴守璽1*(1.甘肅農業大學農學院，甘肅蘭州 730070；2.新疆生產兵團第十四師一牧場，新疆和田 848306)

硫氧還蛋白(thioredoxin,TRX)作為一類多功能蛋白廣泛存在于植物各種組織器官中，在植物光合作用過程中起重要作用，參與該過程中體內活性氧的清除、被氧化蛋白質的修復、電子傳遞等活動[1-4]。同時，TRX基因參與植物抗氧化脅迫過程、抗旱以及耐熱機制的調控，同時還參與調節抗逆基因的表達[5]。Laughner等[6]首次從玉米植株中分離得到核氧還蛋白(nucleoredoxin, NRX)，結果發現該基因編碼蛋白為TRX家族新成員，而且該蛋白三級結構包含3個TRX活性功能區；夏德習等[7]研究表明，利用H2O2處理擬南芥后，硫氧還蛋白中的M1型基因((AtTRXm1)表達量明顯上升，說明該蛋白與氧化脅迫過程有關。另外，Broin等[8]研究發現，CDSP32蛋白屬于干旱誘導蛋白，二級結構存在與 TRX蛋白類似的2個肽序列。因此該蛋白屬于TRX超家族成員，研究表明該蛋白可以緩解由于干旱而引起的氧化脅迫。目前關于TRX超家族基因所參與的代謝途徑和功能表達機理尚不清楚，而且在其他植物種類中也未見該基因的相關報道。

2004年甘肅地區小麥播種面積接近130 萬hm2[9]，其中隴東地區冬小麥的播種面積和總產值分別占全省的53%和48%[10]。甘肅地區地形復雜，常年雨水量偏少、干旱是影響甘肅地區小麥生產的重要因素[11]，嚴重威脅著該地區小麥生產。

筆者以甘肅地區優良雜交種“平涼45號”冬小麥為材料，對TRX家族成員進行克隆，并利用生物信息學手段，分析其相關的結構信息，以期為選育優良的小麥品種提供依據，以保障該區域糧食生產的持續穩定發展和滿足人民生活的供給需求。

1材料與方法

1.1材料“平涼45號”冬小麥種子購買于甘肅省平涼市農牧局，通風干燥條件室溫保存。

EasyTaqPCR SuperMix、dNTPs、EasyPure Quick Gel Extraction Kit、pMD19-T克隆載體、TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix、DNA marker購自全式金生物技術有限公司(北京)；大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α菌株由甘肅農業大學干旱作物重點實驗室保存，大腸桿菌感受態細胞為甘肅農業大學干旱作物重點實驗室制備。

1.2方法

1.2.1總RNA提取和cDNA的合成。 將“平涼45號”冬小麥的種子經除菌處理后，接種在鋪有MS培養基的三角瓶內，放入光照培養箱中，20 ℃暗培養至苗高15 cm左右，300 μmol/(m2·s)光照培養2 d，采集葉片用Trizol試劑盒(購自TaKaRa公司)提取總RNA，每個樣品采集3個重復。

取小麥葉片，放在含有液氮的研缽中并迅速研磨至粉末狀，然后轉移到1.5 ml EP管中并立即加入1 ml TRIzol提取總RNA，操作步驟按TRIzol試劑盒說明書進行，然后將RNA保存于超低溫冰箱。取小麥總RNA 4 μl通過反轉錄試劑盒進行反轉錄，合成cDNA。20 μl反應體系：4 μl 總RNA，TransScript* RT/RI Enzyme Mix 1 μl，2×TS Reaction Mix 10 μl，Anchored Oligo(dT)18 1 μl，然后用無RNA酶水補齊20 μl。該體系反應條件按照說明書進行。

1.2.2PCR擴增。檢索相關文獻，得到普通小麥TaNRX基因的信息。搜索NCBI得到該基因的核酸序列與蛋白序列信息，根據核酸序列設計引物，結合Primer 3軟件(http://frodo.wi.mit.edu/)，設計引物序列(表1)。

表1　TaNRX家族基因引物序列

以“平涼45號”冬小麥葉片材料反轉錄cDNA為模板，20 μl反應體系：小麥cDNA1 μl， EsTaqMix 10 μl，上游引物和下游引物各0.5 μl， 雙蒸水8 μl；在MG96+型PCR儀上進行PCR反應。其反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2min，30個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存；然后對擴增產物進行檢測。

1.2.3目的片段回收及克隆。采用EasyPure Quick Gel Extraction Kit(購自全式金)純化回收目的條帶，按照3∶1比例與pMD19-T Vector載體混合，4 ℃孵育過夜；然后利用感受態細胞將連接產物轉化到大腸桿菌DH5α中進行培養，隨機選取12個大小適中的白色菌落進行鑒定并測序。

1.2.4生物信息學分析。通過Clustalx軟件比對分析測序后的核酸序列，同時作進化樹分析。通過ProtParam軟件在線分析NRX基因編碼蛋白質的理化性質；通過TMHMM Server V.2.0在線預測NRX基因的跨膜結構；通過SignalP 3.0 Server 軟件預測編碼蛋白質的信號肽序列；同時，通過SOPMA軟件對NRX基因編碼蛋白的二級結構進行預測。

1.2.5NRX基因定量表達檢測。取“平涼45號”冬小麥不同器官，每個器官設置3個重復。分別提取RNA，反轉錄合成cDNA，用熒光定量PCR試劑盒進行不同器官的定量檢測。通過FL-3000 Realtime PCR 系統，以小麥延伸因子EF1( elongation factors 1)基因為內參基因[12]，每個樣品使用3個重復，最后通過2-ΔΔCt法[13]計算基因相對表達。

2結果與分析

2.1小麥總RNA提取以及反轉錄將新鮮樣品用液氮研磨，隨后用TRIzol提取RNA，經微量紫外分光光度計測定OD260/OD280為1.92，濃度為753 ng/μl。取4 μl RNA樣品進行反轉錄，合成cDNA。用延伸因子EF1(elongation factors 1)引物進行PCR，電泳檢測條帶清晰，大小合適，證明成功得到小麥cDNA。

2.2Trx家族基因NRX的PCR擴增及克隆以“平涼45號”小麥葉片cDNA為模板，PCR產物大小在1 500～2 000 bp，與Genbank中搜索的晉麥47號TaNRX大小相近(圖1)。PCR產物經瓊脂糖凝膠回收后與pMD19-T Vector連接，轉化大腸桿菌感受態，挑選陽性克隆進行測序。

2.3生物信息學分析

2.3.1NRX基因核苷酸序列分析將測序(大連寶生物生物工程有限公司)得到的核酸序列，用ExPASy、EMBL-EBI和DNAMAN軟件進行比對。結果表明克隆得到的目的片段包含起始密碼子ATG和終止密碼子TAG，有完整的ORF開放閱讀框，大小為1 734 bp，編碼577個氨基酸，具有高度保守的氧化還原活性結構區(redox active motif)：WCPPC和WCGPC，屬于TRX家族(圖2)。通過多重比對與聚類分析(圖3、4)發現，NRX基因的核苷酸序列與大麥同源性為88%，與水稻的同源性為82%，與Genbank中晉麥47的TaNRX-a基因的核酸序列完全相同，表明成功克隆至“平涼45號”小麥的NRX基因。

2.3.2NRX編碼蛋白一級結構和理化性質。通過ProtParam在線預測NRX基因的理化性質等。生物信息學顯示，NRX基因編碼的蛋白分子式為 C5103H08474N1734O2132S400，分子量為14.11 kD，等電點4.95,不穩定系數43.18，通常，蛋白的不穩定系數在40以下為穩定蛋白，因此，“平涼45號”冬小麥NRX基因編碼不穩定蛋白；氨基酸以Gly(28.6%)、Ala (25.4%)、Cys(23.1%)、Thr(22.9%)為主；脂肪系數為25.43，疏水性平均數為0.760，預測NRX基因編碼脂溶性蛋白。

2.3.3氨基酸信號肽預測。通過SignalP 3.0 Server在線預測NRX基因編碼序列信號肽。當C、Y及S的平均值在0.5以上，同時3個值的結果均為“YES”時，氨基酸序列中才有可能存在信號肽。該基因的S平均值為0.89，C與Y平均值都小于0.5，且三值獲得的結果都是“NO”，預測NRX基因編碼的蛋白沒有信號肽。

2.3.4跨膜結構預測。利用TMHMM Server V.2.0對NRX基因編碼蛋白進行跨膜區段預測。結果顯示，NRX基因編碼的蛋白肽鏈都不在細胞生物膜上，無明顯跨膜區域。最后分析獲得該基因的功能區不在生物膜上。

2.3.5蛋白二級結構分析。通過SOPMA軟件對NRX基因編碼的氨基酸二級結構進行分析(表2，圖5)，結果表明，該蛋白由 α-螺旋、β-折疊、無規則卷曲、延伸鏈構成，其中α-螺旋所占的比例最大，為34.32%，結合氨基酸預測結果，表明“平涼45號”冬小麥NRX基因編碼的蛋白不穩定。

表2　蛋白二級結構預測

2.4基因器官表達分析通過實時熒光定量PCR進行基因表達分析，以小麥EF1作為表達對照基因，檢測目的基因在“平涼45號”雜交冬小麥4種器官中的表達情況。結果顯示，NRX基因在其根、莖、莖尖、葉中均有表達，其中根和莖中相對表達量較高，而在葉中的相對表達量偏低(圖6)。

3結論與討論

植物抗旱是多個基因表達及其環境因素共同作用的結果。核氧還蛋白(NRX)最早是Kurooka等[14]在酵母中發現的，因為含有二硫化物活性中心CGPC(Trp-Cys-Gly-Pro-Cys)區而被認定為TRX 超家族成員。 植物的NRX最早在玉米中被發現[15]，TRX家族成員具有改變植物自交不親和性狀的功能，可以用于改良作物的基因型，近2年在大麥、小花棘豆、甘藍、鐵皮石斛、甘蔗等植物中研究較多。通過抗逆基因的表達調控進而研究抗旱、耐熱、抗氧化脅迫的機制，將有助于改良作物的遺傳性狀[8]。該研究利用雜交種“平涼45號”小麥抗旱性較強的特點，從其基因組中克隆出NRX基因，其開放閱讀框為1 734 bp，編碼577個氨基酸，包含2個氧化還原二硫化物活性中心WCGPC和WCPPC。生物信息學分析表明，“平涼45號”冬小麥中該基因編碼不穩定、脂溶性蛋白，且無信號肽及跨膜結構區域，編碼的蛋白質為非分泌蛋白，這與晉麥47號小麥有差異，可能與品種和取材有關。NRX基因生物信息學分析為進一步研究該基因調控方式提供了基礎。

通常，TRX分為家族Ⅰ和家族Ⅱ，TRX家族Ⅰ中m、f、h類廣泛存在于高等植物不同器官上。如m和f存在于葉綠體，而h存在細胞質內[16]。小麥TaNRX基因與抗旱相關的等位變異包括TaNRX-a和TaNRX-b基因型[17-18]。研究表明，TRX在模式植物擬南芥、煙草、小麥胚芽、楊樹及番茄、大麥種子、馬鈴薯根莖、水稻韌皮部、菠菜葉片中均有不同分布[19-20]。經過分析，其結構與在晉麥47號中發現的TaNRX-a型特征序列相似[12]。

對“平涼45號”冬小麥4種器官NRX基因表達水平進行檢測，結果表明，NRX基因在小麥4種器官上均表達，但NRX基因在小麥不同器官的表達量具有較大差異，體現出不同器官NRX基因不同的表達模式，表明在不同器官中NRX基因的調控方式和機制存在差異。因此，對NRX基因的功能研究需要對不同器官或同一器官不同發育時期分別進行對比研究。

該研究對NRX基因的研究結果為下一步更深層次地研究NRX基因的功能作用及調控機理提供依據，為甘肅地區抗旱小麥的研究提供參考，具有十分重要的實踐意義。

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摘要[目的]探討小麥TaNRX基因與抗旱的關系及其調控機制。[方法]根據晉麥TaNRX基因序列，設計一對特異引物，利用RT-PCR法從“平涼45號”冬小麥的cDNA中擴增出一個DNA片段，并克隆到pMD19-T載體，測序后比對分析。[結果]該片段具有完整的開放閱讀框，長度為1 734 bp，編碼577個氨基酸，與Genbank中晉麥的核酸序列具有100%的同源性，氨基酸序列中包含2個氧化還原二硫化物活性中心WCGPC和WCPPC，屬于TRX家族，同時生物信息學分析發現該基因編碼不穩定、非分泌、脂溶性蛋白。實時熒光定量PCR檢測顯示，該基因在“平涼45號”冬小麥各器官中均有表達，但具有不同的表達模式。[結論]為進一步深入研究TaNRX基因的功能及與其他基因之間的相互關系提供參考。

關鍵詞小麥；TaNRX基因；克??；實時熒光定量PCR

Cloning and Expression Analysis ofTaNRXGene of Winter Wheat about Pingliang No. 45 in Gansu Area

ZHU Zhan-dong1, LIU Xue-feng2, CHAI Shou-xi1*(1.College of Agronomy, Gansu Agricultural University, Lanzhou, Gansu 730070; 2.The Ist Pasturage Farm, Agricultural Division 14 of Xinjiang Production and Construction Corps, Hetian, Xinjiang 848306)

Abstract[Objective]To study the relationship between TaNRX gene and drought resistance of wheat. [Method] According to Jin wheat TaNRX gene sequence, a pair of specific primers was designed and a DNA fragment was amplified from the Pingliang 45 winter wheat using RT-PCR method, then it was cloned into pMD19-T vector, comparison and analysis was conducted after sequencing. [Result] The fragment has a complete open reading frame, 1 734 bp in length, encoding a protein of 577 amino acids. It has 100% homology with the Genbank nucleic acid sequence in Jin wheat, contains WCGPC and WCPPC. The cloning gene belonged to the TRX family, and the code is not stable, non secretion abd fat soluble protein. The gene was all expressed in different organs of Pingliang No. 45 of winter wheat, but with a different expression pattern by the real-time fluorescence quantitative PCR. [Conclusion] This study provides a reference to further study the relationship or function between TaNRX gene and other genes.

Key wordsWheat; TaNRX gene; Clone; Real time fluorescent quantitation PCR

收稿日期2015-04-30

通訊作者

作者簡介朱占東(1985- )，男，甘肅會寧人，碩士研究生，研究方向：農學作物。*，教授，博士生導師，從事作物栽培學研究。

中圖分類號S 512.1+1

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2015)18-029-04