布魯氏菌不同菌株間差異蛋白的研究進展*

豆曉霞，劉 洋，劉 升，王紅紅，李 敏，荊明龍，陳創夫，張 輝*

（石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832000）

布魯氏菌不同菌株間差異蛋白的研究進展*

豆曉霞，劉 洋，劉 升，王紅紅，李 敏，荊明龍，陳創夫，張 輝*

（石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832000）

布魯氏菌病是一種全球流行性的人獸共患病，嚴重威脅著人類的健康及畜牧業的發展。隨著蛋白質組學研究技術的快速發展，通過不同布魯氏菌菌株間蛋白質組學研究，分析羊種布魯氏菌強毒株與疫苗株間的差異蛋白，牛種布魯氏菌與羊種布魯氏菌間的差異蛋白，豬種布魯氏菌強毒株與疫苗株間的差異蛋白，可為探求布魯氏菌在致病機制、毒力因子、代謝通路、診斷標志物以及新型疫苗的研制等熱點研究方面提供理論依據和解決方法。通過對布魯氏菌的蛋白質組學研究，以期在布魯氏菌病診斷防治研究上取得重大突破。

布魯氏菌；蛋白質組；差異蛋白；雙向電泳；質譜

布魯氏菌?。˙rucellosis）是由布魯氏菌引起的一種人獸共患傳染病，該病呈世界性分布[1]，是目前世界上流行最廣、危害最大的人獸共患病之一。布魯氏菌（Brucella）感染人類、多種家畜和野生動物，它可以引起人的波浪熱和慢性關節炎及反芻動物流產和睪丸炎等。1887年布魯氏菌首次在馬耳他地區由Sir David Bruce從布魯氏菌病引起死亡士兵的脾臟中分離獲得，因此，布魯氏菌病也稱為馬耳他熱或波浪熱[2]。布魯氏菌病在全球170多個國家和地區流行，主要集中于地中海、非洲、拉丁美洲、中東和亞洲的部分地區。我國布魯氏病主要分布在我國的“三北”地區，如內蒙古、新疆、遼寧、吉林、黑龍江等地。

隨著人們對于布魯氏菌的不斷深入研究，根據宿主偏好性和生化表型等，將布魯氏菌分為6個經典的種：羊種布魯氏菌（Brucellamelitensis）、牛種布魯氏菌（Brucella abortus）、豬種布魯氏菌（Brucella suis）、犬種布魯氏菌（Brucella canis）、綿羊種布魯氏菌（Brucella ovis）和沙林鼠種布魯氏菌（Brucella neotomae）[3-5]。最近又有4種布魯氏菌被鑒定出來，包括：從海豹分離的鰭腳類布魯氏菌（Brucella pinnipediae）；從海豚分離的鯨種布魯氏菌（Brucella ceti）[6]；從紅狐、田鼠、土壤中分離的田鼠種布魯氏菌（Brucella microti）[7-9]；從乳腺移植病人分離的湖浪種布魯氏菌（Brucella inopinata）[10]。

現階段限制布魯氏菌研究的主要問題有：（1）在對動物的布魯氏菌檢疫方面，當前的檢測方法無法區分自然感染和接種疫苗的動物；（2）人類預防布魯氏菌感染沒有理想的疫苗，使得人們感染的機率增加。那么尋找布魯氏菌的疫苗接種和自然感染的差異之處，以及尋求理想的布魯氏菌的免疫抗原作為候選疫苗成為研究要解決的首要問題。隨著蛋白質研究的不斷發展，布魯氏菌比較蛋白質組學研究已經成為解決這些問題的主要手段，例如美國的Vito G.Delvecchio[11-12]分別對比了羊種布魯氏菌疫苗株Rev 1和強毒株16M的種內差異以及牛種布魯氏菌2308株和羊種布魯氏菌16M的種間差異；國內趙忠鵬[13]、張洪麗[14]、楊艷玲[15]等針對國內的布魯氏菌不同菌株進行差異蛋白質組學研究。本研究主要針對布魯氏菌不同菌株之間存在的差異蛋白進行分析，基于布魯氏菌的不同菌株在致病性、毒力、免疫原性等方面的不同，給予分子依據，為布魯氏菌病的檢疫和疫苗研發起到積極的推動作用。

1 羊種布魯氏菌強毒株16M與疫苗株M5的差異分析

國內對于布魯氏菌的比較蛋白質組學研究主要集中在羊種布魯氏菌強毒株16M與疫苗株M5之間，研究的主要目的在于揭示布魯氏菌強毒株與疫苗株的具體差異蛋白，為疫苗株的制弱分子機制提供依據。趙忠鵬[13]等通過雙向電泳等技術對羊種布魯氏菌強毒株16M和疫苗株M5的蛋白質整體水平進行分析，研究共鑒定13個差異蛋白，代表了8種不同的開放閱讀框（ORFs），其差異蛋白的功能涉及能量代謝、應激、物質運輸等。其中5個屬于熱休克蛋白，2個屬于物質運輸蛋白，6個涉及能量代謝，1個蛋白位點未得到鑒定。這些蛋白包括Dps蛋白、GroE蛋白、Nichel結合胞質蛋白前體、糖結合蛋白等。

張洪麗[14]通過對羊種布魯氏菌強毒株16M和疫苗株M5進行差異蛋白質組學分析，共篩選出53個差異蛋白點，經過質譜鑒定，其中49個蛋白點在數據庫中匹配到了有功能意義的蛋白質，共代表了35個有差別的開放式閱讀框（ORFs）。在這49個不同的差異點中，在布魯氏菌疫苗株M5表達上調的蛋白有22個，在布魯氏菌強毒株16M高表達的有27個。通過質譜分析，得到的49個差異蛋白功能涉及糖的代謝、脂代謝、蛋白的合成以及外膜蛋白、分子伴侶等。其中Dps蛋白、外膜蛋白Omp25、糖結合蛋白在布魯氏菌強毒株16M中的高表達可能與布魯氏菌的毒力有關；侵襲蛋白B在布魯氏菌強毒株16M與疫苗株M5中均有大量的表達，很可能與布魯氏菌致病性有關；布魯氏菌疫苗株M5中高表達的外膜蛋白Omp31前體可能與良好的免疫原性有關。

楊艷玲[15]對羊布魯氏菌強毒株16M和弱毒株M5的膜蛋白進行了差異蛋白質組學研究。結果顯示，一共有33個差異蛋白點，經質譜鑒定和生物信息學檢索后發現它們代表了26個開放閱讀框（ORFs）。其中有22個蛋白在布魯氏菌強毒株16M上高表達，4個蛋白在疫苗株M5上表達上調，通過生物信息學數據檢索以及相關文獻數據分析，在強毒株內高表達的蛋白，在布魯氏菌的能量代謝、脂肪代謝、蛋白質及氨基酸的合成以及細菌外膜多糖的合成等生物過程中發揮著重要作用。同時在M5株中高表達的蛋白是細菌的重要免疫原性蛋白。通過半定量RT-PCR結果也顯示了部分蛋白在轉錄水平上也存在著差異，如WbkC、PurH、Omp10、SueB。這些差異蛋白的發現為我們解釋布魯氏菌的致弱機制提供了線索和依據，同時也獲得了一些與毒力和免疫相關的分子。

李向陽等[16]對布魯氏菌強毒株16M和疫苗株M5進行比較蛋白質組學分析，結果顯示，2個菌株存在23個差異點，通過質譜分析和生物信息學檢索后發現它們代表了20個開放閱讀框，這些蛋白分別包括了布魯氏菌膜蛋白Omp25、侵襲蛋白B、3-酮脂酰-（?；d體蛋白）還原酶、Dps蛋白、轉醛醇酶、ABC胞漿蛋白糖結合蛋白、胞漿蛋白、鐵結合胞質蛋白、鎳和細胞質蛋白前體、分子伴侶DanK、乙醛、支鏈α-酮酸還原酶三硫酸脫氫酶、二氫硫辛酰胺脫氫酶、結合GroEL的外膜蛋白Omp31、細胞質環流因子、甲醛脫氫酶蛋白質等。研究表明，有13種蛋白在布魯氏菌強毒株16M和疫苗株M5中表達上調，這些蛋白質的功能涉及糖代謝、物質運輸、蛋白合成和分子伴侶等。

2 羊種布魯氏菌強毒株16M和疫苗株Rev 1的比較研究

2002年美國的Vito G.DelVecchio等[12]對布魯氏菌強毒株16M和疫苗株Rev 1株進行比較蛋白質組學分析，研究顯示，2個菌株在代謝方面呈現部分差異化，差異蛋白主要涉及鐵代謝、糖運輸、脂質代謝、蛋白合成等。首先，研究表明在強毒株16M中特異性表達的蛋白有8個，其中4個差異點經鑒定有特定的功能，如脯氨酸順反異構酶（peptidylprolyl cis-trans isomerase）蛋白分別在pH值4.0～7.0和pH值4.5～5.5的范圍重復檢測到有特異性表達。在不同pH范圍的膠條中疫苗株Rev 1特異性表達的蛋白點共有15個，4個點通過鑒定有特定的功能，例如有糖結合蛋白、硝酸還原酶等。其次，相比較疫苗株Rev 1，在16M中高量表達的蛋白有45個，這些蛋白包括有Dps蛋白（19.1倍）、外膜蛋白Omp31前體（11.9倍），ATP合成酶（7.7倍）、延伸因子-tu（13.1倍）、鎳結合周質蛋白前體（4.1倍）等。將強毒株16M做為參考，在疫苗株Rev 1中高量表達的蛋白有40個，例如細菌鐵蛋白（12.7倍）、鐵調節外膜蛋白B（5.4倍）以及鐵結合周質蛋白前體（3.6倍），這些蛋白都涉及細菌的鐵代謝，這些蛋白也是鐵多種吸收系統的組成部分，說明疫苗株Rev 1是在通過不同的途徑來促進鐵的吸收代謝。有研究表明，鐵離子對于病原微生物進入宿主細胞后保持存活起到重要的作用[17]。

3 牛種布魯氏菌2308株與羊種布魯氏菌16M種間差異蛋白分析

Michel Eschenbrenner等[11]采用雙向電泳串聯基質輔助激光解吸/電離的技術比較了羊種布魯氏菌16M與牛種布魯氏菌2308株在實驗室相同培養條件下的蛋白質組學差異。他們發現在蛋白質表達種類以及表達的量上都存在很大差異。與羊種布魯氏菌16M相比較，牛種布魯氏菌2308株特異性表達有11個與膜運輸相關的蛋白，6個跟分泌系統相關的蛋白，6個跟糖代謝相關的蛋白，5個跟應激相關的蛋白，4個跟毒力相關的蛋白，特別是跨膜運輸和分泌相關的蛋白。作者通過對2個菌株不同種間的差異蛋白分析認為，由于不同氨基酸的代謝能力可能導致是羊種布魯氏菌16M與牛種布魯氏菌2308株宿主偏好性的原因；另外II型分泌系統元件及周質伴侶DsbA蛋白的表達差異也可能導致是羊種布魯氏菌16M與牛種布魯氏菌2308株宿主偏好性的原因。

4 豬種布魯氏菌019株與豬種布魯氏菌S2疫苗株的差異分析

張科[18]在對布魯氏菌019株的全基因組分析后，將019株劃分為豬種布魯氏菌，同時又對布魯氏菌019株和豬種布魯氏菌S2疫苗株進行蛋白質組學比較分析，發現了兩株菌存在18個顯著的蛋白差異位點，通過質譜分析，發現這些蛋白位點代表了17個開發閱讀框，17個差異蛋白中，其中15個有功能注釋，2個被注釋為假定蛋白。這些蛋白的功能涉及外膜蛋白、轉運相關蛋白、轉錄和翻譯相關蛋白、感應與調控相關蛋白、代謝相關蛋白，以及2個未知功能的蛋白。例如Omp31蛋白、Omp31是綿羊種布魯氏菌主要的免疫原性蛋白，作者研究發現，相對于豬種布魯氏菌疫苗株S2，布魯氏菌019株高表達Omp31可能有助于解釋S2較弱的免疫原性，同時這一發現也提示我們布魯氏菌019株具有良好的免疫原性。其次，APHC蛋白---抗氧化相關蛋白，在019株中高表達。AHPC是已知的布魯氏菌毒力相關因子之一，它可以抵御來自宿主以及外界自然環境過氧化物的侵襲。APHC蛋白在019株的高表達與019強致病特性相一致，與S2疫苗株毒力減弱也存在一定的相關性。也有研究表明[19]，APHC基因的缺失會導致布魯氏菌在感染C57BL6J小鼠時，脾臟內CFUs下降。

作者進一步對布魯氏菌019株和S2株差異點的功能進行分析，發現在17個差異蛋白中，外膜蛋白Omp31、轉錄延伸因子Tufa和烷基過氧化物酶C是已知的布魯氏菌毒力相關基因；其次，轉錄延伸因子Tsf、蛋氨酸溶質結合蛋白YaeC、ABC轉運因子、TatC是布魯氏菌潛在的毒力相關基因；天冬氨酸激酶可能是新的治療布魯氏病的藥物靶蛋白；延胡索酞乙酞乙酸水解酶FahA可能是新的布魯氏菌免疫原性蛋白。

5 布魯氏菌019株與羊種16M株、牛種2308株、綿羊種63/290株的比較分析

為了研究布魯氏菌019株的蛋白質組學特征，張科[18]利用iTRAQ定量蛋白質組學技術篩選布魯氏菌019株與羊種16M株、牛種2308株、綿羊種63/290株3種布魯氏菌的差異蛋白。

iTRAQ定量蛋白質組學的結果顯示，布魯氏菌019株與牛種布魯氏菌2308株，羊種布魯氏菌16M株和綿羊種布魯氏菌63/290株相比較，研究發現，布魯氏菌019株大量上調核糖體相關蛋白的濃度，這一結果與布魯氏菌019株生長速度較快一致。另外，布魯氏菌019株與羊種布魯氏菌16M比較，還上調表達了氧化磷酸化代謝通路多個蛋白的濃度；布魯氏菌019株與綿羊種布魯氏菌63/290株比較，上調了檸檬酸代謝（TCA循環）以及多個氨基酸代謝相關蛋白的濃度；布魯氏菌019株與牛種布魯氏菌2308株相比，上調了多種氨基酸代謝相關蛋白的濃度。這些能量代謝相關蛋白和氨基酸代謝相關蛋白濃度可能是在核糖體相關蛋白濃度升高的前提下提高的，并滿足布魯氏菌繁殖過程中對能量和氨基酸等的大量需求。通過比較發現，上調表達核糖體相關蛋白是布魯氏菌019株最明顯的特點，這一特點與其生長速度較快的特征一致；從布魯氏菌的演化歷程上看，放慢生長速度可能是布魯氏菌適應胞內生存機制的一種表現。

6 牛種布魯氏強毒株544A和豬種布魯氏菌疫苗株S2間差異蛋白的比較

張俊敏[20]對牛種布魯菌強毒株544A和豬種疫苗株S2進行全基因組分析，發現疫苗株S2基因組中存在544A缺失的差異基因片段，進一步分析發現該差異基因參與編碼repA-related蛋白。武寧[21]在張俊敏對布魯氏菌差異基因片段研究的基礎上，對6個不同種屬布魯氏菌的全基因組序列對比分析發現，repA-related基因存在于豬種、犬種和沙林鼠種布魯氏菌中，而牛種、羊種和綿羊種布魯菌中缺失repA-related基因。通過原核表達repA-related蛋白，建立了以repA-related重組蛋白為抗原的間接ELISA檢測方法，能夠區分S2疫苗免疫牛與牛種或羊種布魯菌自然感染牛的鑒別診斷。

7布魯氏菌種間差異蛋白---Omp31蛋白的研究

Vizcain等[22]在1997年通過PCR-RFLP和Southern-blot雜交技術對Omp31基因組的多態性進行了研究，Southern-blot的結果表明，Omp31存在于除B.Abortus（牛種布魯氏菌）之外其他所有的布魯氏菌中。他們還發現，在B.abortus（牛種布魯氏菌）的染色體上有25 kb的缺失，并且這些缺失的序列包括Omp31和1個基因簇。1992年Baily等[23]首先將PCR方法用于布魯氏菌的鑒定。他們依據編碼布魯氏菌外膜蛋白31k（Omp31）的基因設計了1對引物B4、B5。Om p31是布魯氏菌的特異性蛋白，這一對引物有很好的靈敏度、特異性、穩定性，可以從屬的水平上鑒別布魯氏菌。楊星雅[24]證實Omp31可作為種間差異的鑒別診斷蛋白，可以鑒別牛種和非牛種布魯氏菌。

國外研究已證實，在目前所出現的致弱菌苗中Omp31基因缺失株均不改變親本株的免疫保護作用[25]，Omp31被認為是目前最適合的基因缺失標記疫苗之一，若將Omp31與其他免疫原性蛋白聯合用于血清學診斷中，可以將疫苗接種和自然感染動物區分開來[26]。

8 討論

蛋白質組一詞最早是由澳大利亞Macqurie大學的Wilkins提出的，是指一個細胞或組織表達的全部蛋白質，研究細胞內所有蛋白質的組成及其活動規律的新興學科則被稱之為蛋白質組學。隨著雙向電泳技術以及蛋白質譜鑒定技術的成熟，并與生物信息學的結合應用為蛋白質組學的研究提供了高通量快速鑒定蛋白的技術平臺，其中差異蛋白質組學又稱比較蛋白質組學，研究重點在于2個樣本之間的差異蛋白。對布魯氏菌不同菌株之間差異蛋白質的比較有利于發現強毒株和弱毒株之間的差異蛋白點，為探討布魯氏菌的致病機理、疾病診斷和防治、新型疫苗的研制等提供重要的理論依據和實際解決途徑。顧超慧等[27]從蛋白質組學在布魯氏菌研究中的3個方面的應用，包括布魯氏菌的致病機制、代謝通路及新型疫苗研究應用展開探討。

當前對于布魯氏菌不同菌株的差異蛋白的研究意義主要在于以下幾個方面：第一，通過布魯氏菌的強弱毒株的差異蛋白的比較，從蛋白水平尋找布魯氏菌的毒力蛋白和致病因子。例如，張洪麗對布魯氏菌16M與M5的強弱毒株的蛋白質組學比較，研究發現差異蛋白Omp25、糖結合蛋白與布魯氏菌的毒力相關，侵襲蛋白B可能與布魯氏菌的致病性有關；李向陽等研究發現與布魯氏菌毒力和致病性相關的差異蛋白Omp25及侵襲蛋白B等；張科對在019株與疫苗株S2比較蛋白質組學研究，發現外膜蛋白Omp31、轉錄延伸因子Tufa、烷基過氧化物酶C是已知的布魯氏菌毒力相關基因，轉錄延伸因子Tsf、蛋氨酸溶質結合蛋白YaeC、ABC轉運子、TatC是布魯氏菌潛在的毒力相關基因；Michel Eschenbrenner等[11]通過布魯氏菌2308株與16M株比較，發現布魯氏菌2308株有4個與毒力相關的蛋白。其次，也有多個研究證實在布魯氏菌疫苗株中低表達的蛋白也與毒力及致病性相關。這些研究結果證明，通過蛋白質組學可以尋找到布魯氏菌的多個毒力相關的蛋白，通過這些蛋白來進一步研究布魯氏菌的毒力及致病性。那么通過在疫苗株中低表達的蛋白，可以進一步解釋疫苗株的制弱分子機制，為布魯氏菌疫苗的研制提供一些新的研究依據。

研究布魯氏菌不同菌株的差異蛋白的第二個意義在于發現野毒株與疫苗株的特異性表達的差異蛋白，用以研究如何區分布魯氏菌的自然感染與疫苗感染。通過布魯氏菌強毒株如16M株和疫苗株M5差異蛋白對比研究，找到在16M中或者M5中特異性表達的蛋白，以此蛋白為鑒別診斷抗原，用以區分羊種布魯氏菌病的自然感染和疫苗感染。美國的Vito G.DelVecchio等[12]對強毒株16M和疫苗株Rev 1株進行比較發現，強毒株16M中特異性表達的有8個蛋白，疫苗株Rev 1特異性表達的共有15個蛋白，這些差異蛋白都可以作為鑒別診斷抗原的候選抗原。但是，目前對這些差異蛋白的研究進展較少，國內就16M與M5的區別感染的問題仍然是亟待解決的問題。

關于差異蛋白研究的熱點在于布魯氏菌疫苗的研制，至今尚未有國際認可的用于人的布魯氏病疫苗，所以說關于布魯氏菌病的防治問題仍然是無法突破的瓶頸。有研究發現，外膜蛋白Omp25在布魯氏菌強毒株16M中有高通量表達，布魯氏菌侵入巨噬細胞后，其表面Omp25的表達抑制巨噬細胞TNF -α的產生[28]，布魯氏菌Omp25很有可能與位于巨噬細胞的受體作用，通過對TNF-α分泌途徑的修改，進行負調節。也有研究證實，通過刪除Omp25基因可能影響布魯氏菌的毒力[29]，Omp25可能作為有效的疫苗的候選抗原。其次，外膜蛋白Omp31前體在布魯氏菌疫苗株M5中高表達。Omp31具有良好的免疫原性，是目前免疫保護性分子的研究熱點[30]，近年來已經有很多研究重組Omp31用于制備布魯氏菌DNA疫苗。

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2016-08-17

國家國際科技合作專項，項目編號：2015DFR31110。

*通訊作者：張輝（1978-），男，漢族，教授，從事傳染病診斷與致病機制的研究。E-mail：allanzhh@yahoo.com。