哮喘動物模型建立的思考與體會*

譚杰軍　王甜甜　劉志偉　曲婉瑩　景偉超　施國善　李志軍△王有鵬△（.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 50040；.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江哈爾濱 5000）

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哮喘動物模型建立的思考與體會*

譚杰軍1王甜甜1劉志偉1曲婉瑩1景偉超2施國善1李志軍2△王有鵬2△
（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江哈爾濱 150001）

實驗動物模型的建立對于哮喘病因、病機及防治方面的研究至關重要。筆者基于對國內外諸多哮喘實驗動物模型建立方法與相關知識的學習和思考，結合自身實踐經驗，提出幾點心得和體會，以資與同道互相探討學習。

支氣管哮喘動物模型思考體會

【Abstract】The establishment of experimental animal model for the etiology，mechanism and prevention of asthma is of crucial importance.The author puts forward several ideas and experience to discuss with fellows and learn from each other，based on the study and thinking of the methods of the establishment of experimental animal model of asthma home and abroad and the related knowledge.

【Key words】Bronchial asthma；Animal models；Thinking；Experience

支氣管哮喘（簡稱哮喘）作為嚴重危害人體健康的常見疾病，其預防、控制和治療已成為全球性的健康難題。實驗動物模型的建立對于哮喘病因、病機及防治方面的研究至關重要。遺憾的是，由于各研究者所在實驗室條件高低參差不同，文獻中的模型建立方法在國內經常不能成功復制，或出現諸多問題，影響實驗的正常進行和研究的順利開展?；趯鴥韧庵T多哮喘實驗動物模型建立方法［1-7］與相關知識的學習和思考，筆者將結合自身實踐經驗，就實驗動物及條件控制、致敏劑與致敏方法以及模型判定等幾方面加以探討闡述，提出幾點心得和體會，以資與同道互相探討學習，期望能對普通實驗條件下哮喘動物實驗研究的開展，有所借鑒幫助。

1　建立哮喘動物模型的必要性

鑒于人體研究的局制以及倫理學的嚴格限制，哮喘的研究需要通過建立動物模型來進行，這是研究成功的關鍵。研究者可以通過動物模型把人體中類似的復雜情形復制出來，通過嚴格控制條件，排除各種干擾因素，對疾病加以研究。此外，還可采用某些在人體研究中不宜使用的方法和手段。但考慮到動物的氣道結構遠不如人類復雜，加之哮喘病因病機錯綜萬千，受多種因素影響，如遺傳背景、過敏原、環境因素等，一種動物模型無法完全復制出人類哮喘的整個病理生理過程，而只能重現哮喘生理病理變化的某些特定階段。因此，選擇并建立合適的動物模型非常重要。毋庸置疑，盡管其存在一定的不足，但通過動物模型我們得到大量有效信息，對人類哮喘有了深刻透徹的認識。

2　實驗動物的選擇

建立哮喘動物模型，是利用所選品系的物種更好地模仿哮喘的過程與特征。兔、貓、犬、羊及靈長類不能自發哮喘，且一般需人工誘發，都不是理想的選擇對象。綿羊及靈長類雖可模擬人類對藥物的反應，但價格昂貴，可能發生微生物的亞臨床感染，不予選擇。目前制作哮喘模型多選用豚鼠、大鼠與小鼠。

2.1豚鼠豚鼠易被致敏，且反應的靶器官為肺臟，接觸致敏原后產生Ⅰ型變態反應，程度較大鼠、小鼠強，且霧化激發后能產生速發相與遲發相兩種哮喘反應，因而應用廣泛。但豚鼠個體差異大，致敏過程中個別不出現反應，而其他個體卻出現種群依賴性的夸大反應，如過敏性休克等。從免疫學方面講，與人類變態反應主要由IgE介導不同，豚鼠的主要由IgG1介導。此外，豚鼠繁殖率較低，缺乏基因型明確的種系，相關的免疫學與分子生物學試劑相對不足，盡管能發生很好的氣道炎癥，但要進一步深入研究遺傳與免疫機制則比較困難［8］。由于上述原因，其應用受到一定限制。

2.2大鼠近年來，大鼠模型使用逐漸增多，國外多用Brown-Norway大鼠，易受國際醫學雜志認可。其優點在于能夠產生針對過敏原的特異性IgE抗體，而且更易誘發出哮喘癥狀以及氣道變應性炎癥與氣道高反應。但目前，我國常用的SD大鼠、Wistar大鼠等穩定性欠佳，很難被較高水準的國際醫學雜志認可，不宜用于哮喘研究，在此其優缺點不再贅述。

2.3小鼠小鼠常用于呼吸道變態反應的研究。它們的免疫遺傳學背景清楚，方便使用轉基因技術，成本較低，并被允許進行大規模研究。隨著實驗技術和檢測手段的發展，針對小鼠的特異性免疫學試劑的大量出現，以及基因技術的廣泛應用，使小鼠模型便于進行變態反應機制的研究。常用的小鼠品系有BALB/c、C57BL/6、CBA、C3H、A/J等［9］，以前兩種最常用。

然而，現存的小鼠哮喘模型有許多局限性。首先，不出現類似人類哮喘的黏膜炎癥和上皮層嗜酸性粒細胞浸潤；其次，致敏和激發往往需要多次，否則不會出現人類哮喘典型的慢性氣道炎癥和上皮變化；最后，會出現過敏性肺泡炎或超敏性肺炎，掩蓋了氣道的炎癥損害［10］。此外，小鼠體積小，體質量輕，氣道短，這給操作及取材帶來許多困難。

筆者認為，基于生物特性考慮，過敏性疾病的研究以豚鼠為佳，免疫及基因手段的應用首選小鼠?！按菩鄄痪小币话悴豢扇?，同籠飼養更是不可行。哮喘模型的建立以及后續實驗往往超過4周，期間若發生交配、孕娩、哺乳等事件，以及更為嚴重的因爭奪雌鼠而發生的雄鼠打斗，都會嚴重影響研究結果的準確、穩定和可靠。如果分籠飼養并分屬不同組，雌雄之間本有差異不具可比性。一般哮喘研究建議選用同一性別的動物。為避免雌激素及生理周期的影響，多選雄性；小鼠則選雌性，因其變應性氣道炎癥比雄性更為顯著，嗜酸性粒細胞和淋巴細胞浸潤更為明顯，同時支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞數也較多。值得注意的是，考慮到實驗過程中可能出現的誤傷、死亡，動物個體差異性及個別采集樣本的不合格等因素，論文“結果”描述時，應標明入組例數與實際檢測例數，這可以增強研究論文的可信性。

3　模型建立

哮喘模型建立的要素諸多，篇幅有限，本文在此不一一提及，僅結合自身實踐就一些主要問題加以探討。

3.1嚴格篩選實驗動物和改進飼養條件實驗時應選擇較易誘出變態反應的動物，為避免實驗前接觸環境中可能存在的雞卵清蛋白（OVA），入組動物應從母代就接受特殊飼料喂養，并由動物中心專業專職人員負責，嚴格按照清潔級飼養標準進行，如無菌環境、恒溫恒濕等，避免環境因素對實驗的干擾。

3.2致敏劑及致敏方法致敏方法能夠影響研究對象的過敏反應，合理的模型選擇需要綜合考慮致敏原與佐劑的類型、致敏原輸入方式及劑量等。模型建立時應選用與人類哮喘相關聯的抗原來進行致敏和激發，且輸入方式也應同人類哮喘發生的生理病理機制相適合。

3.2.1致敏劑及佐劑的選擇基于大量研究報道，致敏階段推薦被動免疫中復合形式的OVA致敏及激發，以OVA為致敏原（一般致敏時用Ⅴ級、激發時用Ⅱ級），Al（OH）3為免疫佐劑。

致敏劑一般由抗原和佐劑組合而成，佐劑能夠增強免疫原性及免疫應答，防止脫敏情況發生。作為經典的致敏原，OVA為異種蛋白，有很強的抗原性和免疫原性，易于獲得，常與Al（OH）3聯合使用。實驗中我們發現氫氧化鋁干粉難溶于水，與OVA不能很好混合，靜置后明顯分層，在進行腹腔或皮下注射時極易堵塞針頭，嚴重影響致敏效果。佐劑與抗原的混合程度影響致敏原的免疫原性，故我們在Se-Woong Oh等方法的基礎上，選用硫酸鋁鉀代替Al（OH）3干粉（Sigma公司的凝膠劑也可以，但價格較昂貴［11］。董峰等在哮喘造模中發現Al（OH）3凝膠在增強OVA致敏反應的效果上優于干粉劑）［12］。硫酸鋁鉀易溶于水，常用作誘導Th2型免疫反應的佐劑，這符合哮喘的免疫反應特點。實驗中我們用NaOH調節pH值，硫酸鋁鉀與NaOH反應生成Al（OH）3，形成混懸小球后與OVA混合充分，增強了致敏效果，且不堵塞針頭。

3.2.2致敏方法的改進增加致敏部位有利于哮喘氣道慢性變應性炎癥模型及氣道重塑模型的建立。Christina A.Herrick等發現皮膚是重要的致敏器官，單純腹腔注射不能很好地誘發Th2型變態反應，故實驗中我們建議采用腹腔注射和皮下注射相結合的方法，多點致敏［13］。

在激發時影響模型成功的因素主要有：激發時間與激發頻次、霧化器、激發時OVA的濃度。首先，慢性哮喘模型的建立方法與急性相比，主要區別在于激發時間更長。為了更好地模擬氣道慢性炎癥過程這一哮喘本質，我們延長了霧化激發時間，并采用連續激發14 d，小鼠每次30 min，豚鼠則從30 s開始逐漸適應性延長，以形成典型的慢性變應性炎癥。當然，氣道重塑模型則需要在此基礎上至少延長2周。其次，壓縮霧化激發的方式要優于傳統的超聲霧化激發［14］。壓縮霧化方法產生的顆粒較小，平均中位直徑3.5 μm，能很好地進入小氣道，從而誘導小氣道炎癥，而超聲霧化器產生的霧化顆粒大，大部分作用于口咽部，不能到達小氣道，因而激發效果不好［15］。激發時的OVA濃度較多選用1%。

4　模型的判定

目前對于哮喘模型建立是否成功，尚沒有一個規范的統一判斷標準。哮喘的動物模型多種多樣，但均應具備氣道變應性炎癥和氣道高反應性的兩大基本特征。驗證模型是否成功主要從以下4個方面入手：動物的總體外觀及行為學表現；炎癥細胞分類及計數；病理組織觀察；氣道反應性測定。

4.1總體外觀及行為學表現通常結合動物模型的整體外觀以及類似人類哮喘發作的典型表現，如煩躁不安或安靜少動、點頭呼吸、呼吸加深加快、前肢縮抬、弓背直立、二便失禁等，判斷模型是否成功，并進一步評價藥物作用。

4.2炎癥細胞分類及計數既往多采用瑞氏-吉姆薩染色法，但實際操作中，由于支氣管肺泡灌洗液標本較稀薄，受灌洗操作水平影響較大，普通推片及甩片機甩片效果均不理想，炎癥細胞在玻片上薄厚疏密分布不均，涂片染色時易脫片，這直接影響鏡下觀察及計數。我們結合史菲等支氣管肺泡灌洗術標準化操作，根據實際情況進行標本采集，采用液基沉降法涂片，HE染色法染色計數，效果比較滿意［16］。此外，Diff Quik染色雖成本稍高，效果也比較理想。

4.3病理組織觀察光鏡下進行模型動物病理組織檢查，觀察其變化。并采用HE染色及其結果的Ashcroft評分觀察支氣管及肺組織炎性細胞浸潤情況，方法不再贅述。

4.4氣道反應性的測定我們采用無創性體外非侵入性檢測法進行氣道反應性的測定。其具有以下優點：1）小鼠非限制性；2）手段非侵入性；3）小鼠在清醒狀態下自主呼吸；4）小鼠無感覺缺失；5）可用于長時間和重復檢測。實驗中應用整體容積描記箱（體描箱）記錄小鼠呼吸曲線，并計算出Penh值，然后根據Penh值的變化，運用全身性體積描記法（WBP）無創性地測定小鼠氣道反應性。Penh（enhanced pause）=［呼氣峰壓（PEP）/吸氣峰壓（PIP）］×［呼氣時間（Te）-松弛時間（Tr）］/Tr，簡之，即Penh=（PEP/PIP）×Pause，Pause=（Te-Tr）/Tr，Tr是呼氣壓力降為36%時所經歷的Te。實驗時按濃度梯度給予乙酰膽堿，計算Penh較基線增高的倍數來反映氣道反應性的高低。相較而言，有創性檢測方法可直接檢測氣道阻力和順應性，但需要麻醉狀態下氣管插管，對氣道反應性會產生影響，且不能用于長期反復檢測，因此無法用于對哮喘肺功能變化的動態研究，不能用于觀察藥物干預作用的動態變化。

哮喘實驗動物模型的制備方法及模型成功的評判標準，仍需在今后的研究中進一步規范，以促進哮喘研究的深入發展。

［1］ 喬明，劉蘭英，王和生.支氣管哮喘慢性氣道炎癥大鼠模型的建立與評價［J］.遼寧中醫雜志，2014，41（6）：1084-1087.

［2］ 田代印，符州，張燕，等.一種改良型小鼠哮喘模型方法的建立及評價［J］.重慶醫科大學學報，2005，30（4）：601-603.

［3］ 蔡黎，畢小利，王憶勤，等.咳嗽變異性哮喘豚鼠模型的構建［J］.山西醫科大學學報，2007，38（12）：1070-1073.

［4］ 遲磊，符州，戴繼宏，等.過敏性哮喘大鼠模型的建立［J］.重慶醫學，2003，32（4）：429-431.

［5］ 呂國平，崔德健，郭英江，等.介紹一種建立大鼠哮喘模型的實驗方法［J］.中華結核和呼吸雜志，1995，18（6）：377-378.

［6］ 何權瀛.對我國哮喘動物實驗研究的評價與思考［J］.國外醫學：呼吸系統分冊，2005，25（9）：718-719.

［7］ 龍靜雯，馬卓，楊旭東，等.不同品系大鼠哮喘模型的比較［J］.西安交通大學學報：醫學版，2009，30（5）：550-553.

［8］ 顏曉燕，童志遠.哮喘動物模型研究現狀［J］.成都醫學院學報，2007，2（2）：157-159.

［9］ 馬俊鵬，常軍民，盧冬梅.中藥治療哮喘的基礎實驗研究進展［J］.西北藥學雜志，2008，23（3）：186-188.

［10］Temelcovski J，Hogan SP，Shepherd DP，et al.An improved murine model of asthma：selective airway inflammation，epithelial lesions and increased methacholine responsiveness following chronic exposure to aerosolised allergen［J］.Thorax，1998，53：849-856.

［11］Se WO，Chong IP，Dong KL，et al.Tryptase Inhibition Blo cks Airway Inflammation in a Mouse Asthma Model［J］.The Journal of Immunology，2002，168，1992-2000.

［12］董峰，唐紅衛，吳小利，等.氫氧化鋁干粉與凝膠制作大鼠哮喘模型的效果比較［J］.解放軍醫學院學報，2013，34（1）：73-75.

［13］Christina AH，Lan X，Andrew NJM，et al.IL-13 is Necessary，Not simply sufficient，for epicutaneously induced Th2 responses to so luble protein antigen［J］.The Journal of Immunology，2003，170：2488-2495.

［14］龔萍.大鼠哮喘模型的改良與評價［D］.長沙：中南大學，2009.

［15］竇迎婷.淺談建立哮喘模型的體會［J］.江西中醫學院學報，2012，24（2）：72-73.

［16］史菲，邱晨.大鼠支氣管肺泡灌洗術標準化操作的探討［J］.中國現代醫學雜志，2002，12（24）：67-69.

Thinking and Experience of Establishing Animal Models of Asthma

TAN Jiejun，WANG Tiantian，LIU Zhiwei，et al.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Heilongjiang，Harbin 150040，China.

R562.2+5

A

1004-745X（2016）05-0816-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.05.018

國家自然科學基金項目（81473724）；哈爾濱市應用技術研究與開發項目（2014RFXJ098）；黑龍江中醫藥大學研究生創新科研項目（2015-08）
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（電子郵箱：wangyp8899@163.com）

2016-01-27）