人豬鏈球菌感染的臨床實驗室診斷研究進展

劉海珠，袁曉明

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人豬鏈球菌感染的臨床實驗室診斷研究進展

劉海珠1，袁曉明2

1.大連醫科大學附屬威海市立醫院檢驗科，威海264200，Email：haizhu.liu@outlook.com；2.山東省榮成市虎山畜牧獸醫站，榮成264300

摘要：豬鏈球菌(S.suis)是一種重要的人獸共患病原菌，可感染人并導致嚴重的腦膜炎、敗血癥，甚至引起死亡。自1968年國際首次發現了2型豬鏈球菌引起人類嚴重感染的病例以來，國內外又有諸多相關報道。人類在感染該菌的早期并無特異性表現，但病情進展迅速，若不及時診斷并予以干預，死亡率較高。2005年6月至8月在四川省資陽、內江等地區相繼暴發人感染豬鏈球菌病疫情，廣泛引起了國內外的關注。由于S.suis不僅給養豬業造成很大威脅，而且嚴重危害公共衛生安全，對該菌進行準確的早期診斷是控制豬鏈球菌病流行的關鍵。目前，針對該病原體的常見實驗室檢測方法包括微生物檢測法、免疫學檢測法、分子生物學檢測法及動物實驗法等。本文將就人感染S.suis的實驗室診斷研究進展做一簡要綜述。

關鍵詞：豬鏈球菌；人獸共患病原菌；實驗室診斷

豬鏈球菌(Streptococcussuis,S.suis, SS) 為橢圓形或橄欖狀的單個或成對排列的革蘭陽性球菌，多有莢膜，廣泛存在于自然界及豬的扁桃體和氣管分泌物中，是一種重要的人獸共患病原菌。該菌的抵抗力較強，能在糞便、灰塵及水中能存活較長時間，蒼蠅可攜帶該菌并保持傳染性達5 d以上，因而認為蒼蠅為該病的重要傳播媒介。根據該菌莢膜抗原的不同可將其分為35個血清型(1～34型及1/2型)[1]，其中2型流行性最廣、致病性最強。實驗證實，S.suis的莢膜多糖(CPS)、溶菌酶釋放蛋白(MRP)、細胞外因子(EF)、溶血素、黏附素、谷氨酸脫氫酶及纖連蛋白結合蛋白等在該菌的致病過程中起重要作用[2]。生豬屠宰、銷售及肉制品加工人員為本病的易感人群，在接觸被感染的病豬后，該菌可經破損皮膚、粘膜或經消化道侵入人體，并引起人鏈球菌中毒性休克綜合征(STSS)和鏈球菌腦膜炎綜合征(SMS)[3]。STSS和SMS發病急、進展快、死亡率高，有些患者雖經治療后保住性命，但可能導致永久性耳聾等后遺癥的發生。

人感染豬鏈球菌病作為一種新發傳染病，對人類的生命健康構成重大威脅，也對社會的生活秩序、經濟發展造成嚴重負面影響。1998年，江蘇省曾暴發人感染2型豬鏈球菌病疫情，導致25人感染，14人死亡。2005年7月，四川省部分市縣發生疫情，205人感染，37人死亡[4]。我國已將其與布魯氏菌一起定為II類動物疫病。由于該病影響嚴重，對該類病原體的早期診斷顯得尤為重要。目前，針對該病原體的常見實驗室檢測方法包括微生物檢測法、免疫學檢測法、分子生物學檢測法及動物實驗法等。

1微生物學檢測法

S.suis為需氧或兼性厭氧菌，對營養要求較高，普通培養基上生長不良，在厭氧肉湯中生長良好?；颊咴趹每股刂委熐?，以無菌方法抽取患者血液或腦脊液，接種于增菌培養基中于37 ℃進行增菌。當儀器顯示陽性后，立即將培養物轉種于血平板并繼續培養。典型的S.suis在血平板上為α-溶血、針尖大小、圓形、露珠狀、半透明菌落。革蘭氏染色后多為單個或成雙排列，少數呈短鏈狀的陽性球菌[5]。該菌觸酶實驗為陰性，乳糖、蔗糖、甘露醇、纖維二糖、水楊素、七葉素、甘油和山梨醇水解均為陽性，6.5%NaCl中生長呈陽性。若采用API 20 Strep進行快速鑒定也可以滿足初篩要求，2型S.suis的典型生化反應編碼為0641453或0641473，鑒定率可達為99.9%[6]。由于S.suis不同血清型或同一血清型的不同菌株間生化反應有較大差異，故單獨依據菌體及菌落形態、培養特性和生化表型等特征只能作為篩查性鑒定方法，不能很準確地對該菌進行鑒定。

2免疫學檢測法

由于S.suis的生化反應差異較大，傳統分離培養及生化鑒定技術難以將其準確分類，因此，免疫學方法在該菌的鑒定上顯得尤為重要。目前S.suis的免疫學診斷方法較多，其方法上多以S.suis的毒力因子等為靶位，包括溶菌酶釋放蛋白(Mu-Ramidae-Relased Protein, MRP)、細胞外蛋白因子(Extracellularfactor, EF)、溶血素(Suilysin, SLY)、莢膜多糖(Capsularpolysaccharide, CPS)、IgG結合蛋白等，采用免疫熒光技術、毛細沉淀試驗、協同凝集試驗、凝膠內凝集試驗、ELISA技術和Western Blot技術等對培養物進行檢測[7]。目前已建立了一些針對CPS、MRP和EF的免疫學檢測方法。

Charland等[8]制備了兩株CPS缺失變異株，發現CPS是2型菌株的一種重要的致病因子。黃毓茂等[9]采用高壓法代替酸熱法提取抗原并對廣東地區的分離株進行了鑒定，首次證實了2型S.suis在我國的存在。1991年, Kataoka等[10]以菌株D-282的培養上清液為免疫原(主要含有S.suis的MRP和EF)，制備了兔源性多抗和鼠源性單抗，并采用Western Blot的方法成功鑒定了表型為MRP+EF+、MRP+EF-和MRP+EF的菌株。由于Western Blot不適用于大規模的流行病學調查，研究者又于1993年建立了雙抗體夾心ELISA技術用以區分致病性和非致病的2型S.suis。2001年，歐瑜等[11]提純并分離了菌株HA9801的MRP和EF，在制備抗體后建立了適用于流行病學調查的Dot-ELISA和間接ELISA檢測方法。Serhir等[12]利用雙抗體夾心ELISA檢測了S.suis的1、2、1/2、3和22型菌株，該檢測方法的特異性為97.6%，敏感性為62.5%，結果與標準檢測方法一致?？梢?，ELISA是一種很好的S.suis亞型鑒定方法。

目前國內尚缺乏針對S.suis的標準診斷血清，國外的標準血清種類較少(僅有A、B、C、D、E、F、G 7種)，不能滿足對S.suis診斷的需要。傳統免疫學方法中，玻片凝集試驗簡單、快速，但容易出現假陽性；瓊脂擴散特異性強，但敏感性稍差，僅適用于大量樣品的鑒定；毛細管沉淀試驗特異性好，但血清用量較大[13]。ELISA法特異性強、敏感性高，結果判讀方便等，適用于大規模普查，尤其是間接ELISA，該方法需要的血清量較少，優點尤為突出。但這些方法只能鑒別出致病和非致病菌株，要進一步區分出菌株致病性的強弱還需借助Western Blot技術[14]。盡管免疫學方法在對S.suis的檢測中有明顯的優勢，但仍有相當比例的菌株不能定型，因此上述免疫學檢測手段仍待于進一步完善。

3分子生物學檢測法

分子生物學方法是進行S.suis鑒定及流行病學調查的有效方法，該方法不僅可以高效地檢測S.suis的存在，還可以特異地鑒定菌株的血清型。目前較為成熟的S.suis分子生物學檢測方法包括PCR技術、脈沖場凝膠電泳法、限制性片段長度多態性分析和隨機擴增核酸片段多態性分析技術等[15]。

3.1基于莢膜多糖基因的PCR鑒定法由于莢膜多糖是S.suis的35個血清型鑒別的直接依據，Simth等[16]針對該菌的主要致病株莢膜基因設計了3對引物(cps2J、cpsll和cps9H)建立了血清型特異性PCR的檢測方法。該方法可對2型、1/2型1型、14型以及9型S.suis同時進行檢測。silva等[17]根據gdh、cps(l、2、7、9)基因序列設計了可對S.suis同時進行鑒定和分型的引物。Okwumabua等[18]根據2型菌株的gdh基因序列建立了S.suis定群PCR，能特異性地檢測不同組織器官和地域中所有S.suis菌株的血清型。倪艷秀等[19]根據cps 2J合成了1對可擴增675 bp目的片段的引物，并進一步驗證了方法的特異性和準確性。

3.2基于MRP的基因和EF基因的PCR鑒定法

1992年Hildee和Vecht得出了S.suis的完整的mrp基因序列以及側翼序列，何孔旺等[20]、馬清霞等[21]依據該序列合成了引物，建立了能同時檢測2型S.suis及其重要毒力因子溶菌酶釋放蛋白和胞外因子的多重PCR方法，該方法的特異性強、敏感性高、準確性好。林祥梅等[22]建立了直接從生物標本中檢測2型S.suis毒力因子mrp基因和ef基因的多重熒光PCR檢測方法，該方法有效地彌補了傳統方法的不足，并且進一步提高了鑒定效率和準確性。3.3其他分子生物學檢測法Okwumabua等[23]采用RFLP法發現了一個長約1.8 kb的條帶，并認為此條帶可以對大多數S.suis菌株進行準確鑒定，并證明采用RFLP能有效區分傳統免疫學及生化鑒定手段不能區分的S.suis分離株。Forsman等[24]利用16S～23S之間的序列鑒定了由S.suis引起的乳房炎病例。此外，原位分子雜交技術、基于分子伴侶(cpn60)基因、谷氨酸酷脫氫酶蛋白(GDH)等的檢測方法也已逐步應用到了對S.suis的檢測中來[25]。

分子生物學檢測技術以其特異性強、靈敏度高、準確度好的特點，在本病的診斷上有著無可比擬的優勢，但由于其敏感度高，存在易污染的風險，故傳統的PCR技術在臨床上也較少應用[26]。熒光定量PCR及熒光原位雜交技術的興起彌補了這一不足，但此類方法成本較高、需要特殊檢測儀器、方法的靈敏度也有待于進一步提升[27]。

4動物實驗檢測法

對2型S.suis而言，其致病性的確定一直是個難題。何家惠等[28]在以家兔為模型研究S.suis的毒力時，發現分別通過靜脈、肌肉及皮下接種菌株均可致家兔發病并至敗血型死亡。最短死亡時間為12 h，并伴有典型神經癥狀。Kataoka 等[29]用小鼠作為2型S.suis的動物模型，認為BALB/c和SS小鼠較C57BL/6、ICR、BddY小鼠更易感。吳全忠等[30]采用江蘇分離株HA9801感染豚鼠并建立了動物模型，發現其發病規律和可重復性較好，而且皮下接種比腹腔和鼻腔接種更易引起腦膜炎，因此他們認為豚鼠可作為2型S.suis毒力檢測的較好的動物模型。

由于人豬鏈球菌病發病急，進展快，動物實驗在臨床工作中難以發揮較大作用，因此動物實驗多僅局限地應用于科研領域。

5展望

豬鏈球菌病為國家規定的二類人畜共患傳染病，臨床上以敗血癥型和腦膜炎型人豬鏈球菌病較為常見。由于該病在發病早期即可出現中毒休克癥狀并引起多臟器功能衰竭、疾病發展迅速、病情嚴重，嚴重威脅人類健康。因此對本病的早期診斷成為延長患者生存期的關鍵因素，隨著病原學檢測技術的不斷發展，對本病的檢測手段已從傳統的分離培養、生化鑒定時代過渡到了分子生物學技術檢測時代，PCR、RFLP、熒光原位雜交等方法正逐步運用于臨床。隨著分子生物學技術的日益發展，我們期待將會有更高效、特異、靈敏的檢測手段應用于臨床，為患者的診斷及治療爭取到更多時間。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.05.014

中圖分類號：R378

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)05-490-04

收稿日期：2015-07-18修回日期：2015-12-19

Research advances in clinical laboratory diagnosis ofStreptococcussuisinfection

LIU Hai-zhu1，YUAN Xiao-ming2

(1DepartmentofClinicalLaboratory,WeihaiMunicipalHospitalAffiliatedtoDalianMedicalUniversity,Weihai, 264200China；2HushanAnimalHusbandry&VeterinaryStation，Rongcheng,Shandong, 264300China)

AbstractStreptococcus suis(S.suis) is an important pathogen of zoonotic infectious diseases. Once human being suffered from S.suis, it will cause severe meningitis, septicemia, sometimes even cause death. Many related reports have been covered since Streptococcus suis serotype 2 was found to cause serious infection in human being for the first time in 1968. It is a rapid-developing critical disease with a high mortality and has nonspecific clinical symptoms at the early stage. An outbreak of people infected with S.suis in Ziyang and Neijiang of Sichuan Province from June to August 2005 had aroused extensive attention. S.suis is not only greatly harmful to culturist, but also underlying dangerous to public health security, so timely and early diagnoses have become the key question to control the prevalent of S.suis. At present, the common laboratory detection methods include microbial detection, immunoassay, molecular biological test and animal experiment method. This article reviews progress in the research of laboratory diagnosis of human infected with S.suis.

Key words：Streptococcus suis； zoonotic pathogen； laboratory diagnosis