負載HPV16L1抗原的DC疫苗的構建及免疫效果的研究

羅婧 楊鳴 劉鐵威 齊亭娟 曾毅 周玉柏

100124北京工業大學生命科學與生物工程學院病毒藥理室（羅婧、楊鳴、劉鐵威、齊婷娟、周玉柏）；100032北京，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所傳染病預防控制國家重點實驗室（曾毅）

負載HPV16L1抗原的DC疫苗的構建及免疫效果的研究

羅婧 楊鳴 劉鐵威 齊亭娟 曾毅 周玉柏

100124北京工業大學生命科學與生物工程學院病毒藥理室（羅婧、楊鳴、劉鐵威、齊婷娟、周玉柏）；100032北京，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所傳染病預防控制國家重點實驗室（曾毅）

目的構建負載HPV16L1抗原的樹突狀細胞疫苗DC?L1，研究DC?L1在小鼠體內誘導的特異性體液及細胞免疫應答。方法使用重組細胞因子組合對樹突狀細胞的前體細胞進行體外分化及誘導成熟，利用表達HPV16L1抗原的重組腺病毒載體Ad5?HPV16L1感染成熟DC細胞獲得樹突狀細胞疫苗DC?L1。使用DC?L1與Ad5?HPV16L1疫苗分別免疫C57BL／6小鼠，在不同的時間點使用定量ELISA及ELISPOT對疫苗誘導的L1特異性體液及細胞免疫應答進行檢測。結果DC?L1細胞具有典型的樹突狀細胞的形態特征，western blot可檢測到HPV16L1抗原的表達；DC?L1及重組腺病毒疫苗均可在小鼠體內誘導L1特異性的細胞免疫應答，但二者動力學特征存在差異，重組腺病毒組單針接種后可快速誘導L1特異性細胞免疫應答，免疫后第3周反應達到峰值，之后緩慢下降，而DC?L1組呈緩慢上升的趨勢，在免疫后第5周才逐漸超過重組腺病毒組的反應水平。體液免疫方面，DC?L1及重組腺病毒疫苗單針接種后均能在小鼠體內誘導L1特異性體液免疫應答，且具有相似的免疫動力學特征。結論成功構建了樹突狀細胞疫苗DC?L1；DC?L1可在小鼠體內誘導高水平的HPV16L1特異性的細胞及體液免疫應答。

Fund program：National Hightech R＆D Program of China（863 Program）（2012AA02A404）

大量流行病學及分子生物學研究表明，高危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的持續感染是多種上皮性惡性疾病，比如宮頸癌、食管癌、乳腺癌、結腸癌、口腔癌、胃癌的主要病毒學病因［1］。一般認為HPV L1在病毒基因組整合過程中發生缺陷或基因丟失從而在腫瘤細胞中沒有表達。然而，近來的免疫組化分析顯示，在宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）1期、2期以及3期的患者中，L1蛋白的檢出率分別為83.53%、41.81%和3.13%［2］。Bellone等人的研究顯示，在宮頸組織速凍標本中E6及L1蛋白的表達水平并無顯著差異［3］。本實驗室的前期研究顯示，在食管癌原代細胞以及癌細胞株內均能檢測到HPVL1蛋白的表達（數據未發表）。L1蛋白在感染細胞及腫瘤細胞中的持續表達是特異性細胞免疫清除感染細胞的前提條件，這為開發基于HPVL1的新型治療性疫苗提供了實驗依據。

樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）是迄今人類發現的唯一能夠刺激初始T細胞的活化增殖和功能最強大的抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）［4］。多項動物實驗及臨床I、II、III期研究均證明負載相應抗原的DC細胞可誘導特異性細胞免疫應答，具有抗腫瘤免疫保護效應［5］。本研究在前期實驗基礎上，利用重組腺病毒載體將HPV16L1抗原負載體外誘導成熟的DC細胞，構建樹突狀細胞疫苗DC?L1，并分別通過單獨接種重組腺病毒疫苗及DC?L1對各自誘導的L1特異性體液及細胞免疫應答進行研究，比較二者在免疫動力學上的差異，為DC?L1疫苗的進一步應用奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗株：重組腺病毒Ad5?HPV16L1載體疫苗由本室構建并保存。

1.1.2 實驗動物及主要試劑：HPV16L1單克隆抗體（Camvir?1）購于英國Abcam公司；IL?4、GM?CSF、 TNF?α購自美國Peprotech公司；淋巴細胞分離液EZ?SepTMMouse、EZ?CultureTM ELISPOT專用無血清培養基、小鼠IFN?γ ELISPOT試劑盒購于達科為生物技術有限公司；實驗用SPF級別C57BL／6小鼠購自維通利華實驗動物中心。

1.2 小鼠骨髓源DC前體細胞的分離培養及誘導成熟頸部脫臼法處死6?8周齡C57BL／6小鼠，無菌環境下剝離小鼠雙側股骨和脛骨，剪掉兩端骨骺，2 ml注射器吸取無血清RPMI1640培養液從骨兩端反復沖洗直至骨變白。200目濾網過濾細胞懸液，加入紅細胞裂解液去除紅細胞，RPMI1640洗滌兩次，用1 ml RPMI1640培養液重懸骨髓細胞，調整細胞濃度至1.0×106細胞／ml后接種至100mm培養皿中，每兩天3／4量換液，培養至第六天，半量換液，并加入終濃度50 ng／ml的TNF?α，繼續培養至第7 d，收集懸浮及半貼壁的成熟DC細胞。

1.3 DC?L1疫苗的制備及鑒定成熟DC細胞以1.0×106細胞／孔接種六孔板。次日，以感染復數（multiplicity of infection，MOI）100的重組腺病毒載體AdV?HPV16L1感染成熟DC細胞，感染48 h后，收集HPV16L1抗原負載的DC細胞，命名為DC?L1。裂解適量的DC?L1細胞，使用SDS?PAGE電泳分離細胞總蛋白，使用半干電轉儀將蛋白轉印至PVDF膜，以HPV16L1單抗（Camvir?1）為一抗（1∶3000稀釋），熒光標記抗體IRDye800CW Goat（polyclonal）Anti?Mouse IgG（H＋L）為二抗（1∶2000稀釋），進行western blot實驗，使用Odyssey遠紅外影像分析儀（LI?COR Biosciences公司）對結果進行觀察。

1.4 DC?L1疫苗免疫C57BL／6小鼠將60只雄性C57BL／6小鼠隨機分為三組，每組20只。采用肌肉注射的方法，分別用DC?L1、Ad5?HPV6L1和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）免疫小鼠一次，DC?L1接種劑量為2.0×105細胞／只，Ad5?HPV6L1劑量為4.0×108vp／只，PBS劑量為100 μl／只。分別于免疫后1周、3周、4周、5周分別通過酶聯免疫斑點測定法（enzyme?linked immunospotassay，ELISPOT）和定量酶聯免疫吸附測定法（enzyme?linked immunosorbent assay，ELISA）檢測各組小鼠體內誘導的L1特異性細胞與體液免疫應答。

1.5 HPV16L1特異性細胞免疫應答的檢測使用IFN?γ ELISPOT試劑盒對各組小鼠誘導的L1特異性細胞免疫應答進行檢測。在免疫后不同時間點取小鼠脾臟，加入5ml淋巴細胞分離液于200目篩網上研磨小鼠脾臟，將過濾后的脾細胞懸液離心，收集分層的淋巴細胞，調整細胞濃度為1.0×106細胞／ml，加入預包被的ELISPOT 96孔板中100 μl／孔，陽性對照孔加入10 μl的PMA，樣品孔加入10 μl HPV16L1刺激肽段，陰性對照孔加100 μl淋巴細胞，空白對照孔加入100 μl RPMI1640培養基，將ELISPOT板置37℃、5%CO2培養箱中培養16?20 h。加入去離子水，200 μl／孔，4℃裂解細胞10 min。使用1×washing buffer洗板5?7次，加入稀釋好的生物素標記的抗體工作液，100 μl／孔，37℃孵育1 h。使用1×washing buffer洗板5次，加入稀釋好的酶標親和素工作液，100 μl／孔，37℃孵育1 h。加入現配的AEC顯色液100 μl／孔，室溫避光顯色15?45 min后終止顯色，于陰涼通風處晾干。ELISPOT板送達科為公司進行讀板分析。

1.6 HPV16L1特異性體液免疫應答的檢測使用定量ELISA法檢測各組小鼠血清中HPV16L1總抗體的濃度。HPV16L1VLP以0.25 μg／孔劑量包被ELISA板，以HPV16L1單克隆抗體（Camvir?1）做為抗體標準品，1∶1 000起始，倍比稀釋至1∶32 000。待測樣品血清按1∶50、1∶100、1∶1 000稀釋，每孔100 μl加到ELISA板中，同時設置陰性對照組和空白組對照。37℃孵育2 h，洗板5次后加入HRP標記羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育2 h，洗板5次后每孔加入100 μl顯色液，37℃避光顯色10?30 min，每孔加入50 μl終止液，終止顯色。使用酶標儀，于450 nm波長，讀出OD值。根據HPV16L1單克隆抗體吸光值數據確定標準曲線，計算各待測樣品中HPV16L1特異性抗體濃度。

1.7 數據分析及處理特異性細胞免疫反應水平用每百萬個脾淋巴細胞中斑點形成細胞數（spots formingcells／millionsplenocytes）計量；利用GraphPad Prism 5統計學軟件分析結果并繪制圖表。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠骨髓源DC前體細胞的分離培養及誘導成熟通過細胞因子組合共培養的方法，從約3.0 ×107骨髓單個核細胞中最終獲得約1.0×107成熟的DC細胞。顯微鏡下觀察可見，誘導培養后第3天，細胞多為形態比較規整、圓球狀、懸浮生長的不成熟DC細胞（圖1A）；誘導培養第5天，部分細胞表面出現小突起，呈不規則形狀（圖1B）；而誘導培養第7天，大部分細胞表面出現明顯的樹枝狀突起，呈現典型的樹突狀細胞的形態（圖1C）。

A：誘導后第3天細胞形態（×200）；B：誘導后第5天細胞形態（×200）；C：誘導后第7天細胞形態（×400）圖1 誘導后不同時間點DC細胞形態特征的顯微鏡圖像A：Morphologic characteristics of cells after 3 days induction（×200）；B：Morphologic characteristics of cells after 5 days induction（×400）；C：Morphologic characteristics of cells after 7 days induction（×400）Fig.1 The microscopic images of morphologic characteristics of DCs at different time points after induction

2.2 DC?L1疫苗的制備及鑒定利用腺病毒載體Ad5?HPV6L1感染成熟DC細胞，獲得負載HPV16L1的DC?L1疫苗。感染后48 h進行western blot分析，結果顯示：DC?L1泳道在55kd處有特異性條帶，大小與預期相符；而DC對照組泳道在相應位置無條帶（圖2），表明負載HPV16L1抗原的DC? L1細胞可有效表達HPV16L1抗原。

2.3 HPV16L1特異性細胞免疫應答的檢測DC?L1及重組腺病毒Ad5?HPV6L1疫苗以肌注方式免疫C57BL／6小鼠，在免疫后不同時間點，分離各組小鼠脾淋巴細胞，通過ELISPOT檢測誘導的L1特異性細胞免疫應答水平。結果顯示，DC?L1及重組腺病毒疫苗均可誘導產生L1特異性的細胞免疫應答，但二者在免疫動力學特性上存在差異。腺病毒疫苗單針接種可迅速誘導特異性細胞免疫應答，在免疫后第3周，ELISPOT斑點數達到峰值，之后緩慢下降。而DC?L1疫苗組單針接種后經歷了一個較長的無應答期，直到免疫后第4周ELISPOT斑點數才出現顯著的增加，且細胞免疫應答隨著時間的推移而緩慢增強，在免疫后第5周，DC?L1疫苗組ELISPOT斑點數才逐漸超過Ad5?HPV6L1疫苗組（圖3）。

圖2 Western blot檢測HPV16L1蛋白的表達Fig.2 Detection of HPV16L1 protein expression using western blot

圖3 ELISPOT檢測小鼠體內誘導HPV16L1特異性細胞免疫應答Fig.3 Detection of HPV16L1 specific cellular immune response by ELISPOT

2.4 HPV16L1特異性體液免疫應答的檢測使用定量ELISA法檢測各組小鼠血清中HPV16L1總抗體濃度。結果顯示，Ad5?HPV16L1和DC?L1疫苗組單獨免疫小鼠后均可誘導L1特異性的血清抗體，兩組免疫動力學特性相似，雖然Ad5?HPV16L1組在各檢測時間點的抗體濃度均高于DC?L1組，但二者差異無統計學意義（P＞0.05）（圖4）。

圖4 定量ELISA法檢測小鼠血清HPV16L1特異性抗體Fig.4 Detection of HPV16L1 specific antibodies in mice by quantitative ELISA

3 討論

DC細胞是迄今人類發現的唯一能夠刺激初始T細胞的活化增殖和功能最強大的抗原提呈細胞，其可介導抗原轉移，在體內激活靜息T細胞，啟動特異性免疫應答［6］。目前DC細胞已經應用于多種腫瘤疫苗的研究中，并在黑色素瘤、神經膠質瘤、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、腎癌等惡性腫瘤的臨床治療中取得令人鼓舞的結果。HPV治療型疫苗大都以E6、E7為靶抗原，然而本實驗室的前期結果顯示，HPV16L1在癌前病變及癌組織中均有一定的表達。構建基于HPV16L1的疫苗，同時誘導機體產生病毒中和抗體及特異性細胞免疫應答，可提供更為全面的保護作用。

本研究采用經典的DC細胞體外分離培養法，并通過改進細胞培養條件以獲得更多的成熟DC細胞［7］，從一只小鼠體內平均可收獲約1.0×107的成熟DC細胞，這與文獻報道相符［8］。動物實驗結果顯示，Adv?HPV16L1和DC?L1疫苗誘導的體液免疫反應水平相當，且在免疫后5周仍未見減弱趨勢，這提示兩種形式疫苗可能通過相似的途徑激活機體的體液免疫應答，但Adv?HPV16L1還可通過有效刺激固有免疫來進一步增強特異性免疫應答的效果，這種差別在細胞免疫方面體現得更為明顯，Adv?HPV16L1組在接種后可迅速產生免疫反應，而DC?L1疫苗組則需經歷三周的無應答期。此外，上述差異還可能反映了目前DC疫苗制備方法中較長的體外培養時間以及高濃度細胞因子體外誘導過程對DC細胞功能的損害，導致回輸的DC細胞在免疫功能方面較體內天然DC細胞偏低［9］。因此，改進DC疫苗的制備方法，比如縮短DC細胞體外培養時間、或直接使用體內天然DC細胞進行抗原負載可能獲得更為理想的免疫效果。綜上所述，本實驗構建的基于HPV16L1的DC?L1疫苗可誘導較高強度和較長持續時間的特異性細胞及體液免疫應答，為DC?L1疫苗的進一步應用奠定了實驗基礎。

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Construction and Immune evaluation of the dendritic cell vaccine pulsed with HPV16L1

Luo Jing，Yang Ming，Liu Tiewei，Qi Tingjuan，Zeng Yi，Zhou Yubai

Laboratory of Virology and Pharmacology，College of Life Science and Bioengineering，Beijing University of technology，Beijing 100124，China（Luo J，Yang M，Liu TW，Qi TJ，Zhou YB）；National Institute for Viral Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control，Beijing，China（Zeng Y）

Zhou Yubai，Email：zhouyubai＠bjut．edu．cn；Zeng Yi，Email：zengy＠public．bta．net．cn

ObjectiveConstructing the dendritic cell（DC）vaccine loading HPV16L1 antigen，and evaluating the specific humoral and cellular immune responses induced by DC?L1.MethodsThe mature dendritic cells（DCs）were induced in vitro from bone marrow precursors by co?culturing with cytokines cocktail，and then transduced with a recombinant adenovirus harboring the HPV16L1 gene to obtain the DC?L1 vaccine.C57BL／6 mouse were immunized intramuscularly by single dose of DC?L1 and recombinant adenovirus vaccine Adv?HPV16L1 respectively.The specific humoral and cellular immune responses were determined by quantitative ELISA and ELISPOT at different time points.ResultsDC?L1 cells exhibited typical morphological features of dendritic cells，and the expression of HPV16L1 can be detected by western blot.Both DC?L1 and Adv?HPV16L1 can induce specific cellular immune response，while with distinct kinetics.Single dose of Adv?HPV16L1 induced responses immediately，and attained the peak level at the third week after immunization，then diminished gradually.While responses induced by DC?L1 elevated slowly，and eventually exceeded that of recombinant adenovirus group at the fifth week of post?immunization.As to humoral immunity，both DC?L1 and Adv?HPV16L1 vaccines can induce specific humoral immune reponses，and with similar kinetics.ConclusionThe DC?L1 vaccine was constructed successfully.The DC?L1 vaccine can induce high levels of HPV16L1 specific humoral and cellular immune response.

Dendritic cell；vaccine；human papillomavirus type 16；major capsid protein

周玉柏，Email：zhouyubai＠bjut.edu.cn；曾毅，Email：zengyi＠public.bta.net. cn

10.3760／cma.j.issn.1003?9279.2016.06.000

樹突狀細胞；疫苗；人乳頭瘤病毒16型；主要衣殼蛋白

國家863計劃項目（2012AA02A404）；

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