中東呼吸綜合征冠狀病毒的實驗室檢測以及疫苗和治療研究進展

盧帥 秦堃 譚文杰

102206北京，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所衛生和計劃生育委員會醫學病毒學與病毒病重點實驗室

·綜述·

中東呼吸綜合征冠狀病毒的實驗室檢測以及疫苗和治療研究進展

盧帥 秦堃 譚文杰

102206北京，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所衛生和計劃生育委員會醫學病毒學與病毒病重點實驗室

中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS?CoV）是2012年首次發現的具有高病死率、可感染人的一種新型冠狀病毒，給全球公共健康帶來嚴重威脅。目前，針對中東呼吸綜合征冠狀病毒的病毒分離、免疫學及核酸檢測方法已經建立，特異性的疫苗和治療藥物也正在研發之中，成為控制MERS?CoV感染蔓延的有力武器。本文就MERS?CoV的實驗室檢測及疫苗和治療研究進展作一綜述，以期為MERS?CoV的防控提供參考。

Fund program：Mega Project for Infectious Disease Research of China（2014ZX10004001）

中東呼吸綜合征冠狀病毒是2012年從沙特阿拉伯一位因急性肺炎伴腎功能衰竭而死亡的患者呼吸道上皮細胞中分離的一種新型冠狀病毒［1］。該病毒首先在沙特阿拉伯發現后，迅速向中東其他國家蔓延，隨后在埃及、突尼斯、法國、德國、英國、韓國、中國等全球27個國家都有了感染病例的報道。自2012年9月疫情爆發到2016年5月16日，WHO共收到全球1733例實驗室確診感染MERS?CoV的病例報告，其中628例死亡，病死率達36%，遠高于發生在2003年的嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus，SARS?CoV）［2］。MERS?CoV的高病死率及快速蔓延，使其成為全球公共健康的嚴重威脅。

冠狀病毒（Coronavirus，CoV）屬巢式病毒目、冠狀病毒科、冠狀病毒屬，為有包膜的單股正鏈RNA病毒，基因組全長27?32kb，是目前已知最大的RNA病毒。國際病毒學分類委員會（International committee on taxonomy of viruses，ICTV）將冠狀病毒分為α、β、γ、δ 4個病毒屬，其中MERS?CoV為β屬，系統進化樹分析其與蝙蝠冠狀病毒BtCoV?HKU4、BtCoV?HKU5遺傳關系接近，并且有報道其可能源于中東地區的單峰駱駝［3］。MERS?CoV基因組全長約30kb，5′和3′端各有一個非編碼區，距5′端2／3區域包含兩個重疊的開放閱讀框（OpeningReading Frame，ORF）：ORF1a和ORF1b，主要負責編碼與病毒復制相關的酶類等非結構蛋白；而3′端1／3區域主要負責編碼棘突蛋白（Spike，S）、膜蛋白（Membrane，M）、小膜蛋白（Envelpoe，E）和核衣殼蛋白（Nucleocapsid，N）等四種結構蛋白［4］。

目前已知能導致人類感染的冠狀病毒有HCoV?229E、HCoV?OC43、SARS?CoV、HKU1、HCoV?NL63和MERS?CoV。其中MERS?CoV是繼SARS?CoV之后的又一高致死率的冠狀病毒，也受到全球越來越多的關注，因此快速準確的診斷及安全有效的疫苗藥物對控制MERS?CoV感染十分關鍵。通常認為病毒分離培養是實驗室診斷的金標準，但MERS?CoV的培養較為特殊，不僅依賴較為敏感的細胞系，且需在生物安全三級（Biosafety Level?3，BSL?3）實驗室操作，這對MERS?CoV的病毒培養產生了一定的局限性。目前，臨床尚無對MERS?CoV有效的疫苗或特異性治療藥物。但對MERS?CoV的實驗室檢測方法在不斷優化，安全有效的疫苗和藥物也在不斷研究。本文就MERS?CoV的實驗室檢測方法及疫苗、藥物研究進展進行綜述。

1 MERS?CoV的實驗室檢測

1.1 MERS?CoV的抗體檢測血清學方法主要是檢測血清中的MERS?CoV結構蛋白特異性抗體，可以用來評價冠狀病毒的血清流行病學、追蹤其傳播途徑進行溯源，也可以用來監測感染和疾病的進展。MERS?CoV感染者的血清中抗體主要為IgM和IgG，其中IgM一般認為主要出現在感染早期階段，而IgG抗體可在感染后長期存在，WHO對血清學陽轉的診斷標準是恢復期血清抗體滴度是急性期的4倍或以上，因此對MERS?CoV感染的抗體檢測主要針對的是IgG。研究者們已建立了一系列檢測方法，常見如免疫熒光（Immunoflurescence assay，IFA）、酶聯免疫吸附實驗（Enzyme?linked immunosorbent assay，ELISA）、蛋白印記（Western blot，WB）、蛋白芯片方法（Protein microarray）和假病毒中和實驗（Pesudoparticle neutralization test，ppNT）、微量中和實驗（Micro neutralization test，MNT）等。

血清學檢測方法最大的問題是假陽性和假陰性，Chan KH等通過IFA篩查并用中和抗體實驗驗證發現，SARS患者血清中存在MERS?CoV的中和抗體［5］，提示了這種方法可能出現的假陽性。同時IFA方法對熒光顯色的判斷具有主觀差異，難以標準化操作，整個診斷程序較為復雜，不適合高通量的檢測。而Corman等利用RT?PCR對MERS?CoV感染者拭子標本進行核酸檢測時呈現陰性，但IFA方法卻在患者血清中檢出抗體［6］，表明IFA可以作為其他檢測方法的補充。

ELISA檢測方法則是以裂解的病毒或重組蛋白作為抗原，來檢測血清中的抗體。通常認為ELISA檢測方法的敏感性較高，在對確診SARS?CoV感染的患者實驗中被證實陽性率達85%?100%，與IFA比較具有相當的敏感性。而在不同的病例對照研究中發現IFA和基于病毒抗原的ELISA對SARS?CoV的診斷存在0%?12.2%的假陽性率［7］。尤其是對一些在系統進化上較為接近的冠狀病毒，就要考慮到ELISA反應的特異性問題。N和S蛋白作為冠狀病毒主要的結構蛋白，其中N蛋白在病毒含量高，但相對保守，SARS–CoV N全長基因與OC43、HKU1、MERS?CoV N基因的核苷酸同源性分別為34.2%、33.0%和46.7%［7］，因此在血清學檢測N抗體時交叉反應較強。Woo等在研究基于SARS?CoV N蛋白的ELISA檢測時，發現與基于S蛋白的WB確診實驗相比有87.9%的假陽性［8］，同時也有報道稱基于N蛋白的SARS?CoV檢測與其他人冠狀病毒存在較強的交叉反應［9］。Al?Abdallat等利用與MERS?CoV較為接近的BtCoV?HKU5.2 N蛋白的ELISA初篩血清抗體，再用IFA和MNT實驗來檢測MERS?CoV特異抗體［10］。在對密接人群的血清學篩查中，Buchholz等建立了兩步檢測方法，利用病毒感染細胞的IFA作為初篩，以中和實驗作為確診，表現出很好的效果［11］。

Prrera等構建了MERS?CoV假病毒對人和單峰駝血清進行了檢測，發現ppNT與傳統的MNT方法檢測駱駝血清MERS?CoV抗體的陽性率分別為98.2%和93.6%，二者表現出很好的相關性，但均不能排除MERS?CoV相近毒株的交叉反應［12］。但是ppNT檢測MERS?CoV的方法無需在生物安全三級實驗室操作，適合大規模的血清流行病學研究。也有報道利用正確折疊和糖基化的S1片段制成的蛋白芯片來檢測MERS?CoV，結果顯示與其他人冠狀病毒感染血清均無假陽性［13］。這種方法需要樣本少，可用干燥血點來檢測，是一種快速、簡便、高通量的檢測方法。

1.2 MERS?CoV的抗原檢測MERS?CoV的抗原檢測主要是針對人或動物感染標本如拭子等，來確定病毒在組織中的含量。Song D等利用多肽作為免疫原，篩選雜交瘤細胞獲得了特異性N蛋白鼠單抗，制備了針對MERS?CoV N抗原的膠體金快速檢測試紙條，并對單峰駝鼻拭子標本進行檢測，證明與針對upE、ORF1a的RT?PCR方法表現出較高的一致性［14］。此外，針對MERS?CoV N抗原的雙抗體夾心ELISA方法也由Chen Y等建立，其病毒檢測限可達10 TCID50／0.1 ml，同時證明與其他人冠狀病毒和流感病毒、腺病毒等都無交叉反應［15］。Yamaoka Y等利用小麥胚芽無細胞蛋白表達系統制備了MERS?CoV N抗原及鼠單克隆抗體，建立了雙抗體夾心的ELISA和膠體金檢測方法［16］，具有很好的敏感性和特異性，這些方法都有望用于人群或駱駝MERS?CoV感染的檢測。但是，由于臨床樣本中MERS?CoV的排毒規律不清楚，選取合適的標本和采樣時間對提高檢出率十分重要。

1.3 MERS?CoV的核酸檢測對MERS?CoV的分子學檢測方法包括real time RT?PCR和反轉錄環介導等溫擴增（Reverse transcription loop?mediated isothermal amplification assays，RT?LAMP）等。根據MERS?CoV基因組結構（HCoV?EMC／2012，JX869059），RT?PCR的目的基因可包括：upE、ORF1a、ORF1b、RdRp和N基因。Corman等建立了upE與ORF1b為靶標的實時熒光定量RT?PCR方法，其中upE基因作為篩查基因，而ORF1b基因作為確診的目的基因，upE為目的基因的RT?PCR可檢測低至3.4拷貝／反應的RNA，而ORF1b最低檢測限只能達到64拷貝／反應，這種方法組合具有很好的特異性，在檢測其他呼吸道病毒如呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒等都表現出陰性［17］，具有很好的診斷性能。國內也有對MERS?CoV核酸檢測方法優化的報道［18］。Lu X等從全長N基因中選出兩段N2（29424?29442 bp）和N3（28747?28771 bp），把upE和N2作為篩查的目的基因，而N3作為確診的目的基因，這種方法證明具有很好的敏感性和特異性。對MERS?CoV RNA最低檢測限可達10拷貝／反應，具有很好的特異性，并且對其他呼吸道病毒以及人冠狀病毒都能很好地區分［19］。Chan JF等針對冠狀病毒的先導序列的實時定量RT?PCR檢測拭子標本發現，檢測限可達5 RNA拷貝／反應［20］。

鑒于RT?PCR方法的溫度循環依賴性，不適合現場操作，簡便的等溫擴增技術逐漸發展起來。Kazuya等利用RT?LAMP靶向針對N基因保守區段的擴增反應，檢測MERS?CoV用時不超過1小時，且檢出低限可達3.4 RNA拷貝每反應［21］。Sanchita等利用RT?LAMP擴增MERS?CoV ORF1a，ORF1b和upE基因，檢測限為0.02到0.2 PFU每反應，對細胞培養上清中MERS?CoV的檢測只需30?50 min，且與其他呼吸道病毒無交叉［22］。關麗等對RT?LAMP進行優化，建立了基于濁度儀和顏色變化的簡單、快速的RT?LAMP［23］，雖然檢測限低于RT?PCR，但操作簡單、耗時短、非溫度循環依賴，相比RT?PCR更為方便快速。但是RT?PCR或RT?LAMP也有一定的局限性，尤其是在病毒逃逸及標本如拭子RNA提取方法不當時，檢出率會降低。同時RT?PCR方法的特異性也會因其他RNA的污染而受到干擾，這與SARS?CoV等其他RNA病毒檢測遇到的問題是一樣的。

2 MERS?CoV的疫苗研究

MERS?CoV的S蛋白是介導病毒顆粒與細胞膜融合的結構蛋白，能誘導中和抗體產生。通常S蛋白可被切割成兩個部分S1和S2，其中S1介導病毒的附著，S2介導膜融合［24］。對MERS?CoV S蛋白的結構研究顯示，其S1區段有重要的受體結合區RBD，其主要與細胞表面受體二肽基肽酶4（Dipeptidyl peptidase 4，DDP4）結合，從而介導病毒的入侵［25］。目前尚無對人或動物有效的MERS?CoV疫苗，科學家們進行疫苗研究關注的主要是S蛋白。Volz A等利用表達MERS?CoV S全長的改良型痘苗病毒安卡拉株MVA免疫小鼠［26］，Coleman等用桿狀病毒表達的S蛋白顆粒加佐劑免疫小鼠［27］，能誘導小鼠產生中和抗體，并具有保護作用。Du L等發現S蛋白377?662位氨基酸能誘導小鼠中和抗體的產生［28］，此區域正是受體結合區域，提示可作為MERS?CoV疫苗研究的靶標。Mou H等利用帶有人IgG Fc段的受體結合區（Receptor binding domain，RBD）（S，377?588aa）重組蛋白免疫兔子，發現能誘導產生很高的中和抗體［29］；Du L等發現截短的RBD（S，377?588aa）蛋白能抑制小鼠感染MERS?CoV，并能產生很強的中和抗體［30］。Lan J等利用不同的佐劑在小鼠模型實驗研究中也發現RBD亞單位疫苗具有較好的保護效果［31］，在恒河猴模型中也發現RBD亞單位疫苗能起到部分保護效果［32］。而Wang L等用包含MERS?CoV S全長的DNA疫苗證明了其在小鼠和恒河猴模型中的良好的保護效果［33］。Wang C等利用桿狀病毒表達系統制備了MERS?CoV病毒樣顆粒（Virus like particles，VLPs），并在恒河猴模型中證明具有較好的保護效果［34］。此外還有MERS?CoV S蛋白表位多肽疫苗，并在小鼠體內證明能夠誘導較高的體液和細胞免疫應答水平［35］。

3 MERS?CoV的抗病毒藥物研究

目前，臨床上尚無針對MERS?CoV感染的特異性治療藥物，MERS?CoV的治療多依賴于廣譜的抗病毒及支持治療，但一些特異性的藥物展現出良好的應用前景。Falzarano等用α干擾素（Interferon?α，IFN?α）和利巴韋林聯合治療恒河猴MERS?CoV感染模型，發現能降低病毒復制，起到一定的延緩病情作用，而在人體身上采用上述聯合治療，對部分患者可能有效［36］。Omrani等對MERS?CoV患者的隊列研究發現，聯合治療可部分改善MERS?CoV感染患者生存率［37］?？梢?，IFN聯合利巴韋林對MERS?CoV的治療作用有限。在對MERS?CoV感染的特異靶標藥物的研究發現，MERS?CoV在膜融合過程中S2區段的七肽重復區HR1和HR2的融合是十分關鍵的。以此為靶點，設計了類似于HR2的多肽抑制劑，在體外實驗證明可抑制病毒的膜融合與入侵［38］。Channappanavar等設計了HR2多肽類似物HR2P?M2，并在MERS?CoV感染的動物模型中展示了較好的效果［39］。此外，抗體治療也有很大進展。許多MERS?CoV S單抗都表現出很好的中和活性，全人源的單抗有望作為較為安全的治療藥物進入臨床［40］。

MERS?CoV作為嚴重威脅全球公共健康的病毒，快速準確的實驗室檢測和安全有效的治療藥物是控制其蔓延的關鍵。目前，實驗室檢測方法多樣，對于不同病例、不同病程的患者，選擇合適的采樣部位、樣本及檢測手段對準確的診斷十分重要。MERS?CoV病死率高，危害大，但目前臨床尚無有效藥物。因此，對MERS?CoV檢測方法的優化及特異性疫苗藥物的開發仍是應對MERS所面臨的重要工作。

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Development of laboratory diagnosis，vaccines and therapies for the Middle East respiratory syndrome coronavirus

Lu Shuai，Qin Kun，Tan Wenjie

Key Laboratory of Medical Virology，National Health and Family Planning Commission，National Institute for Viral Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China（Lu S，Qin K，Tan WJ）

The Middle East respiratory syndrome coronavirus，firstly detected in 2012，was a novel coronavirus causing high mortality to humans，which posed a severe threat to public health.Presently，laboratory methods for virus isolation and diagnosis were built，as well as the development of vaccines and drugs for the MERS?CoV，which will be a powerful weapon to control its spread.This review summarizes recent advances on laboratory diagnosis，vaccines and therapies for MERS?CoV，which might provide implications for the prevention and control of this serious disease.

Middle East respiratory syndrome coronavirus；Diagnosis；Vaccine；Therapy

譚文杰，E?mail：tanwj28＠163.com

10.3760／cma.j.issn.1003?9279.2016.06.000

中東呼吸綜合征冠狀病毒；檢測；疫苗；治療

傳染病防治重大專項（2014ZX10004001）

2016?05?18）