好氧反硝化菌處理低濃度含氮污水

郭麗蕓 時飛 楊柳燕 周國勤 茆建強

摘要：目前好氧反硝化菌生物脫氮的研究還處于試驗階段，且主要集中在對高濃度含氮廢水的處理方面，對低濃度含氮污水很難做到深度處理。為解決這一問題，從富營養化的太湖表層水體中篩選3株好氧反硝化菌，經生理生化性能測定及分子生物學方法鑒定，分別為施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）、不動桿菌（Acinetobacter sp.）、布魯氏菌（Brucella sp.），株系分別命名為T1、N2、ADB-7。當碳氮比為9、pH值為7～9、溫度為30 ℃、搖床轉速為180 r/min時，菌株ADB-7的好氧反硝化效率最高。隨后研究菌株T1、N2、ADB-7對人工生活污水及富營養化湖泊水樣的氮素脫除情況。結果表明：24 h內菌株ADB-7對人工生活污水中硝態氮、氨態氮的去除率分別達54.32%、83.36%；菌株T1、N2對富營養化湖泊水樣硝態氮、氨態氮脫除效果較好，終濃度分別低于1.0、0.2 mg/L。由結果可知，菌株 ADB-7 短期脫氮效果好，而菌株T1、N2脫氮效果持久，可將3種菌制作混合微生物菌劑，用于環境水體氮素的脫除。

關鍵詞：好氧反硝化；人工生活污水；富營養化湖泊；脫氮；微生物菌劑

中圖分類號： S132；X172文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0523-04

近年來，隨著社會經濟的快速發展，工業廢水及生活污水排放量日益增大，湖泊水質環境受到不同程度的污染，富營養化狀況嚴重[1-2]。水體中的氨態氮、硝態氮都是嚴重的環境問題，其中氨態氮對魚類和其他水生生物具有很強的毒性[3]，硝態氮能夠破壞水生生物的免疫系統[4]。20多年來，我國科研工作者在湖泊富營養化的治理控制及氮素去除技術方面做了深入而廣泛的研究，認為利用硝化-反硝化脫氮是最行之有效、無2次污染的技術[5]。

傳統理念認為，反硝化作用是在無氧或厭氧條件下進行的。20世紀80年代中后期，首個好氧反硝化菌株的發現開啟了人們研究好氧狀態下脫氮作用的新領域[3]。好氧反硝化菌由于具備異養硝化-好氧反硝化能力，使得硝化、反硝化得以在同一個反應器中進行，且操作簡便、運行成本低；同時，反硝化過程釋放的堿可以補償硝化過程中釋放的酸，維持了體系酸堿度穩定，受到廣大研究者的青睞[6-7]。國內外的專家學者也陸續從自然環境如池塘、底泥、活性污泥等生境中分離出具有好氧反硝化作用的菌株，如Alcaligenes[8]、Pseudomonas[9-10]、Bacillus[11]、Paracoccus、Rhodococcus[12]等。

目前國內對于好氧反硝化菌進行生物脫氮的研究基本處于試驗的探索階段[13-14]，分離得到的好氧反硝化菌菌株多用于對高濃度含氮廢水進行脫氮處理[15]，處理后往往還有一定濃度的氮素殘留，很難做到深度處理。因此，針對低氮濃度污水進行深度脫氮的研究成為水污染控制工程領域的熱點。本研究從富營養化的太湖水體中篩選出好氧條件下能有效脫氮的菌株，并在實驗室條件下應用該菌株對人工生活污水及富營養化湖泊水體進行模擬脫氮，以期為富營養化湖泊脫氮的實際應用提供生物材料和理論依據。

1材料與方法

1.1培養基及試劑

富集培養基：100 mmol/L NaNO3，2.84 g/L琥珀酸鈉，0.27 g/L（NH4）2SO4，1.36 g/L KH2PO4，0.19 g/L MgSO4·7H2O，1 mL/L微量元素母液[16]，用去離子水補至相應體積，調節pH值至7.2，于 121 ℃ 滅菌20 min。

反硝化培養基：6.77 g/L檸檬酸三鈉，2.0 g/L KNO3，0.2 g/L MgSO4·7H2O，1.0 g/L KH2PO4，2 mL/L微量元素母液，用去離子水補至相應體積，調節pH值至7.0～7.5，于 121 ℃ 滅菌20 min。

溴百里酚藍（Bromothymol Blue，BTB）瓊脂平板：20 g/L瓊脂，1 g/L KH2PO4，1 g/L MgSO4·7H2O，0.5 g/L FeCl2·6H2O，8.5 g/L琥珀酸鈉，1 mL/L BTB（1%溶于乙醇），用去離子水補至相應體積，0.15 g/L CaCl2調節pH值至7.0～73，于121 ℃滅菌20 min。

半固體BTB培養基：含10 g/L瓊脂，其余成分同BTB瓊脂平板。

人工生活廢水：取校園生活污水，適當添加不同量的葡萄糖、KNO3、NH4Cl以及微量元素母液[16]后作為試驗用水。

1.2好氧反硝化菌的分離

分別于江蘇省無錫市太湖梅梁灣、貢湖灣及湖心等水域取表層水樣100 mL，加入250 mL三角燒瓶中，在磁力恒溫攪拌下，周期性加入少量（0.5 mL/h）富集培養基，于30 ℃富集培養24 h后取1 mL，分別稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9濃度梯度，再分別涂布BTB平板。由于反硝化是產堿過程，可使酸堿指示劑BTB變藍，因此待長出單菌落后，挑取邊界清晰、形態差異明顯的藍色單菌落，穿刺接種至半固體BTB培養基，選取培養基頂部顏色變藍且培養基中有氣泡產生（反硝化產物N2、NO或N2O）或培養基發生破裂的菌株為好氧反硝化陽性菌株。挑選好氧反硝化速率最高的3株菌，分別命名為T1、N2、ADB-7。

1.3菌株的形態學觀察

對菌株T1、N2、ADB-7進行革蘭氏染色，用光學顯微鏡及掃描電鏡觀察細胞形態，觀察菌株是否形成菌膜、菌環，是否有運動性等，并觀察菌落形態。

1.4菌株的分子生物學鑒定

以菌株T1、N2、ADB-7的基因組DNA為模板，采用細菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATC（A/C）TGGCTCAG-3′）、1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）擴增16S rDNA序列。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共30個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物經純化后由生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結果通過GenBank BLAST進行比對，并用MEGA 4[17]軟件構建系統進化樹。

1.5菌株生長曲線的測定

取培養16 h的菌懸液于8 000 r/min離心2 min，用滅菌水洗滌2次后進行接種。250 mL三角瓶裝100 mL反硝化培養基，以1%接種量于30 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養，每2 h取樣，測定菌體生物量（D600 nm），繪制生長曲線。

1.6不同條件對菌株ADB-7好氧反硝化能力的影響

以菌株ADB-7為代表菌株，采用250 mL三角瓶作為反應容器，在恒溫搖床條件下分別測定不同pH值、溫度、碳氮比（C/N）和溶解氧條件下菌株對反硝化培養基氮素的脫除效果。為控制溶解氧的不同，pH值分別取5、7、9，溫度分別設為20、30、37 ℃，攪拌器轉速分別設為100、120、180 r/min。分別在碳氮比為3、6、9時，測定菌株反硝化作用的強度。

1.7菌株低濃度氮素去除試驗

配制人工生活污水，使硝態氮、氨態氮濃度各為25～30 mg/L。試驗裝置如圖1所示，反應器容積為5 L，試驗在室溫下進行。取培養16 h的菌懸液1 000 mL，按上述方法離心后加入水樣中，進水后啟動攪拌裝置進行有氧反應 23 h，靜止沉降1 h后排水，取樣并測定硝態氮、氨態氮的含量。

1.8富營養化湖水氮素去除試驗

將取自江蘇省無錫市太湖梅梁灣水樣過濾、去除雜質后，加入到上述反應器中。每隔1個反應周期（23 h反應+1 h沉降）取樣，測定各形態氮的含量。

1.9檢測方法

水樣經0.45 μm濾膜過濾后進行硝態氮、氨態氮含量的測定，硝態氮采用紫外分光光度法測定；氨態氮采用納氏試劑光度法測定。

2結果與分析

2.1好氧反硝化菌的分離

經過富集培養、BTB平板涂布共獲取48株具有好氧反硝化能力的菌株。經半固體BTB穿刺培養復篩后選取如圖2中間試管的，培養基頂部變藍（產堿）且有氣泡產生（產氣）的菌株為陽性菌株[18]，其中菌株T1、N2、ADB-7在較短時間內具有較強的反硝化作用。

2.2好氧反硝化菌的的形態學觀察

2.5不同條件對好氧反硝化效率的影響

由于菌株ADB-7前期脫氮效率較高，因此測定不同條件對該菌株反硝化作用的影響試驗。由圖6-a可見，碳氮比對菌株的好氧反硝化效率具有較大影響，碳氮比越高，好氧反硝化效率越高，這是由于該菌株為異養微生物，需要外界環境為其提供有機物以維持菌體自身生長和代謝[7]；當碳氮比為9時，菌體脫氮效果良好。酸堿度也是影響好氧反硝化菌進行反硝化作用的1個重要影響因素[7]。由圖6-b可見，在中性（pH值=7）、堿性（pH值=9）環境下，菌株ADB-7的反硝化作用明顯強于酸性條件。此外，溫度對菌株的好氧反硝化作用也有明顯影響，溫度高于30 ℃時，菌株的好氧反硝化作用明顯增強，詳見圖6-c。但是，由于30、37 ℃條件下二者效果相差不大，且考慮到環境中的實際溫度除夏季外很少達到37 ℃，因此本研究將30 ℃定為最適溫度，用于后續的研究。由圖6-d可見，通過控制搖床轉速來控制反應器的溶解氧含量，結果發現在搖床轉速為180 r/min時，菌株反硝化速率較高，說明該菌株為好氧反硝化菌株，其反硝化作用酶系不受氧氣抑制。

2.6人工生活廢水的氮素去除效果

由表2可見，有氧反應24 h后，水體的氮素濃度均有明顯下降，菌株對于硝態氮的去除率為35%～54%，而對于氨態氮的去除率則更高，達到61%～83%，這是因為微生物會優先利用氨態氮而非其他形態氮素構建生物量[19-20]。喬楠等通過研究好氧反硝化菌菌株H1對硝態氮、氨態氮的利用情況認為，在碳源充足的情況下，菌株優先利用氨態氮，而對硝態氮的利用不顯著或明顯滯后[21]。因此，菌株ADB-7對硝態氮的去除效率仍有提高空間，菌株ADB-7對硝態氮、氨態氮的去除效率均較其他2種菌株高。

2.7富營養化湖泊水樣模擬脫氮試驗

由圖7可見，菌株對水體的硝氮確實存在還原作用。在前60 h，菌株ADB-7去除硝態氮、氨態氮的效率均高于菌株T1、N2，說明菌株ADB-7具有快速脫氮的效果，這與人工生活廢水的氮素去除試驗結果（24 h內）一致；同時可見，菌株ADB-7對于硝態氮的利用率較高，而對于氨態氮的利用率較低，說明菌株ADB-7用于構建生物量的氮素并不多[19-20]，因此其生物量的增加并沒有菌株T1、N2幅度大（圖5）。在60 h后，菌株T1、N2的脫氮效果明顯增強，且強于菌株ADB-7，硝態氮、氨態氮的終濃度維持在較低水平，分別低于1.0、0.2 mg/L。因此，菌株ADB-7快速脫氮效果較好，而菌株T1、N2的脫氮持久性較好，可考慮將三者按照不同比例做成高效脫氮菌劑，用于環境水體的脫氮處理。

3結論

從自然水體中分離純化得到3株好氧反硝化菌菌株，經鑒定后分別命名為（30 ℃）、碳源充足（碳氮比為9）和一定的溶氧量（搖床轉速 180 r/min）條件下，菌株的氮還原能力達到最優。3株菌均可在好氧條件下對人工生活污水和富營養化湖泊水樣進行硝態氮和氨態氮的脫除。菌株ADB-7具有快速脫氮的特點，而菌株T1、N2則可持久脫氮?？蓪?個菌株混合制作微生物制劑，用于富營養化湖泊的氮素控制。

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