口服滅活幽門螺桿菌對新生BALB/c小鼠胃黏膜的免疫保護作用研究

楊鈺欣　江吉富

(遵義市婦幼保健院，遵義563000)

口服滅活幽門螺桿菌對新生BALB/c小鼠胃黏膜的免疫保護作用研究

楊鈺欣江吉富

(遵義市婦幼保健院，遵義563000)

[摘要]目的：探索BALB/c小鼠新生期口服滅活幽門螺桿菌(H.pylori)后對胃黏膜是否具有免疫保護作用。方法：將32只BALB/c小鼠分為四組進行實驗。第Ⅰ組為PBS對照組，第II組為滅活H.pylori組，第Ⅲ組為滅活H.pylori加大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)組，第IV組為正常對照組。用相應抗原成分對Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組出生24 h以內的新生BALB/c小鼠進行灌胃免疫，末次免疫兩周后，將小鼠用108CFU的幽門螺桿菌SS1株進行活菌灌胃攻擊，連續攻擊兩天，每天兩次。在攻擊后的第28天，將各組小鼠處死，取胃組織進行活菌計數及組織病理學炎性評分。結果：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組慢性炎癥評分分別為2.25±0.46、2.12±0.35、1.5±0.53、0.25±0.46，炎癥活動度評分為2.12±0.35、2.12±0.35、1.37±0.52、0.25±0.46；除Ⅰ、Ⅱ組間無統計學意義外，其余組間差異均有統計學意義(P<0.05)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組細菌定植量分別為1.33±0.21、1.18±0.27、1.05±0.37×105CFU/1個胃，Ⅳ組細菌定植量<4×102CFU/1個胃，低于檢測值，Ⅲ組的細菌計數低于Ⅰ、Ⅱ組，差異有統計學意義(P<0.05)。結論：BLAB/c小鼠新生期給予滅活幽門螺桿菌加LTB灌胃免疫與活菌攻擊后炎癥的減輕和細菌定植量的減少可能相關，具有一定的免疫保護作用。

[關鍵詞]滅活幽門螺桿菌；LTB；新生BALB/c小鼠；免疫保護

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)在1979年被澳大利亞學者Warren和Marshall發現，于1982年成功地從人胃黏膜中分離培養出來，并證實了該細菌的感染與胃炎相關。1983年，他們的這一成果發表在Lancet雜志上[1]。幽門螺桿菌感染在全世界廣泛流行，日本的一項研究顯示，H.pylori的暫時定植可能在新生兒期就有出現[2]。雖然兒童患消化性潰瘍并不多見，但與兒童慢性胃炎、消化不良、慢性腹瀉和復發性腹痛等的發病密切相關[3]。實驗證明有效的疫苗接種能夠防止H.pylori的感染[4]。一種用福爾馬林滅活的H.pylori全菌體凍干疫苗輔以LT的雙突變佐劑給予BALB/c小鼠灌胃免疫，結果證明具有良好的免疫保護反應[5]。本課題的前期研究表明，對出生 24 h內新生BALB/c小鼠用滅活幽門螺桿菌加大腸桿菌不耐熱腸毒素——LTB進行灌胃免疫后，能誘導機體產生免疫反應[6]。而這種免疫反應是否具有保護作用尚不明確，所以本實驗的主要目的在于探索口服滅活幽門螺桿菌疫苗對新生期小鼠胃粘膜炎癥變化的影響，希望能為人類新生期接種H.pylori疫苗的可行性作一鋪墊。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑與儀器哥倫比亞瓊脂培養基、H.pylori培養選擇性添加劑購自英國OXIOD公司；布氏肉湯購自杭州天和有限責任公司；三元混合氣體(O2、CO2、N2)購自貴陽申建氣體有限責任公司；LTB購自Sigma公司；恒溫培養箱(DHP-9272)購自上海一恒有限責任公司。

1.1.2 菌株滅活幽門螺桿菌NCTC 11637(活菌購自中國疾病預防控制中心傳染病防治研究所。培養后經本室滅活制成終濃度為2×109ml-1的H.pylori滅活菌液，4℃保存備用)[6]。幽門螺桿菌SS1株(由中國疾病預防控制中心饋贈)。

1.1.3動物模型BALB/c小鼠(購于中國藥品生物制品檢定所)，清潔級，雌雄兼用，自由飲水，分籠飼養。

1.2方法

1.2.1免疫方案根椐不同的免疫劑型將小鼠分為四組(如表1所示)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組為實驗組(8只/組)，Ⅳ組為正常對照組(8只/組)。用H.pylori滅活全菌體與已經溶解的LTB對各組BALB/c小鼠進行灌胃免疫，免疫時間為出生后第0(24 h內)、7、21天。第0天免疫時，將24 h以內出生的BALB/c小鼠與母鼠分離3 h后，進行灌胃，灌胃完畢，繼續放入籠中(與母鼠隔離)，4 h后，再次按照上述方法給予第二次灌胃，免疫結束2 h后，將母鼠放回籠中。第7、21天各免疫1次，第7天免疫前，與母鼠隔離6 h，免疫方法同前，免疫2 h后放回母鼠籠中。

表1實驗分組

Tab.1Group of experiment

第21天免疫前斷食24 h，斷水4 h后進行灌胃免疫，2 h后恢復食水。正常對照組正常喂養，不進行任何處理。

1.2.2攻擊前準備將哥倫比亞血瓊脂培養基上培養第三天的H.pylori SS1株刮取一環，接種到含30 ml氏肉湯的三角燒瓶里，灌入混合氣體，置37℃水平振蕩培養150次/min，培養 48 h后，取菌懸液涂片革蘭染色鏡檢，觀察是否有雜菌生長，菌體形態是否改變；通過動力實驗觀察動力是否良好。如觀察結果正常，收集菌懸液，5 000 r/min離心10 min，收集沉淀，加入PBS使其再次懸浮，放入37℃孵箱10 min，使其恢復動力后，用比濁儀測定并用PBS調整至攻擊所需濃度；攻擊菌液為每次攻擊前用新鮮培養物配制。

1.2.3攻擊方法末次免疫兩周后，將Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組小鼠用H.pylori SS1株進行活菌攻擊，108CFU/0.2 ml/次，每天灌胃2次，兩次攻擊中間隔6 h，連續2 d。攻擊前斷食12 h，斷水4 h，用50 μl 3%NaHCO3中和胃酸，20 min以后進行活菌攻擊，每日末次攻擊2 h后恢復飲食。正常對照組正常喂養，不進行任何處理。

1.2.4胃組織炎性檢測將活菌攻擊后28 d的各組小鼠及與其年齡相同的正常對照組小鼠同時進行脫椎脊處死，用碘酒、酒精徹底消毒整個腹部，然后用無菌剪刀將其剪開，從賁門到幽門處剪取胃，置無菌平皿內，沿胃大彎剖開，平均分成兩半，一半用于組織病理學檢測，用無菌棉拭子輕輕去除胃內容物，在蒸餾水中輕輕漂洗后，放入盛有10%福爾馬林的小瓶內固定，送病理科進行石蠟切片并行HE染色、瑞氏吉姆薩染色觀察小鼠在活菌攻擊后胃部的炎癥改變，另一半用于H.pylori培養，了解細菌定植量；高倍鏡下觀察10個視野固有層淋巴細胞及中性粒細胞的浸潤情況，判斷炎癥程度。評分方法如下：慢性炎癥評分：0分：固有層偶見淋巴細胞浸潤；1分：固有層散在淋巴細胞浸潤；2分：固有層有中等量淋巴細胞浸潤；3分：固有層大量淋巴細胞浸潤，個別在胃粘膜下有淋巴濾泡形成[7]。炎癥活動度評分：0分：固有層偶見中性粒細胞浸潤；1分：固有層散在中性粒細胞浸潤；2分：固有層有中等量中性粒細胞浸潤；3分：固有層有大量中性粒細胞浸潤。

1.2.5H.pylori定植量檢測按照上述操作，將余下的另一半胃組織放入無菌EP管內，加入100 μl布氏肉湯，用剪刀剪碎組織，再加入1 900 μl布氏肉湯，混勻后，倒入事先準備好的無菌玻璃勻漿器內進行充分勻漿，然后將組織勻漿液分別做1∶10，1∶100，1∶1 000稀釋，分別接種100 μl到含H.pylori選擇性添加劑的哥倫比亞血瓊脂內，用傾注法培養后進行菌落計數，最后將平皿置培養罐內，充入混合氣體，37℃培養5~7 d，觀察菌落，進行涂片染色鏡檢、觸酶、氧化酶及快速脲酶試驗并計數。

2結果

2.1活菌攻擊后胃組織炎癥評分將各組BALB/c小鼠采集的胃組織標本進行炎癥評分，從圖1中可以看出Ⅲ組的炎癥評分明顯低于Ⅰ、Ⅱ組，說明使用滅活H.pylori與LTB共同免疫小鼠后，能降低H.pylori攻擊后對胃組織的病理損傷作用，結果顯示具有統計學意義(P<0.05.( 如圖1 所示) 。Ⅰ、Ⅱ組病理切片中固有層可見大量淋巴細胞與中性粒細胞浸潤( 如圖2) 。Ⅲ組的病理切片中亦有不同程度的炎性反應，但評分低于Ⅰ、Ⅱ組。

2.2活菌攻擊后H.pylori定植量檢測(表2)從表2中可以看出Ⅲ組的活菌定植量低于Ⅰ、Ⅱ組，說明使用滅活H.pylori與LTB共同免疫小鼠后，能減少活菌攻擊后的H.pylori體內定植量，結果具統計學意義(P<0.05)。

Note：Compared with groupsⅠandⅡ,1)P<0.05.

3討論

早在90年代初期，有關H.pylori疫苗的研究就已經開始。近年來，有著較多關于H.pylori疫苗的研究。根據疫苗的構成不同，可將其分為全菌疫苗、亞單位疫苗、表位疫苗、載體疫苗等。亞單位疫苗的結構與組成較為明確，是可引起免疫保護的一類蛋白質、脂多糖等微生物組分。與亞單位疫苗相比，全菌疫苗的優點是能誘發針對細菌各種抗原的免疫應答[8]。但是這些蛋白介導的免疫應答機制仍然不十分清楚，另一方面，現在仍然不能確定對H.pylori整個菌體有效的理想疫苗，與其誘導的免疫應答的效應因子是什么(例如抗體、CD4+亞群、細胞因子等)。雖然目前的研究成果沒能達到人們的期望值，但致力于H.pylori疫苗各個方向的研究人員都在不斷的努力。該疫苗的研究成果在中國較為領先，Zeng等[9]用重組H.pylori疫苗對6~15歲兒童進行口服免疫，結果顯示服疫苗組能降低H.pylori的感染率。在國外，Nedrud等[10]用重組的CTA1-UreB3T-DD疫苗對BALB/c小鼠給予鼻黏膜免疫后，亦產生了良好的免疫反應并減少了H.pylori的定植。但他們的實驗對象多為成年鼠、成人或兒童。

我們將新生BALB/c小鼠作為實驗對象，因為調查結果再次證實部分H.pylori的感染在幼兒期就已存在[11]。我們希望通過對新生嬰兒進行疫苗接種后，達到能在早期預防H.pylori感染的目的。本次實驗結果顯示，在活菌攻擊后，各組均有不同程度的炎癥反應。PBS組的炎性反應較明顯，多數胃黏膜固有層及黏膜下層可見較多淋巴細胞與中性粒細胞的浸潤。滅活H.pylori加佐劑組的炎癥評分結果低于Ⅰ、Ⅱ兩組，提示BALB/c小鼠在新生期口服滅活H.pylori與LTB后能一定程度地降低活菌攻擊后胃黏膜的炎性反應，但與正常對照組比較還存在一定差異?；罹ㄖ擦繖z測所得出的實驗結果顯示，滅活H.pylori加佐劑組在活菌攻擊后的細菌定植量與前兩組比較，結果具有統計學意義。提示該組抗原成分能刺激機體產生黏膜免疫應答來減少細菌的定植。雖然初步的實驗結果令人興奮，但還存在著許多待解決的問題。由于粘膜免疫的特殊性，我們需要一種對胃粘膜具有高免疫原性的疫苗來預防H.pylori 的感染，這包括對抗原與佐劑設計，免疫方法及途徑的進一步探索；我們還需要在新生期機體免疫機制方面進行更深層次地研究。

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[8]閆東梅，朱迅.治療性疫苗的發展現狀與應用前景[J].中國生物制品學雜志，2005，18(6):535-537.

[9]Zeng M,Mao XH,Li JX,etal.Efficacy,safety,and immunogenicity of an oral recombinant Helicobacter pylori vaccine in children in China:a randomised,double-blind,placebo-controlled,phase 3 trial[J].Lancet,2015，386(10002)：1457-1464.

[10]Nedrud JG,Bagheri N,Schn K,etal.Subcomponent vaccine based on CTA1-DD adjuvant with incorporated UreB class II peptides stimulates protective Helicobacter pylori immunity[J].PLoS One,2013，8(12):e83321.

[11]O′Ryan ML,Lucero Y,Rabello M,etal.Persistent and Transient Helicobacter pylori Infections in Early Childhood[J].Clin Infect Dis,2015，61(2):211-218.

[收稿2015-05-15修回2015-08-26]

(編輯許四平)

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《中國免疫學雜志》編輯部

Immunoprotection of gastric mucosa in newborn mice after oral immunization with inactived H.pylori

YANGYu-Xin,JIANGJi-Fu.WomenandChildren′sHospitalofZunyi,Zunyi563000，China

[Abstract]Objective:To explore the Immunoprotection of gastric mucosa in newborn mice after oral immunization with inactived H.pylori .Methods: Thirty-two BALB/c mice were randomly divided into four groups,including PBS control group(groupⅠ),the group of inactivated H.pylori(groupⅡ),the group of inactivated H.pylori and Escherichia cole heat-labile enterotoxin B subunit(LTB)(group Ⅲ),and normal group(group Ⅳ).Newborn BLAB/c mice within 24 hours were immunized through oral gavage with corresponding antigen,Two weeks after final immunization,the mice were challenged with 1×108CFU live H.pylori strain SS1,twice once day,for 2 days.The twenty-eighth day post-challenge,all of mice were sacrificed and stomachs were removed for grades of inflammation and The counting of H.pylori colonizing.Results: The mean scores of stomach tissue inflammation of groupⅠ,Ⅱ,Ⅲ and Ⅳ were 2.25±0.46，2.12±0.35，1.5±0.53，0.25±0.46,respectively,and the score of inflammatory activity of the above four groups were 2.12±0.35，2.12±0.35，1.37±0.52，0.25±0.46.Among these four groups,the results were statistically significant between any two groups except the result between groupⅠand group Ⅱ.Finally,H.pylori colonization quantity in the stomachs of group Ⅲ was lower than groupⅠand group Ⅱ(P< 0.05),as expected,the H.pylori colonization was undetectable in group Ⅳ.Conclusion: The oral gavage with inactived H.pylori plus LTB to newborn mice may be associate with the lightening of inflammation and the decrease of H.pylori colonizing number.

[Key words]Inactivated H.pylori;LTB;Newborn BALB/c mice;Immunoprotection

通訊作者及指導教師：江吉富(1956年-)，男，副教授，碩士生導師，主要從事感染與免疫研究，就職于遵義醫學院，E-mail: jifujiang@163.com。

作者簡介：楊鈺欣(1983年-)，女，碩士，主要從事感染與免疫研究，就職于遵義醫學院，E-mail: yangxx_123@126.com。

中圖分類號R392.9

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)02-0201-04