不同營養鹽水平對東海原甲藻和米氏凱倫藻生長的影響

沈盎綠，李道季

（1.中國水產科學研究院東海水產研究所，農業部東海與遠洋漁業資源開發利用重點實驗室，上海 200090；2.華東師范大學，河口海岸國家重點實驗室，上海 200062）

不同營養鹽水平對東海原甲藻和米氏凱倫藻生長的影響

沈盎綠1，2，李道季2

（1.中國水產科學研究院東海水產研究所，農業部東海與遠洋漁業資源開發利用重點實驗室，上海 200090；2.華東師范大學，河口海岸國家重點實驗室，上海 200062）

為了闡明營養鹽水平下對東海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）和米氏凱倫藻（Karenia mikimotoi）的生長特性，研究了不同營養鹽總體濃度和磷限制對兩種藻類生長的影響。結果表明，不同營養鹽水平對東海原甲藻和米氏凱倫藻的生長影響顯著，培養中期添加營養鹽（二次添加）可以顯著提高兩種藻類的細胞濃度，同步測定氮磷營養鹽水平發現，一次性添加營養鹽培養時東海原甲藻對硝酸鹽和磷酸鹽吸收利用率分別為31.6%和76.9%，米氏凱倫藻對硝酸鹽和磷酸鹽的吸收利用率分別為92.5%和99.9%，二次添加營養鹽培養時則稍低，同時兩種藻類在實驗后期較低磷酸鹽水平的情況下仍然能維持較高細胞濃度，說明藻細胞內存在明顯的營養鹽庫。在磷限制情況下，東海原甲藻和米氏凱倫藻的生長均受到明顯的抑制，東海原甲藻細胞體積在磷限制培養下變化不大，而且米氏凱倫藻細胞體積在磷限制培養一段時間后明顯增大，當磷酸鹽恢復正常水平，細胞體積又快速恢復。該結果對于闡釋不同營養鹽水平下東海原甲藻和米氏凱倫藻的生長競爭機制具有一定的啟示作用。

東海原甲藻；米氏凱倫藻；營養鹽；生長

富營養化是東海赤潮高發區連續發生大規模赤潮的物質基礎，對赤潮發生和演替起著關鍵性的作用，其中氮、磷是海洋浮游植物生長的限制因子。東海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）和米氏凱倫藻（Karenia mikimotoi）是東海赤潮高發區甲藻赤潮的主要優勢種，近年來對有關營養鹽與兩種甲藻生長、生理生化等方面影響的報道頗多。之前的研究多集中在東海原甲藻和米氏凱倫藻對不同氮源或磷源的吸收利用［1－4］，東海原甲藻對各類無機氮（NO－3-N、NH＋4-N和NO－2-N）和有機氮（尿素）均能較好利用，對甘氨酸和L-丙氨酸利用率不高［4－5］，米氏凱倫藻對NaNO3和NaNO2的利用效率要高于NH4Cl，以NaNO3和NaNO2為氮源時該藻生長情況也較好［3］，而不能利用甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸和1，4-丁二胺鹽酸鹽［6］。東海原甲藻和米氏凱倫藻既可以直接吸收利用無機磷（NaH2PO4），又可以不同程度地利用有機磷（三磷酸腺苷二鈉鹽、D-葡萄糖-6-磷酸鈉和甘油磷酸鈉）［1，7－9］。不同氮磷濃度或者氮磷比對東海原甲藻和米氏凱倫藻生長的影響也非常顯著［10－12］，氮磷比低于或高于Redfield比值（N/P＝16）時都會影響到東海原甲藻的生長速率［13］，而氮磷比80∶1時米氏凱倫藻生長速率最大［14］，另外，當氮源不同時，東海原甲藻生長速率達到最大值時的氮磷比也各不相同［5］。

在赤潮發生過程中，由于藻類生長需要各類營養元素，因此海水中各類營養鹽濃度隨著赤潮生消的進程同步減少，但是當赤潮優勢種對某種營養元素需求特別大反而成為限制因素，比如中肋骨條藻（Skeletonema costatum）對磷的需求比較大，當海水中磷處于較低水平時中肋骨條藻赤潮就開始消亡［15］。因此，非常有必要對東海赤潮高發區常見甲藻赤潮優勢種東海原甲藻和米氏凱倫藻在不同營養鹽水平培養下的生長特性進行系統研究。

1 材料與方法

1.1 藻種來源與培養條件

東海原甲藻由國家海洋局第二海洋研究所（杭州）陸斗定教授提供，米氏凱倫藻由中國水產科學研究院東海水產研究所（上海）提供。藻類培養基采用f/2培養基［19］。培養基所用海水采自浙江省舟山市嵊山島附近（30°45′N，122°50′E），海水pH為8.0，鹽度為28，海水經過孔徑為0.45μm濾膜過濾后備用。海水和培養基儲備液通過121℃高壓蒸汽滅菌20 min，在超凈工作臺配制所需培養基，所有培養基儲備液、藻類培養等所需三角瓶等全部經過高壓滅菌后使用。藻類培養溫度為20±1℃，光照強度為65～70 μmol·m－2·s－1，光暗比為12 h∶12 h，所有實驗光照強度和光暗比均為這個條件。藻類培養和實驗均在多溫度梯度光照培養箱中進行（MTI-201B，Rikakikai，Japan）。所有實驗采用的藻類均為培養至指數生長期藻類。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同營養鹽水平對兩種藻類生長的影響實驗

將處于指數生長期的東海原甲藻和米氏凱倫藻用于培養實驗，東海原甲藻的起始濃度均為0.65×104cells·mL－1，米氏凱倫藻的起始濃度均為0.25×104cells·mL－1，培養條件與前面一致，不同營養鹽水平設置為f/2培養基水平一次性添加后培養至實驗結束（第33天）和在f/2培養基水平上在實驗中期（第12天后）添加一次培養基母液。培養容器為100 mL三角瓶含50 mL藻液，每個處理重復3次，每天早晚固定時間手動搖動藻液2次，分別在第0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30天和33天取樣0.45 mL藻液加0.05 mL魯戈氏液固定，在光學顯微鏡（BX43，Olympus， Japan）下采用浮游植物計數框計數。同時同步測定和含量，測定方法參照海洋監測規范［20］。藻類比生長速率（μ，d－1）計算按照公式μ＝（lnN2-lnN1）/（t2－t1），其中N1為培養時間為t1時藻類細胞濃度，N2為培養時間為t2時藻類細胞濃度，實驗測定營養鹽添加之前（μ1）即t1與t2分別為第0天與第12天的數據和營養鹽添加之后（μ2）t1與t2分別為第12天與細胞濃度最高值的所對應的時間，營養鹽一次性添加（μ1′和μ2′）的實驗在相同的時間測定生長速率。

1.2.2 磷限制對兩種藻類生長的影響實驗

將處于指數生長期的東海原甲藻和米氏凱倫藻用于培養實驗，東海原甲藻的起始濃度均為0.45×104cells·mL－1，米氏凱倫藻的起始濃度均為0.25×104cells·mL－1，培養條件與前面一致，對照組正常營養鹽水平設置為f/2培養基水平一次性添加后培養至實驗結束（第18天），磷限制實驗營養鹽水平設置培養基為f/2（NaH2PO4·H2O除外）一次性添加后培養至實驗結束（第18天），培養液中的磷酸鹽僅為本底海水濃度，其中PO3－4濃度為0.032mg·L－1。培養容器為100 mL三角瓶含50 mL藻液，每個處理重復3次，每天早晚固定時間手動搖動藻液2次，分別在第0、3、6、9、12、15、18和24天取樣0.45 mL藻液加0.05 mL魯戈氏液固定，在光學顯微鏡（BX43，Olympus，Japan）下采用浮游植物計數框計數。并在第0、9、18和24天取樣進行在顯微鏡下測量東海原甲藻和米氏凱倫藻體長和體寬，其中第24天取樣后剩余藻類培養中添加f/2培養基配方中的NaH2PO4·H2O用于藻類恢復實驗，共計6天，在實驗結束時測量藻類體長和體寬。

1.3 數據處理

所有測定數據均為三個重復的平均值（mean）±標準差（SD）。不同營養鹽水平之間的生長差異采用Student’st-test檢驗，其中P＜0.05：表示差異顯著。磷限制對米氏凱倫藻細胞體積的影響實驗結果在單因素方差分析（one-way ANOVA）的基礎上，采用Duncan多重比較法檢驗不同溫度處理間差異（P＜0.05）。所有數據處理利用PASW Statistics 18.0和Excel 2010軟件。

2 結果與分析

2.1 不同營養鹽水平對兩種藻類生長的影響

由圖1可知，東海原甲藻一開始就進入指數生長期，從第6天開始就進入生長穩定期并一直維持到第15天，而后開始東海原甲藻生長又進入一個上升期在第21天細胞濃度達到峰值，之后進入衰老期。從第18天到27天期間，第12天后添加營養鹽的培養組中的東海原甲藻細胞濃度顯著高于一次性添加營養鹽的培養組（P＜0.05），在實驗后期第30和33天期間不同營養鹽水平培養組中東海原甲藻的生長又趨于一致。二次添加營養鹽組在營養鹽添加前后東海原甲藻的最大比生長速率分別為0.148 d－1和0.068 d－1，而一次性添加營養鹽組在相同時間段東海原甲藻的最大比生長速率分別為0.148 d－1和0.034 d－1，其中添加營養鹽后最大比生長速率顯著高于一次性添加營養鹽組（表1，P＜0.05）。米氏凱倫藻的生長趨勢跟東海原甲類似，前15 d處于指數生長期，而穩定期較短（只有3～6 d左右），之后生長也進入一個上升期，在第24天細胞濃度達到峰值，之后進入衰老期。在之后的實驗期間（第24天至33天），第12天后添加營養鹽的培養組中米氏凱倫藻細胞濃度顯著高于一次性添加營養鹽的培養組（P＜0.05）。二次添加營養鹽組在營養鹽添加前后東海原甲藻的最大比生長速率分別為0.332 d－1和0.108 d－1，而一次性添加營養鹽組在相同時間段東海原甲藻的最大比生長速率分別為0.343 d－1和0.069 d－1，其中添加營養鹽后最大比生長速率顯著高于一次性添加營養鹽組（表1，P＜0.05）。

同步分析水體中硝酸鹽和磷酸鹽的含量可以看出（圖2－3），兩種藻類的生長情況跟水體營養鹽水平非常相關，一開始無論是硝酸鹽還是磷酸鹽都有一個下降過程，主要是藻類生長處于指數期需要大量營養鹽支撐，之后營養鹽水平略有波動，藻類生長處于穩定期，第12天后再次添加營養鹽后，硝酸鹽和磷酸鹽濃度快速上升，之后隨著藻類的再次快速生長又被消耗。但是兩種藻類對營養鹽的吸收利用情況有所不同，東海原甲藻對硝酸鹽的吸收利用不高，一次性添加營養鹽的培養組中東海原甲藻對硝酸鹽的吸收利用率為31.6%，第12天添加營養鹽的培養組東海原甲藻對硝酸鹽的吸收利用率為12.9%（第12天添加營養鹽后計算）。而對磷酸鹽的吸收利用則較高，一次性添加營養鹽的培養組中東海原甲藻對磷酸鹽的吸收利用率為76.9%，第12天添加營養鹽的培養組中東海原甲藻對磷酸鹽的吸收利用率為57.3%（第12天添加營養鹽后計算）。米氏凱倫藻則對硝酸鹽和磷酸鹽的吸收利用都非常高，一次性添加營養鹽的培養組中米氏凱倫藻對硝酸鹽和磷酸鹽的吸收利用率分別為92.5%和99.9%，第12天添加營養鹽的培養組中米氏凱倫藻對硝酸鹽和磷酸鹽的吸收利用率為93.6%和99.6%（第12天添加營養鹽后計算）。另外，米氏凱倫藻的生長速率也遠遠大于東海原甲藻，兩者的細胞濃度基本上相差一個數量級（圖1），所以米氏凱倫藻對營養鹽的需求高于東海原甲藻。

2.2 磷限制對兩種藻類生長的影響

由圖4可知，磷限制對東海原甲藻生長的影響顯著，正常營養鹽水平培養組中東海原甲藻從第6天開始到實驗結束細胞濃度均顯著高于磷限制組（P＜0.05），在實驗后期磷限制組中的東海原甲藻細胞濃度始終處于一個很低的水平（＜10 000 cell·mL－1）。米氏凱倫藻的情況與東海原甲藻類似，正常營養鹽水平培養組中米氏凱倫藻從第9開始到實驗結束細胞濃度均顯著高于磷限制組（P＜0.05），但是米氏凱倫藻在磷限制情況下細胞濃度一直比較穩定在20 000 cell· mL－1這個級別上，到實驗結束（第24天）才降至10 000 cell·mL－1以下。因此，米氏凱倫藻相比東海原甲藻更耐低磷。

表1 不同營養鹽水平對東海原甲藻和米氏凱倫藻生長速率的影響（d－1）Tab.1 Effect of different nutrients levels on the specific grow th rate of P.donghaiense and K.m ikimotoi（d－1）

圖1 不同營養鹽水平對東海原甲藻和米氏凱倫藻生長的影響Fig.1 Effects of different nutrients levels on the grow th of P.donghaiense and K.m ikimotoi

圖2 東海原甲藻生長過程中水體硝酸鹽和磷酸鹽的變化Fig.2 Changes of-N and-P in P.donghaiense group

圖3 米氏凱倫藻生長過程中水體硝酸鹽和磷酸鹽的變化Fig.3 Changes of-N and-P in K.mikimotoi group

2.3 磷限制對東海原甲藻和米氏凱倫藻細胞體積的影響

磷限制組中東海原甲藻細胞體積在不同培養時間以及最后的磷酸鹽恢復培養中變化相差不大（P＞0.05）。東海原甲藻細胞長度和寬度分別約為20μm和10μm左右（表2）。而磷限制組中米氏凱倫藻細胞體積會隨著培養時間的增加而增大。從表3可知，低磷培養第9天后就發現有不少細胞體積增大的個體，通過顯微測量40個細胞發現平均體長為14.56μm，體寬為12.09μm明顯大于對照組中米氏凱倫藻的平均體長和體寬（11.27μm和9.01μm），低磷培養18 d后這種趨勢更加明顯，細胞體積大于對照組和低磷培養9 d中的米氏凱倫藻，低磷培養24 d后米氏凱倫藻體積有所縮小但仍然大于對照組（P＜0.05）。另外，第18天后低磷培養組重新添加磷酸鹽后，恢復培養6 d后米氏凱倫藻體積又恢復正常和對照組沒有明顯差異甚至還略小于對照組。

表2 磷限制對東海原甲藻細胞體積的影響Tab.2 Volum e of P.donghaiense in phosphorus lim iting conditions

表3 磷限制對米氏凱倫藻細胞體積的影響Tab.3 Volume of K.m ikimotoi in phosphorus lim iting conditions

圖4 不同磷酸鹽水平對東海原甲藻和米氏凱倫藻生長的影響Fig.4 Effects of different-P levels on the grow th of P.donghaiense and K.mikimotoi

3 討論

氮和磷是浮游植物生長所必需的主要元素，氮在細胞代謝中是形成氨基酸、嘌呤、氨基糖和胺類化合物的基本元素，磷則直接參與光合作用的各個環節，包括光能吸收電子傳遞、卡爾文循環以及對一些酶的活性起調節作用等［21］。本實驗研究了不同營養鹽水平以及磷限制的情況下東海原甲藻和米氏凱倫藻生長以及細胞體積的變化。結果表明，實驗中期（第12天）再次補充營養鹽后兩種甲藻的生長均顯著優于一次性添加營養鹽的組別（P＜0.05，圖1），在磷限制下兩種甲藻生長受到抑制的情況更加明顯（P＜0.05，圖4）。王正方等［22］的實驗結果也表明硝酸鹽濃度在0.04～0.30 mol·L－1時能較好地維持海洋原甲藻（P.micans）的增殖，而磷比氮更能限制海洋原甲藻的增殖。東海原甲藻對氮的吸收利用率不高，而且主要集中在培養前期（細胞處于指數生長期），而米氏凱倫藻對氮的吸收利用率則較高，在培養后期也持續利用（圖2－3），也就是說米氏凱倫藻的生長對氮需求更高。歐美姍［23］也報道東海原甲藻對無機氮的吸收主要集中在指數生長期，用于藻細胞的生長需要，而在穩定期吸收則不多。黃凱旋［6］研究指出當磷酸鹽濃度為0.65μmol·L－1時，米氏凱倫藻細胞對四種氮源（氯化銨、硝酸鈉、亞硝酸鈉和尿素）的吸收范圍為0.04～0.05mol·L－1。如果海區營養鹽豐富，米氏凱倫藻爆發赤潮的幾率就大大增加，龍華等［24］通過現場調查也指出米氏凱倫藻的細胞密度與營養指數和磷酸鹽濃度呈正相關性，高營養指數、豐富的磷酸鹽含量和低氮磷比是米氏凱倫藻赤潮形成的重要條件。另外，米氏凱倫藻生理適宜的氮磷比范圍較大，有較強的環境適應能力，由于環境會優先選擇與之相適應的特征種，形成適者生存的群落，因此這也是米氏凱倫藻能夠在適宜的環境條件下，從浮游植物種類之間的競爭中獲勝，成為優勢種并快速增殖，最后爆發大規模赤潮的原因之一［11］。

奢侈系數R［25］和生長潛力T［26］，都可以用來評價藻細胞內所儲存的營養對細胞生長繁殖的效用價值。其中，甲藻與硅藻相比具有較高的營養儲存能力，東海原甲藻細胞對氮的營養儲存能力RN值（41.5）和對磷的營養儲存能力RP值（4.3），明顯高于硅藻代表鐘中肋骨條藻與的RN（2.6）和RP（2.5）。東海原甲藻利用胞內氮的細胞生長潛力TN值（5.32 d）和利用胞內磷的細胞生長潛力TP值（2.08 d），也明顯高于中肋骨條藻的TN（0.56 d）和TP（0.53 d）［27］。在本實驗中，東海原甲藻在低磷水平下（＜0.5 mg·L－1）細胞濃度還保持較高水平（＞4.0×104cells· mL－1）維持近半個月（圖1－2），而米氏凱倫藻更是在相當低的氮（＜1.0 mg·L－1）和磷（＜0.05 mg·L－1）濃度下細胞數量保持高濃度（＞3.0× 105cells·mL－1）維持超過半個月（圖1、3）。這充分說明這兩種甲藻細胞內可以儲存的很多氮磷等營養元素，米氏凱倫藻尤其多。

另外，實驗中發現米氏凱倫藻細胞體積也隨著低磷培養時間的延長而持續保持明顯大于對照組的體積，磷得到補充后細胞體積迅速恢復正常大?。ū?）。類似的現象出現在另外一種甲藻（Gymnodinium catenatum）上，在缺少磷酸鹽的情況下培養6 d后發現藻細胞體積變大2倍［16］。這可能是藻類遇到不良環境時的一種應激反應，在某些情況下是可逆的，比如環境中磷的減少或缺乏，某些藻類可以利用細胞內營養鹽庫的調節來緩解，只要藻類細胞內營養庫沒有耗盡，當環境恢復到原先狀態時藻類體積也恢復正常。另外一種情形是某些藻類受到其它藻類化感物質的影響時，藻細胞很快就受到影響，并且這種變化往往是不可逆的，比如Rhodomonassp.在P.parvum過濾液的培養下就會發生細胞水腫變大最后分解的現象［17］，赤潮異灣藻（Heterosigmaakashiw）在中肋骨條藻過濾藻液的培養下也出現相似的結果［18］。

東海近海海域富營養化面積已居中國四大海區之首，并成為我國比較典型的赤潮高發區，東海原甲藻和米氏凱倫藻逐漸成為海區甲藻赤潮的優勢種。在海洋復雜環境下，研究各種環境因子以及協同效應對赤潮藻類生理生化的影響顯得尤為重要，今后可以結合分子生物學手段，在磷限制情況下針對東海原甲藻和米氏凱倫藻生長特性與細胞周期關鍵調控因子之間的關系、堿性磷酸酶（在磷吸收代謝過程中扮演重要角色）酶活性以及蛋白基因表達水平等方面開展深入研究。

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Effects of different nutrients levels on the grow th of Prorocentrum donghaiense and Karenia m ikimotoi

SHEN Ang-lv1，2，LIDao-ji2
（1.Key Laboratory of East China Sea＆Oceanic Fishery Resources Exploitation and Utilization，Ministry of Agriculture，East China Sea Fisheries Research Institute，Shanghai200090，China；2.State Key Laboratory of Estuarine and Coastal Research，East China Normal University，Shanghai200062，China）

Harmful algal blooms（HABs）is an increasingly serious marine environmental problem for aquaculture，fisheries and public health in many coastal areas throughout the world.HABs has become common in the Yangtze Estuary and East China Sea（ECS）since 1980s.Prorocentrum donghaienseandKarenia mikimotoihave been major harmful bloom species in HAB areas of the East China Sea（ECS）in recent years.Nutrients are important environmental factors related to microalgae growth，and can affect the population dynamics of individual species and species succession in the field.To understand the growth characteristics ofP.donghaienseandK.mikimotoi，the effects of different nutrients levels and phosphorus limitation on the growth were examined.In the present study，P.donghaienseandK.mikimotoiwere cultured under two nutrient concentrations（f/2 medium added once and f/2 medium added twice）and two phosphate concentrations（f/2 medium and f/2 medium without NaH2PO4·H2O）.In addition，the length and width ofP.donghaienseandK.mikimotoiweremeasured by themicroscope on 0，9，18 d and 24 d in phosphorus limitation groups，and after recovery culture for 6 d（added NaH2PO4·H2O with f/2 medium level）.In the two nutrient concentrations culture experiment，the results showed that the growth of two species were significantly different by different nutrient levels（P＜0.05），and cell densities in high nutrient level group were higher than that in low nutrient level group，the specific growth（μ）ofP.donghaiensein two nutrient level groups were 0.068 d－1and 0.034 d－1（from 12 d to 33 d），and the specific growth（μ）ofK.mikimotoiwere 0.108 d－1and 0.069 d－1，respectively.In addition，Prorocentrum donghaiensehas high absorption efficiency of phosphate（76.9%）andK.mikimotoihas high absorption efficiency of both phosphate（99.9%）and nitrate（92.5%）when determination of the nutrients is done synchronously.Furthermore，two species could survive with a high cell concentration for a long time in the low phosphorus condition，indicating that there are nutrient database in the two species.In the two phosphate concentrations culture experiments，results showed that the growth ofP.donghaiensewas surpressed remarkably（P＜0.05）in phosphorus limiting conditions on 6 d，and the cell density was always at a very low level（＜10 000 cell·mL－1）in the last 10 d；there was no significant difference in the volume ofP.donghaiensebetween two phosphate concentration cultures.The growth ofK.mikimotoiwas surpressed remarkably（P＜0.05）in phosphorus limiting conditions on 9 d，but the cell density was always at20 000 cell·mL－1from 9 d to 18 d；the cell volume ofK.mikimotoiwas larger than the control from 9 d to 24 d（P＜0.05），and the cell volume restored to the normal level when the phosphorus concentration returned to f/2 medium levels.The results in the present study could be used to understand the growth competition mechanism ofP.donghaienseandK.mikimotoiin different nutrient levels.

Prorocentrum donghaiense；Karenia mikimotoi；nutrient；growth

Q 948.8

A

1004－2490（2016）04－0415－09

2015－10－30

中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金項目（中國水產科學研究院東海水產研究所，2015M06）；科技部項目全球變化重大科學研究計劃（2010CB951203）

沈盎綠（1980－），男，浙江象山人，博士，副研究員，主要研究方向為河口海岸學。

E-mail：shenanglv＠163.com