重癥手足口病180例病原學檢測及腸道病毒71型基因特征分析▲

邱寶強 顏云盈 李 梅 夏天航

(廣西南寧市婦幼保健院兒科，南寧市 530011，E-mail：bh138@163.com)

論著·臨床研究

重癥手足口病180例病原學檢測及腸道病毒71型基因特征分析▲

邱寶強 顏云盈 李 梅 夏天航

(廣西南寧市婦幼保健院兒科，南寧市 530011，E-mail：bh138@163.com)

目的 探討重癥手足口病病原學特征，分析腸道病毒71型(EV71)基因型的特征。方法 重癥手足口病患兒180例，采集發病一周內的咽拭子或肛拭子標本，應用實時反轉錄-聚合酶鏈反應方法檢測標本中的腸道病毒。分別選取2014年及2015年各5例EV71檢測陽性標本擴增基因的VP1區，測序并比對，構建進化樹分析。結果 180份標本中腸道病毒核酸陽性153份，陽性率85.00%。153份陽性結果中EV71核酸陽性占50.3%(77/153)，柯薩奇病毒A組16型(CVA16)核酸陽性占19.6%(30/153)，其他腸道病毒核酸陽性占30.1%(46/153)。2014年及2015年以EV71為主，CVA16較少，兩年間病毒型別構成比較，差異無統計學意義(P>0.05)。多元線性回歸分析示，擬合回歸方程：Y=2.095X1+0.462X2-0.214，式中Y為重癥病例數，X1為EV71病例數，X2為其他腸道病毒病例數。EV71數可反映99.7%重癥病例變化。不同年齡間病毒型別構成比較，差異無統計學意義(P>0.05)。發病高峰集中在每年4～8月；發病以4歲以下兒童為主，占82.7%，尤其是1～3歲年齡段(57.8%)。EV71 VP1區與C4a基因型代表株核苷酸同源性為91.6%～92.5%，氨基酸同源性為97.5%～98.8%，親緣進化分析顯示EV71與C4a基因型代表株處于同一分支。結論 EV71是本地區重癥手足口病患兒主要病原，且屬于C4a基因亞型。

手足口??；血清型；腸道病毒7l型 ；VP1基因

手足口病是小兒內科常見傳染性疾病之一，臨床表現為出疹、發熱，主要病原體為腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A組16型(Coxasckie virus group A，type 16，CVA16)[1]。大部分患兒病程短，可自行愈合，預后良好。部分患兒可并發無菌性腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹、心肌炎等，甚至危及生命。其中大部分重癥死亡患兒由EV71感染引起[2]。筆者對180例重癥手足口病患兒進行腸道病毒分離鑒定及病毒基因分析，旨在了解該病病原體分布情況及基因特征。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年1月至2015年12月在我院診斷為重癥手足口病患兒180例的標本。重癥手足口病診斷符合《手足口病預防控制指南(2009年版)》[3]。男112例，女68例；年齡3個月至7歲。本研究經醫院學術委員會同意批準實施。

1.2 方法 患兒確診后3 d內無菌采集咽拭子或肛拭子置入病毒運送液中，送至實驗室進行檢測。分別選取2014年及2015年各5例EV71檢測陽性標本擴增基因的VP1區，測序并比對，構建進化樹分析。

1.2.1 病毒核酸提?。喊凑铡妒肿憧诓☆A防控制指南(2009版)》[3]中的方法進行標本的采集和處理。采用Omega Viral RNA kit(美國Omega公司)提取病毒RNA。取200 μl拭子洗脫液進行RNA的提取，提取的RNA的終體積為50 μl。

1.2.2 EV71 VP1區基因擴增：使用PrimeScript RT reagent Kit[寶生物工程(大連)有限公司]對病毒RNA進行反轉錄，得到的cDNA作為VP1區基因擴增的模板。EV71 VP1區擴增引物序列如下：

VP1F：AGGGTGGCAGATGTAATTGA

VP1R：CCACTCTAAAGTTGCCCACGTA

擴增片段長度為1 042 bp。擴增反應條件為：95℃ 5 min；95℃ 45 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min，共40個循環；72℃延伸10 min。擴增產物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

1.2.3 測序與分析：對擴增陽性產物進行DNA測序。使用DNAstar和MEGA 5.0進行DNA同源性分析和遺傳進化分析。構建系統發生樹所使用的EV71病毒各基因型代表株的序列來自于GenBank。

1.3 統計學分析 采用Excel 2003建立數據庫，SPSS 13.0軟件進行數據分析。計數資料的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義；組間多重比較經Brunden法校正，以P<0.017為差異有統計學意義。單因變量和多因變量線性關系分析用多元線性回歸分析。單向有序計數資料比較采用多組獨立樣本秩和檢驗(Kruskal-Wallis檢驗)，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 病原學檢測情況 180份標本中腸道病毒核酸陽性153份，陽性率85.00%。153份陽性結果中EV71核酸陽性占50.3%(77/153)，CVA16核酸陽性占19.6%(30/153)，其他腸道病毒核酸陽性占30.1%(46/153)，見表1。2014年及2015年以EV71為主伴隨其他腸道病毒，CVA16較少，兩年間病毒型別構成差異無統計學意義(χ2=0.529，P=0.467)。

表1 手足口病重癥病例病原學檢測結果(n，%)

2.2 多元線性回歸分析 2014～2015年病原學檢測結果與重癥發生例數行多元線性回歸分析，CVA16病例數與重癥發生例數無線性關系(P>0.05)未納入回歸模型，EV71病例數和其他腸道病毒例數納入回歸模型，擬合模型檢驗P<0.01，R2=0.999，EV71數可反映99.7%重癥病例數變化。擬合回歸方程：Y=2.095X1+0.462X2-0.214，式中Y為重癥病例數，X1為EV71病例數，X2為其他腸道病毒病例數。見圖1。

圖1 回歸標準化殘差p-p圖

2.3 病原學構成時間變化 2014～2015年1、2月及12月份幾乎無發病，發病時間主要集中在4～8月份，共有127例(83.00%)。見圖2。

圖2 2014～2015年重癥手足口病病原構成時間變化

2.4 不同年齡、性別病原學檢測結果比較 在180例中男女性別比為1.65 ∶1。發病年齡主要集中于4歲以下兒童(87.2%)，尤其是1～3歲年齡段(57.8%)，5歲以上年齡組發病數急劇下降，其中以1～2歲年齡組的重癥病例兒童最多。不同年齡間病毒型別構成比較，差異無統計學意義(H=9.727，P=0.083)。見表2和圖3。

表2 180例不同年齡組病原體檢測結果(n)

圖3 各年齡組重癥病例帕累托圖

2.5 病毒分離與鑒定 采集的20例標本，提取病毒RNA，反轉錄得到cDNA，通過對EV71 VP1區進行聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增，PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳(見圖4)。

圖4 EV71 VP1 PCR產物2%瓊脂糖凝膠電泳

2.6 EV71病毒VP1區核苷酸和氨基酸序列分析 分別選取2014年及2015年各5例EV71毒株，將10株EV71毒株與GenBank上的EV71各基因型與亞型代表株的VP1區基因序列進行比較及分析，10株EV71毒株與A、B、C型的核苷酸同源性分別為79.3%～81.5%、80.2%～83.9%、86.1%～92.5%，氨基酸同源性分別為91.2%～93.4%、94.0%～98.0%、96.7%～98.8%。與C4a亞型的同源性最高，見表3。

表3 EV71病毒VP1區核苷酸和氨基酸序列分析結果

2.7 EV71 VP1區基因親緣關系分析 EV71 VP1區的基因親緣關系樹顯示，10株EV71分離株與C4亞型在同一分支，屬于C4a亞型，見圖5。

圖5 EV71分離株與各亞型代表株在VP1區的基因進化樹

3 討 論

引起重癥手足口病的病原型均屬小RNA病毒科腸道病毒屬，目前共發現20余個血清型，主要包括?？刹《?、EV71型、CVA16組4、5、7、9、10、16型以及CVB組2、5、13型，在我國以CVA16和EV71型最為常見[4]。重癥手足口病的病原學檢測方法主要包括雙份血清標本的中和抗體滴度測定、病毒分離培養、反轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-PCR，RT-PCR)。病毒分離培養為病毒性疾病診斷的“金標準”，是應用組織培養技術從傳染源或感染部位分離出病毒并鑒定血清型，但因其過程繁瑣、時間長，容易耽誤手足口病的早期診斷，無法滿足流行地區大樣本的檢測。RT-PCR技術利用腸道病毒特異性引物檢測血清標本，以發現腸道病毒RNA同源的基因序列為判斷依據，具有微量、快速、靈敏度高等優點[5]。該檢測方法克服了血清學方法和病毒分離培養耗時、繁雜的缺點，能夠在疾病流行期間同時檢測大量標本，目前已成為快速診斷腸道病毒感染的重要手段。本文結果表明，2014～2015年重癥手足口病病原學主要是以EV71為主伴隨其他腸道病毒，CVA16較少，與其他學者[6-7]報告基本一致。

EV71是一種高度嗜中樞神經性腸道病毒，可累及中樞系統的任何區域，因此除了可引發與CVA16相似的重癥手足口病、皰疹性咽峽炎等癥狀外，還導致中樞系統疾病，如腦炎、腦膜炎以及弛緩性癱瘓。1996年以前，EV71病毒主要傳播于澳大利亞和美國，1996年之后流行于亞洲[8]。我國EV71感染引起的重癥手足口病在20世紀90年代才逐漸占主導地位。楊洪等[9]對2008～2010 年深圳市手足口病就診情況及病原學研究結果提示EV71是主要病原體，而 CVA16的發病率逐漸降低。郁會蓮等[10]報告陜西省2008～2011年手足口病病毒以EV71型為主，占56.48%；重癥病例為0.2%～20.0%，且多發生在4～7月，年齡多為≤3 歲，男孩居多，致病體為EV71型[10]。江蘇省手足口病流行具有明顯的季節性、人群性以及地區性，引起手足口病普通病例流行的病原體主要為EV71和CVA16，且不同年份間流行優勢株有所差別，重癥病例和死亡病例的流行優勢毒株均為EV71[11]。本研究結果顯示，引起本地區2014～2015年重癥手足口病流行的主要病原是EV71；男性病例高于女性(男女之比為1.65 ∶1)；發病年齡主要集中于4歲以下兒童占87.2%，尤其是1～3歲年齡段占57.8%；時間分布主要集中在4～8月份，占總發病數的83.00%，與以往報告[3]相似。但不同年齡間病毒型別構成比較，差異無統計學意義，提示4歲以下幼童均為重癥手足口病的高危感染人群。

大量實驗表明，腸道病毒的VP1 編碼區基因序列與病毒血清型相關，對于血清型的鑒定具有重要意義，而且該編碼區的基因序列最大的變異速率，可進行親緣性進化分析，用于分子流行病學研究[12-13]。本研究通過VP1編碼區核苷酸序列測定和分析，確定分離毒株的血清型，并對分離到的EV71流行株進行基因特征分析。進一步將從GenBank檢索到EV71各基因型和亞型的代表毒株VP1序列、全國各地近年分離的EV71病毒VP1序列，與本次分離出的EV71病毒VP1序列進行核苷酸和氨基酸序列同源性分析。結果表明，2014～2015年本地區10株EV71病毒分離株屬于C4基因亞型同一個分支 (bootstrap 值為96)；與C4a基因亞型的代表株接近，核苷酸同源性為91.6%～92.5%，而氨基酸同源性為97.5%～98.8%，與國內報告[14]相似；與A、B基因型的差別比較大，核苷酸同源性為75.3%～81.5%，而氨基酸同源性為93.4%～99.2%；與C基因型的C1、C2、C3和C5比較，核苷酸同源性為85.3%～87.5%，而氨基酸同源性為95.1%～98.4%。

綜上所述，本地區2014～2015年重癥手足口病病原體與國內其他地區病原體類似，主要是EV71，但仍有部分未知的病毒，尚需要我們進一步研究。

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Etiological detection of 180 cases of severe hand-foot-mouth disease and characteristics analysis of enterovirus 71 gene

QIUBao-qiang,YANYun-ying,LIMei,XIATian-hang

(DepartmentofPediatrics,theMaternalandChildHealthHospitalofNanning,Nanning530011,China)

Objective To explore the etiological characteristics of severe hand-foot-mouth disease,and to analyze the characteristics of enterovirus 71(EV17) gene.Methods The specimens of throat swabs and anal swabs were collected from 180 children with severe hand-foot-mouth disease within one week of onset.The enterovirus of specimens was detected using real-time reverse transcription-polymerase chain reaction technology.VP1 region of gene was amplified in 5 specimens with positive EV71 from 2014 and 2015 separately.Then sequencing and comparison was conducted and the phylogenetic tree was constructed for analysis.Results Of 180 specimens,nucleic acid of enterovirus was positive in 153 specimens,accounting for 85.00%.And of 153 positive specimens,positive nucleic acid of EV71 accounted for 50.3%(77/153),positive nucleic acid of Coxsackie virus type A 16(CVA16) accounted for 19.6%(30/153),and positive nucleic acid of the other enterovirus accounted for 30.1%(46/153).EV71 was the main pathogenic virus and CAV16 was minor in 2014 and 2015,and there was no significant difference between the constituent ratios of virus type in 2014 and 2015(P>0.05).A multiple linear regression analysis revealed that the fitting regression equation:Y=2.095X1+0.462X2-0.214,Y:The number of severe cases, X1:The number of EV71 cases,X2:The number of other enterovirus cases.The number of EV71 cases could reflect the changes in 99.7% of severe cases.There was no significant difference in the constituent ratio of virus type among different age groups(P>0.05).The incidence peak was concentrated from April to August in each year.The children aged less than 4 years(82.7%) were common,especially the children aged 1 to 3 years(57.8%).The nucleotid homogeneity and amino acid homogeneity between VP1 regions of representative strains with EV71 and C4a genotypes was 91.6%-92.5% and 97.5%-98.8% respectively.The phylogenetic tree analysis showed that representative strains with EV71 and C4a genotypes were in the same branch.Conclusion EV71 is the main pathogen of children with severe hand-foot-mouth disease in the local area,and belongs to C4a subgenotype.

Hand-foot-mouth disease,Serotype,Enterovirus 71,VP1 gene

廣西南寧市科學研究與技術開發計劃(20133190)

邱寶強(1961～)，男，本科，副主任醫師，研究方向：兒童感染性疾病。

顏云盈(1966～)，女，本科，副主任醫師，研究方向：兒童感染性疾病和兒童重癥醫學，E-mail：nnyyy0818@sina.com。

R 725.1

A

0253-4304(2016)04-0482-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.04.10

2016-01-04

2016-03-21)