類風濕性關節炎瓜氨酸化反應研究的最新進展

類風濕性關節炎瓜氨酸化反應研究的最新進展

常曉天鄭亞冰

(山東大學附屬千佛山醫院醫學研究中心,濟南250014)

類風濕性關節炎 (Rheumatoid arthritis,RA) 是一種以慢性侵蝕性關節炎為特征的全身性自身免疫疾病。該病在我國發病率約3‰~5‰。RA患者體內可以檢測到多種抗瓜氨酸化蛋白的自我免疫抗體(Anti-citrullinated peptide antibodies,ACPA)，包括抗角蛋白抗體(Anti-keratin antibody,AKA)、抗環瓜氨酸肽抗體(Anti-cyclic citrullinated peptide antibody,anti-CCP)、抗纖維蛋白原抗體(Anti-fibrinogen antibody,ACF)、抗波形蛋白抗體(Anti-vimentin antibody,anti-MCV)等[1-3]。該類抗體所針對的靶抗原均含有瓜氨酸表位，對RA具有高度的特異性，并且與疾病的嚴重程度密切相關。瓜氨酸是一種非編碼氨基酸，在肽酰精氨酸脫亞胺酶(Peptidyl deiminase，PAD)的催化下，蛋白中的精氨酸殘基轉化成瓜氨酸殘基，這一過程稱為蛋白的瓜氨酸化。瓜氨酸化是蛋白翻譯后修飾的一種形式。蛋白質的瓜氨酸化現象可見于許多疾病，如感染、炎癥、腫瘤及自身免疫性疾病等[4，5]。PAD的表達及瓜氨酸反應在RA患者滑膜組織中高表達，PAD家族的PADI4基因多態性與RA呈明顯相關性，且與ACPA抗體水平具有相關性，但是這種相關性具有一定的種族差異[6，7]。因此，瓜氨酸化反應和PAD在RA發病過程中起著非常重要的作用，一直是RA發病機制研究中的熱點。本文將重點介紹、討論近年來有關RA瓜氨酸化研究的進展、發展趨勢以及作者對該研究的理解和建議。

1篩選新瓜氨酸化蛋白的研究

到目前為止，研究已發現了一些RA的瓜氨酸化蛋白，諸如纖維蛋白原(Fibrinogen)、纖維連接蛋白(Fibronectin)、波形蛋白(Vementin)。但鑒于瓜氨酸化反應在RA發病過程中的重要作用和代謝通路的復雜性，PAD的作用底物應該不止這幾種。隨著分子生物學技術的進步，近年來，有更多的瓜氨酸化蛋白及自我免疫抗體在RA患者的滑膜、滑液和血液中被發現。Gro?b等[8]用110位早期RA患者的血液為探針對HL60細胞的蛋白進行了免疫印跡(Western blot)實驗，然后用蛋白質組學的方法對雜交信號進行了鑒定，發現遠端上游元件結合蛋白1和2[far upstream element-binding proteins (FUSE-BP) 1 and 2]被瓜氨酸化。我們用抗角蛋白抗體AE1/AE3(一種廣譜的抗細胞角質蛋白抗體)和抗瓜氨酸抗體進行了免疫組化和免疫印跡實驗，發現RA滑膜中有角質蛋白(Cytokeratin)表達并被瓜氨酸化[9]。Sawada等[10]在RA滑液中發現了瓜氨酸化的抗原C1q-binding and monoclonal rheumatoid factor (mRF)-binding peptides。最近，我們以RA患者血液為抗體對RA滑膜組織進行了的二維免疫印跡(2D-Western blot)研究，經質譜鑒定和免疫共沉淀分析發現α-1抗胰蛋白酶(A1AT)、細胞角質蛋白84(KRT84)和微管蛋白B(TUBB)在滑膜中高表達并發生瓜氨酸化修飾，而且我們在RA患者的血液中也檢測到高水平的抗KRT84抗體[11]。van Beers等[12]用蛋白質組學方法在RA滑液中檢測出瓜氨酸化蛋白載脂蛋白E(Apolipoprotein E)、髓核分化抗原(Myeloid nuclear differentiation antigen)和β-肌動蛋白(β-actin)。同時發現細胞表面的糖調節蛋白78(Grp78)可能也是ACPA抗原之一，因為他們發現谷胱苷肽S-轉移酶標記的重組Grp78(Glutathione S-transferase-tagged recombinant Grp78)瓜氨酸化之后可結合ACPA[12]。Lu等[13]用環裝瓜氨酸化肽結合親和柱(cyclic citrullinated peptide-conjugated affinity column)從RA血液中純化了ACPA，然后用將ACPA 加入到U937 細胞(人系髓樣白血病細胞系)培養液中。他們發現ACPA 可以增加細胞腫瘤壞死因子(TNF-α)的表達水平和增強NF-κB對DNA的結合能力。隨著研究的深入和研究手段的進步，應該有更多的與RA有關的瓜氨酸化蛋白被發現，為揭示瓜氨酸化反應對RA的作用提供了依據。

2瓜氨酸化反應對RA骨破壞作用的研究

ACPA在RA中特異表達并且與RA病情發展密切相關,但ACPA的作用機制并不很清楚。相比在腫瘤研究領域的進展[14]，RA瓜氨酸化修飾的意義和PAD功能的研究進展并不是很快。自我免疫反應是RA中發生骨破壞的重要因素。Harre等[15]研究發現ACPA與破骨細胞(Osteoclast)調節的骨破壞密切相關，破骨細胞分化過程中波形蛋白(Vimentin)的N端發生瓜氨酸化。純化的抗瓜氨酸化變異波形蛋白(Mutated citrullinated vimentin，MCV)抗體不僅可以結合到破骨細胞表面，而且可以刺激破骨過程和骨的吸收，因此RA anti-vimentin自我免疫抗體的形成會直接誘導骨破壞。另外，在RA滑液中檢測到整合素樣金屬蛋白酶(ADAMTS4)高表達，ADAMTS4也是導致軟骨降解的一個重要的酶，參與骨的降解[16]。ADAMTS4在其蛋白C端可與纖維連接蛋白(Fibronectin)結合，結合后其酶活性受到Fibronectin的抑制[17]。我們前期工作證明，在RA滑膜中有大量的瓜氨酸化的Fibronectin[18]。瓜氨酸化后的Fibronectin失去了對ADAMTS4調控和抑制功能，ADAMTS4活性因此得以增強而導致骨降解加速[19]。Shelef等[20]研究了瓜氨酸化修飾的Fibronectin 對滑膜成纖維狀細胞(Fibroblast)的作用。他們用瓜氨酸化的Fibronectin培養了正常鼠、關節炎鼠和RA患者的Fibroblasts細胞，發現瓜氨酸的Fibronectin可以改變fibroblast細胞轉移和侵入行為，因此細胞外介質的瓜氨酸化是RA病變過程的一個重要步驟[20]。

3瓜氨酸化反應參與RA炎癥機制的研究

瓜氨酸化后的蛋白可轉變成新的免疫原，進而刺激RA的自我免疫反應，但對其具體機制了解不多。TNF-α是免疫炎性因子調控網絡中的關鍵因子，高水平的TNF-α可導致RA患者發生炎癥反應，進而導致組織破壞。因此，TNF-α是RA生物制劑諸如益賽普、阿達木等用來治療RA的靶點[21]。Sokolove等[22]發現瓜氨酸化的纖連蛋白(Fibronogen)更能刺激巨噬細胞表達TNF-α，而且該過程依賴于Toll樣受體4/髓樣分化蛋白[Toll-like receptor 4 (TLR-4)/myeloid differentiation protein (MyD88)]。Van Steendam等[23]發現瓜氨酸化蛋白可以刺激IFN-γ分泌細胞和IL-17分泌細胞增殖。他們認為瓜氨酸化依賴的(Citrulline-dependent)T細胞反應不是RA特有，但RA中高表達瓜氨酸化會打破免疫平衡，從而開啟自我免疫。TNF-α本身也可以被瓜氨酸化。Moelants等[24]用PAD體外處理白介素1β(IL-1β) 和TNF-α，發現TNF-α可以被瓜氨酸化,而IL-1β不行。TNF-α 瓜氨酸化后降低了刺激人Fibroblasts制造趨化因子(chemokine)的能力，但具有維持誘導單核細胞凋亡和壞死的能力[24]。Sanchez-Pernaute等[25]用全基因組表達芯片(Whole-genome-based gene expression array)檢測纖維蛋白(Fibrin)刺激后RA滑膜成纖維細胞(RASF)的全轉錄組表達狀況。他們發現與未修飾的Fibrin相比，用PADI2體外瓜氨酸化Fibrin后，更能刺激RASF促炎性細胞因子(Pro-inflammatory cytokines)的表達，而且Fibrin 調節的炎癥反應是通過 TLR4 通路進行的。

4牙周病與RA相關性的研究

人們很早就開始認為牙周病和RA之間存在某種聯系。近年研究越來越多地發現牙周炎(Periodontitis)和RA發病密切相關。二者在病理上都表現為慢性炎癥、骨損傷、軟組織損傷，并顯示有相似的免疫反應和免疫遺傳機制[26-31]。一項關聯分析結果表明，RA和牙周炎的相對危險度(Odds ratios)在1.8∶1(95%CI:1.0~3.2)到8∶1 (95%CI:2.9~22.1,P<0.001)變化范圍內[31]。牙周炎的重要病原細菌是牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis)，P gingivalis是口腔菌叢的重要細菌之一，而P gingivalis細菌恰恰含有PAD，可以對肽鏈進行瓜氨酸化修飾，而其他的口腔細菌沒有瓜氨酸化反應能力。研究還發現，野生型的P.gingivalis可以瓜氨酸化Fibrinogen 和α-烯醇化酶(α-enolase)[32,33]。Abdullah等[34]報道，P.gingivalis 的PAD存在于P gingivalis細胞表面上,并表現出熱穩定和堿條件下穩定，顯示P.gingivalis 中PAD在炎癥條件下也應當保持其瓜氨酸化能力。Okada等[35]觀察發現一旦治療牙周炎后患者體內抗P.gingivalis抗體降低，RA病情也隨之減輕。更有趣的是，清除口腔牙齦的生物沉淀后RA癥狀也隨之緩解[36]。有人在牙周炎的齦溝液(Gingival crevicular fluid)中發現P.gingivalis，并檢測到ACPA的存在[37]。Nesse等[38]也在牙周炎基質(Stroma)和牙周炎表皮(Epithelium periodontitis)上檢測到和RA滑膜組織一樣的大量瓜氨酸化蛋白存在。上述結果表明，P.gingivalis 因為其具有表達PAD及瓜氨酸化能力，參與RA的自我免疫進程，這也是為什么牙周炎和RA有密切關系的原因[39]。但是，Marchant等[40]認為細胞內源的PAD表達水平不受外源P.gingivalis影響，外源P.gingivalis 可能只催化細胞外介質的瓜氨酸化。

5對RA瓜氨酸化研究的建議

以上是近年來關于RA瓜氨酸化反應研究的一些最新進展，顯示了該領域的研究有了很大的發展?；趯Ρ狙芯款I域的經驗和認識，本文作者對今后RA瓜氨酸化反應的研究有如下建議：

5.1繼續篩選新的RA瓜氨酸化蛋白，探索還有哪些瓜氨酸化蛋白對RA起重要作用到目前為止，已在RA滑膜中發現許多瓜氨酸化反應的靶點，但這些瓜氨酸化蛋白大都是中豐度蛋白，而且多為結構蛋白，很少有代謝通路的蛋白。這些瓜氨酸化蛋白雖然豐度低，但可能在RA調控路徑中扮演十分重要的角色。所以，應該繼續尋找可能的瓜氨酸化調控蛋白，并深入探索其對RA的作用。隨著分子生物學技術的進步應該會有更多新的發現。Okazaki等在此方面進行過嘗試，他們首先用PADI4瓜氨酸化的人軟骨細胞cDNA表達庫(human chondrocyte cDNA expression library)，然后用抗瓜氨酸化抗體(anti-modified citrulline antibody)和RA患者血清去免疫雜交。結果，他們篩選到真核轉錄起始因子(Eukaryotic translation initiation factor 4G1，eIF4G1)的表達。他們的研究證明，50%的RA患者的血清中含有anti-eIF4G1抗體，而且抗體表達水平與anti-CCP 水平密切相關[41]。我們最近用2D-Western blot聯合蛋白質組學方法也發現了數個新的瓜氨酸化蛋白，包括瓜氨酸化的A1AT、KRT84和TUBB[11]。我們首先用2D電泳對RA滑膜組織進行蛋白處理，獲得兩張一樣的凝膠電泳，然后把其中一張按Western blot方法轉到PVDF膜上。我們用RA患者血液對這張PVDF膜雜交，將得到的免疫信號圖案與原始的凝膠電泳蛋白譜作對照，選出有雜交信號的蛋白點做質譜鑒定。我們當時用的7 cm的凝膠電泳。如果用規格更大的凝膠應當獲得更多的低豐度RA瓜氨酸化蛋白。

5.2繼續探索瓜氨酸化反應對RA的作用機制，分析瓜氨酸化反應如何刺激RA雖然瓜酸化反應一直是研究RA的熱點，但有關其對RA的作用機制研究不多，而近年PADI4及其瓜氨酸化對腫瘤發病作用的研究很多。RA和腫瘤組織病理有很多相似之處。他山之石可以攻玉，腫瘤PADI4及其瓜氨酸化作用的研究可以開拓我們的思路。Guo等[42]用高密度蛋白芯片(High-density protein array)尋找新的PADI4底物，發現了40余個潛在的PAD底物，其中包括40S ribosomal protein S2 (RPS2)。而且該研究發現RPS2瓜氨酸化的位置恰好也是蛋白精氨酸轉甲基化酶(Protein arginine methyltransferase 3，PRMT3)甲基化的位置。這種瓜氨酸化和甲基化相互拮抗而調控信號通路的現象在腫瘤細胞中也發現過[43,44]，有異曲同工之妙。

5.3以瓜氨酸化反應為靶點研發RA檢測試劑和治療藥物anti-CCP是很好的RA檢測試劑，但其抗原蛋白為人工的含瓜氨酸的環裝蛋白，那么anti-CCP在RA抗原中是哪種蛋白、一種還是一組不得而知。近年，抗波形蛋白已開始成為檢測RA的指標。因此，應該還有類似的瓜氨酸化蛋白可開發成RA的檢測試劑。還有，既然瓜氨酸化反應在RA發病中起著主導作用，為什么不以瓜氨酸化反應為靶點，通過抑制瓜氨酸化反應治療RA。腫瘤研究方面也已嘗試開發抗PAD的靶向藥物[45,46]。Willis等[47]用PAD的抑制藥物N-α-benzoyl-N5-(2-chloro-1-iminoethyl)-L-ornithine amide (Cl-amidine)處理膠原誘導關節炎(collagen-induced arthritis，CIA)鼠，檢測Cl-amidine對關節炎的治療作用。他們發現Cl-amidine可以有效地降低CIA鼠關節和血清中的瓜氨酸化水平、抗IgG2a anti-mouse type Ⅱcollagen抗體水平、炎癥指數、C3補體沉淀和炎癥指數。所以Cl-amidine可能通過抑制瓜氨酸化而抑制RA進程。Cl-amidine可能是潛在的治療RA藥物。

5.4確認RA瓜氨酸化反應的主導者(到底是PADI2還是PADI4，還是二者都參與了RA催化的瓜氨酸化反應)PAD家族共有5位PAD成員。在這5位PAD成員中，PADI4被證明與RA明顯相關，是RA的易感基因。但是，早在十幾年前，Vossenaar等[48]就分析了4種PAD在RA外周血和關節滑液細胞中的表達。他們在外周血單核細胞中檢測到了PADI2 和 PADI4 mRNA，同時也從RA滑液中檢測到了PADI2 和瓜氨酸化蛋白。Vossenaar[49]后來也在CIA鼠關節滑膜組織中檢測到PADI2 mRNA，但沒有檢測到PADI2 蛋白表達，同時在侵入炎癥關節的中性粒細胞中檢測到PADI4 mRNA及其酶蛋白。他們也在人RA滑膜組織和滑液中檢測到PADI4蛋白表達[50,51]。Foulquier等[52]報道在RA滑膜組織中檢測到PADI2和PADI4，而且炎癥細胞是PAD的主要來源。他們認為PADI2和PADI4都參與到對纖維蛋白Fibrin的瓜氨酸化過程中。我們最近用custom-designed Illumina 96-SNP VeraCode microarray和Sequenom MassARRAY方法分別對267個RA患者和307個RA患者PADI2基因的17個tagSNP進行基因分型，發現rs2235926和rs2057094與PADI2強相關，PADI2是RA易感基因。我們也在RA滑膜中檢測到PADI2蛋白的表達[53]。以上數據顯示，PADI2和 PADI4 都在RA滑膜中表達并可能參與RA的瓜氨酸化。盡管很多研究證明PADI4是RA易感基因并在RA病變關節組織中表達，但無法否認PADI2 甚至 PAD 其他成員也參與了RA病理進程。Darrah等[54]發現PAD有選擇地催化不同的瓜氨酸化底物，PADI2修飾β/γ-actin,PADI4修飾組蛋白H3。他們建議PAD 對底物的特異性可能使RA產生不同自我免疫原[54]。Nakayama-Hamada等[55]用質譜發現，PADI2和PADI4對纖維蛋白原瓜氨酸化方式不一樣，也說明PADI2和PADI4在瓜氨酸化過程中有不同作用。

綜上所述，PAD和瓜氨酸化對包括RA在內的諸多疾病起著重要作用。瓜氨酸化可能和乙?；?、糖基化、甲基化、泛素化等蛋白翻譯后修飾一樣在代謝和基因調控中起著重要作用。有關PAD和瓜氨酸研究可能剛剛開始，今后會有更多的研究去探索PAD和瓜氨酸化調控機制、病理作用及對其藥物的研發。

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[收稿2015-03-25修回2015-04-09]

(編輯倪鵬)

作者簡介：常曉天(1964年-)，男，博士，研究員，博士生導師，主要從事類風濕性關節炎致病機制方面的研究，E-mail:chang-xt@163.com。

中圖分類號R392.1

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)02-0279-05

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.031