煙草茄尼醇生物合成基因

閆　寧，劉艷華，張洪博，張忠鋒

（中國農業科學院煙草研究所，青島 266101）

煙草茄尼醇生物合成基因

閆寧，劉艷華，張洪博，張忠鋒

（中國農業科學院煙草研究所，青島 266101）

茄尼醇不僅是合成輔酶Q10和維生素K2等泛醌類藥物的重要中間體，而且是卷煙煙氣多環芳烴的重要前體物，對卷煙安全性有較大影響。綜述了煙草茄尼醇生物合成途徑及其關鍵酶基因的研究進展，展望了其在煙草醫藥價值開發和低危害煙草品種培育中的應用潛力。

煙草；茄尼醇；生物合成；基因；代謝調控

茄尼醇（solanesol）是由9個類異戊二烯單元組成的非環式萜醇，可以用于合成輔酶Q10和維生素K2等泛醌類藥物［1-2］。卷煙燃燒過程中，茄尼醇裂解產生多環芳烴，對卷煙安全性產生不利影響［3］。自從在煙草中首次發現茄尼醇以來［4］，茄尼醇在番茄和馬鈴薯等茄科作物中均有報道，但在煙草中含量最高［1，3-6］。由于茄尼醇碳鏈較長，化學合成難度很大［7］，因此主要依賴于從煙葉中提取獲得［1，6］。煙葉茄尼醇含量是茄尼醇獲得量的主要限制因子，煙葉茄尼醇含量由主基因和多基因共同決定，并以主基因遺傳為主［8］。茄尼醇既是合成泛醌類藥物的重要中間體，也是卷煙煙氣多環芳烴的重要前體物。因此，煙草茄尼醇合成代謝調控對煙草醫藥價值開發和低危害煙草品種培育具有重要意義。

1　煙草茄尼醇生物合成途徑

在煙草中，茄尼醇是在質體中經由2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）途徑合成的［1，6，9］。1-脫氧-5-磷酸木酮糖合成酶（DXS）催化丙酮酸和甘油醛-3-磷酸縮合生成1-脫氧-5-磷酸木酮糖（DXP），DXP在1-脫氧-5-磷酸木酮糖還原異構酶（DXR）的催化下經過分子內重排和還原反應生成MEP；MEP在2C-甲基赤蘚糖醇-4-胞苷焦磷酸合成酶（CMS）、2C-甲基赤蘚糖醇-4-胞苷焦磷酸激酶（CMK）、2-甲基赤蘚糖醇-2，4-環焦磷酸合成酶（MCS）和1-羥基-2-甲基-2-丁烯-4-焦磷酸合成酶（HDS）的依次催化下生成1-羥基-2-甲基-2-丁烯-4-焦磷酸（HMBPP）；1-羥基-2-甲基-2-丁烯-4-焦磷酸還原酶（HDR）催化HMBPP生成C5異戊烯基焦磷酸（IPP）和C5二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）；IPP和DMAPP之間的轉換由異戊烯基焦磷酸異構酶（IPI）完成［1，6，10］。牻牛兒基焦磷酸合酶（GPPS）催化IPP和DMAPP生成C10牻牛兒基焦磷酸（GPP），法尼基焦磷酸合酶（FPPS）催化IPP和GPP生成C15法尼基焦磷酸（FPP），牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶（GGPPS）催化IPP和FPP生成C20牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（GGPP）［11-12］。茄尼基焦磷酸合酶（SPS）能夠催化IPP、DMAPP、GPP、FPP、GGPP生成C45茄尼基焦磷酸（SPP），SPP焦磷酸基團轉變為羥基即生成茄尼醇［1，2，6］。

2　煙草茄尼醇生物合成關鍵酶基因

2.11-脫氧-5-磷酸木酮糖合成酶基因

1-脫氧-5-磷酸木酮糖合成酶，簡稱DXS，是MEP代謝途徑中的第一個酶，它催化丙酮酸和甘油醛-3-磷酸生成DXP［1，6］。目前，已在蒺藜苜蓿［13］、番茄［14-15］、擬南芥［16］和煙草［17］等中鑒定出DXS基因。在蒺藜苜蓿中，鑒定到兩個DXS基因，其中MtDXS1在除根以外的植物組織中表達，而MtDXS2僅在菌根真菌定殖的根中表達量較高［13］。在番茄中，DXS基因表達水平和番茄果實類胡蘿卜素含量呈正相關［14］；番茄SlDXS2基因沉默導致β-水芹烯含量下降［15］。通過對擬南芥DXS基因進行過表達或基因沉默發現，與野生型植株相比，轉基因植株葉綠素、生育酚、類胡蘿卜素、脫落酸和赤霉素含量發生明顯變化［16］。將擬南芥DXS基因在薰衣草中進行表達可以顯著提高葉片和花中的精油含量［18］；將編碼DXS和類胡蘿卜素合成相關酶的基因共轉化至大腸桿菌中，可以顯著提高番茄紅素和玉米黃質等的含量［19］；在煙草中，DXS定位于葉綠體中，DXS基因沉默導致葉綠素和類胡蘿卜素含量顯著下降［17］。最近，Campbell等［20］發現，將馬鈴薯DXS1、DXS2基因在本氏煙中進行瞬時表達可以顯著提高茄尼醇含量。因此，DXS是茄尼醇生物合成中的第一個關鍵酶基因，其過表達或抑制表達能夠導致下游代謝產物含量發生變化。

2.21-脫氧-5-磷酸木酮糖還原異構酶基因

1-脫氧-5-磷酸木酮糖還原異構酶，簡稱DXR，它催化DXP經過分子內重排和還原反應生成MEP［1，6］。目前，已在薄荷［21］、番茄［22］、玉米［23］、橡膠［24］和煙草［25-27］等中鑒定到DXR基因。DXR基因過表達導致擬南芥葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量升高［28］；在薄荷中過表達DXR基因，可以使薄荷精油產量提高50%［29］。Wu等［30］從丹參須根中克隆到DXR基因，并發現其在高滲透壓和真菌激發子處理下表達量增加，而且其表達量與丹參酮含量呈正相關。馬靚［25］首次從煙草中克隆獲得一個DXR基因，該基因開放讀碼框長度為1，422 bp，編碼473個氨基酸，且N-末端有一個富含脯氨酸殘基的信號肽。Zhang等［27］從普通煙草中鑒定到兩個DXR基因NtDXR1和NtDXR2，Southern印跡和基因分型表明，它們分別來源于絨毛煙草和林煙草；它們均是在葉片中表達量最高，花和莖中其次，根和種子中最低。煙草DXR基因敲除植株呈現白化表型［26］，而煙草DXR基因的葉綠體過表達可以提高茄尼醇等萜類化合物的含量［31］。最近，Campbell等［20］發現，將馬鈴薯DXR基因在本氏煙中進行瞬時表達可以顯著提高茄尼醇含量。因此，DXR是茄尼醇生物合成中的關鍵酶基因，其過表達可以促進茄尼醇等下游代謝產物積累。

2.3異戊烯基焦磷酸異構酶基因

異戊烯基焦磷酸異構酶，簡稱IPI，它可以催化IPP和DMAPP之間的互相轉換，IPP在IPI和Mg2+的催化下轉化為DMAPP［1，6］。目前，已在煙草［32］、擬南芥［33-34］、番茄［35］和長春花［36］等中鑒定到IPI基因。在煙草中，鑒定到兩個IPI基因，IPI1、IPI2分別定位于葉綠體和細胞質中，高鹽、高光照條件下IPI1表達量增加，高鹽、低溫條件下IPI2表達量增加，而100 μmol/L ABA處理后IPI1和IPI2表達量均增加［32］。在擬南芥中，鑒定到兩個IPI基因，AtIPI1、AtIPI2分別定位于質體和線粒體中［33］；AtIPI1、AtIPI2單突變體表型都正常，但AtIPI1、AtIPI2雙突變體在長日照條件下表現出植株矮化和雄性不育癥狀，且其甾醇和泛醌含量降低50%以上［34］。在大腸桿菌中導入IPI基因，導致多種萜類化合物含量增加［37］；在單細胞綠藻中導入IPI基因，導致類胡蘿卜素含量增加，且類胡蘿卜素含量與IPI基因表達量呈正相關［38］。最近，Campbell等［20］研究發現，將馬鈴薯IPI與SPS基因在本氏煙中進行共同表達可以顯著提高茄尼醇含量。因此，IPI是萜類化合物生物合成中的關鍵酶基因，其過表達或抑制表達能夠導致下游代謝產物含量發生變化。

2.4法尼基焦磷酸合酶基因

法尼基焦磷酸合酶，簡稱FPPS，它催化IPP和GPP生成FPP［12］。FPP是合成倍半萜和多萜醇等萜類化合物的前體物，例如甾醇和茄尼醇等［12，39］。段娜娜等［40］克隆獲得K326煙草品種FPPS基因，其cDNA序列全長705 bp，編碼234個氨基酸，其核苷酸序列與玉米、杜仲、擬南芥、青蒿FPPS基因核苷酸序列同源性分別為74%、76%、77%、80%。將人參FPPS基因轉入積雪草中，能夠導致下游達瑪烯二醇合酶、環阿屯醇合酶基因表達量以及鯊烯、植物甾醇含量升高［41］。將酵母FPPS基因轉入煙草后，轉基因植株中的甾醇和類胡蘿卜素含量顯著提高［42］；將薄荷FPPS基因轉入煙草后，轉基因植株對赤星病抗性提高［43］，煙葉類胡蘿卜素合成相關基因Psy、Lycb表達量和總類胡蘿卜素含量升高［44］，烤后煙葉8種類胡蘿卜素降解產物、茄酮、新植二烯含量和感官評吸質量提高［45］。因此，FPPS是萜類化合物生物合成中的關鍵酶基因，其過表達能夠促進下游代謝產物積累。

2.5牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶基因

牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶，簡稱GGPPS，它催化IPP和FPP生成GGPP［46］。GGPP是合成二萜、四萜和多萜類化合物的共同前體，參與葉綠素、類胡蘿卜素、細胞分裂素、赤霉素、脫落酸、質體醌、泛醌和多萜醇等的合成［47-48］。植物GGPPS分為大亞基和小亞基兩個分支，普通煙草中鑒定出9個GGPPS家族成員，其中大亞基7個、小亞基2個；林煙草、絨毛煙草中分別鑒定出5個GGPPS家族成員，其中大亞基4個、小亞基1個［49］。NtGGPPS3屬于大亞基［50］，定位于葉綠體和質膜上，NtGGPPS3基因在煙草重要生育期各組織中均有表達，在葉和莖中的表達量相對較高［51］；NtGGPPS5屬于小亞基，NtGGPPS5基因在煙草根、莖、葉和芽中均有表達，其表達量排序為：芽＞葉＞莖＞根［52］。茉莉酸甲酯處理后NtGGPPS1表達量顯著升高，而生長素處理后NtGGPPS1表達量下降；與對照植株相比，NtGGPPS1基因沉默植株葉綠素和類胡蘿卜素含量顯著降低［53］。最近，Campbell等［20］研究發現，將馬鈴薯GGPPS3基因在本氏煙中進行瞬時表達可以顯著提高茄尼醇含量。因此，GGPPS是萜類化合物生物合成中的關鍵酶基因，其過表達可以促進茄尼醇等下游代謝產物積累。

2.6茄尼基焦磷酸合酶基因

茄尼基焦磷酸合酶，簡稱SPS，它催化IPP、DMAPP、GPP、FPP、GPPP生成SPP，SPP是茄尼醇和質體醌合成的前體物［1，2，6］。目前，已在擬南芥［54-57］、橡膠［58］、水稻［59］、番茄［60］和煙草［2］等中鑒定出SPS基因。在擬南芥中，鑒定到兩個SPS基因，而且AtSPS1和AtSPS2在葉片和莖中表達量顯著高于根中［55］。AtSPS1和AtSPS2基因沉默會降低葉片中的質體醌含量并誘導產生光系統Ⅱ光抑制［57］，而fibrillin 5（FBN5）可以結合到AtSPS1和AtSPS2上調控質體醌合成［61］。在水稻中，鑒定到兩個SPS基因，OsSPS1、OsSPS2分別定位于線粒體和質體中，OsSPS1優先催化FPP合成線粒體中的泛醌-9，OsSPS2優先催化GPP合成質體醌-9［59］。在煙草中，NtSPS1和NtSPS2表達量在煙株不同器官中的排序為：葉＞莖＞根，這與茄尼醇、葉綠素在煙株中的分布規律一致［2］；NtSPS1和NtSPS2均定位于葉綠體中［2］，這與番茄SPS的亞細胞定位相一致［60］；NtSPS1和NtSPS2均存在兩個保守的DDxxD結構域［2］，其參與協調二價金屬離子和焦磷酸基團結合，對反應底物的定位起關鍵作用［11］。番茄SPS在煙草中過表達可以顯著提高未成熟葉片中的質體醌含量和成熟葉片中的茄尼醇含量［60］，而將馬鈴薯SPS基因分別與DXS、DXR、CMS、CMK、MCS、HDR、IPI、GGPPS3基因在本氏煙中進行共同表達可以顯著提高茄尼醇含量［20］。因此，SPS是茄尼醇生物合成中的關鍵酶基因，其過表達可以促進茄尼醇等下游代謝產物積累。

3　問題與展望

茄尼醇既是合成輔酶Q10和維生素K2等泛醌類藥物的重要中間體，也是卷煙煙氣多環芳烴的重要前體物，對卷煙安全性有較大影響。近年來，茄尼醇生物合成關鍵酶基因的分離鑒定與基因功能研究取得了較大進展，但是茄尼醇合成代謝調控機制仍有許多不明之處。煙草、番茄和馬鈴薯等基因組序列信息為茄尼醇合成代謝調控機制的深入研究提供了序列基礎，在闡明茄尼醇合成代謝途徑的基礎上，可以利用轉錄組等組學方法揭示茄尼醇代謝流的分配規律以及與其他代謝途徑之間的互作機制。此外，將茄尼醇生物合成中的關鍵酶基因在微生物中進行異源表達，不僅可用于鑒定茄尼醇生物合成關鍵酶基因的功能，而且可用于生產具有藥用價值的茄尼醇衍生物；通過轉基因技術或基因組編輯技術干擾、沉默或敲除煙草茄尼醇合成代謝關鍵基因，獲得茄尼醇含量降低的煙草轉化植株，為培育煙氣多環芳烴含量降低的煙草品種奠定基礎，對提高煙草醫藥價值和煙草行業轉型升級都具有重要意義。

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Solanesol Biosynthetic Genes in Tobacco (Nicotiana tabacum L.)

YAN Ning， LIU Yanhua， ZHANG Hongbo， ZHANG Zhongfeng
（Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China）

Solanesol is not only an important intermediate for the synthesis of ubiquinone drugs， such as coenzyme Q10 and vitamin K2， but is also an important precursor of polycyclic aromatic hydrocarbons in cigarette smoke， and has a great influence on the safety of cigarette. In this paper， the solanesol biosynthetic pathways and their key enzyme genes were summarized. It provided useful information for medical value development of tobacco and cultivation of less harmful tobacco varieties.

tobacco； solanesol； biosynthesis； gene； metabolic regulation

S572

1007-5119（2016）05-0098-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.05.018

中國煙草總公司基因組重大專項項目［110201401008（JY-08）］；中國農業科學院科技創新工程（ASTIP-TRIC05）；中國農業科學院基本科研業務費專項

閆 寧，男，博士，助理研究員，從事煙草功能成分與綜合利用研究。E-mail：yanning5110@163.com

2016-08-15

2016-09-24