重癥中暑對大鼠心肌腎素-血管緊張素系統的影響

邱婷，鄭維紅，陸程翔

(廈門大學附屬中山醫院神經內科1、重癥醫學科2，福建 廈門 361004)

重癥中暑對大鼠心肌腎素-血管緊張素系統的影響

邱婷1，鄭維紅1，陸程翔2

(廈門大學附屬中山醫院神經內科1、重癥醫學科2，福建 廈門 361004)

目的 探討重癥中暑對大鼠心肌腎素-血管緊張素系統的影響。方法選用雄性Wistar大鼠24只，應用隨機數表法將大鼠分為正常對照組、熱打擊后2 h組、熱打擊后24 h組，每組8只。采用放射免疫法測定大鼠血漿和心肌腎素及血管緊張素Ⅱ活性，采用免疫組化法測定心肌血管緊張素Ⅱ-1、2型受體(AT1R、AT2R)蛋白表達水平。結果大鼠熱打擊后60 min左右肛溫達到42℃，77 min左右平均動脈壓下降25 mmHg，此時即重癥中暑造模成功。熱打擊后2 h及24 h組大鼠血漿和心肌腎素-血管緊張素系統顯著激活[血漿RA：(2 237.0±173.2)、(1 498.0±172.3)vs(785.4±43.2)，P＜0.05；血漿AngⅡ：(143.4±19.8)、(76.8±21.6)vs(42.8±8.6)，P＜0.05；心肌RA：(10.63±0.59)、(8.49±0.92)vs(1.66±0.38)P＜0.05；心肌AngⅡ：(279.9±11.3)、（212.5±10.1)vs(39.6±6.3)P＜0.05]；熱打擊后24 h組大鼠血漿和心肌腎素-血管緊張素系統仍處于激活水平，但較熱打擊后2 h組明顯下降[血漿RA: (2237.0±173.2)vs(1498.0±172.3)，P＜0.05；血漿AngⅡ：(143.4±19.8)vs(76.8±21.6)，P＜0.05；心肌RA：(10.63±0.59) vs(8.49±0.92)，P＜0.05；心肌AngⅡ：(79.9±11.3)vs(212.5±10.1)，P＜0.05]。熱打擊后2 h及24 h組心肌AT1R蛋白表達明顯上調[(49.8±14.1)、(52.6±15.8)vs(13.0±5.0)，P＜0.05]；熱打擊對AT2R蛋白表達無影響[(14.1±6.2)、(16.8±7.3)vs (9.8±4.5)，P＞0.05]。結論重癥中暑早期能夠導致大鼠心肌腎素-血管緊張素系統顯著激活。

Wistar大鼠；中暑；心??；腎素-血管緊張素

大量的基礎研究表明，在心肌組織中存在包括腎素、血管緊張素原、血管緊張素轉化酶等成分在內的腎素-血管緊張素系統(Renin-angiotensin system，RAS)。在各種因素的作用下，可以在局部合成血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)，并發揮多種生理學效應。已有研究證明，在包括顱腦外傷、心肌梗塞、燒傷應激等多種動物模型中血漿血管緊張素Ⅱ水平顯著升高，局部心肌組織中腎素、血管素Ⅱ及血管緊張素Ⅱ-1型受體(AngiotensinⅡtype 1 receptor，ATlR)表達升高。一定范圍內的RAS激活對機體有積極的適應意義，而持久的激素水平增高則是有害的。目前對于重癥中暑后心肌局部RAS變化的研究少見報道。本研究建立大鼠熱打擊模型，觀察大鼠在熱打擊后血漿及心肌局部RAS的改變，為臨床對于重癥中暑的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物模型制備及大鼠分組 由于雌激素對熱打擊具有保護效應[1]，本實驗均采用成年雄性大鼠。熱打擊模型的建立方法：腹腔注射3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)麻醉，分離左側股動、靜脈，股動脈置入24 G套管針連接壓力轉換器，監測有創動脈血壓及脈搏。大鼠放入人工熱氣候模擬艙，艙內干球溫度(36.5±0.5)℃，濕度(60±5)%，每15 min用肛溫表測大鼠肛溫并記錄存活時間。取肛溫達到42.0℃，并且平均動脈壓(MAP)從峰值下降25 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)即為重癥中暑模型[2-3]。實驗選用健康雄性Wistar大鼠24只，體質量200～250 g。按隨機數表法將大鼠分為正常對照組、熱打擊后2 h組(于熱打擊模型建立后常溫復溫2 h)、熱打擊后24 h組(于熱打擊模型建立后常溫復溫24 h)。每組各8只。對照組大鼠置于常溫(25.0±0.5)℃，濕度(35±5)%的環境中。

1.2 血漿及心肌腎素(RA)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)水平測定 大鼠腹主動脈取血3 mL迅速注入含酶抑制(EDTA)的抗凝管中，迅速分離血漿，低溫冰箱保存。動物處死后取100 mg左心室心肌組織加入上述酶抑制劑溶液勻漿，離心，取上清液低溫保存。血漿及心肌組織均采用競爭放射免疫分析法測定RA、AngⅡ水平。計算按操作說明書進行。

1.3 心肌血管緊張素Ⅱ-1、2型受體(AngiotensinⅡtype 1、2 receptor，AT1R、AT2R)蛋白表達水平測定 動物處死后快速取少量心尖部心肌，置于10%甲醛溶液固定24 h。梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟包埋切片。Leica RM2016切片機。常規脫蠟，梯度酒精至水，行免疫組化染色。依次滴加一抗(抗體稀釋度均為1:50，試劑購自Santa Cruz公司)、二抗及DAB顯色系統。封片鏡檢。采用上海求為生物科技有限公司MIQAS醫學圖象定量分析系統進行圖像分析。每個標本取三個視野。計算平均每個視野中陽性表達面積占整個視野面積的比值。

1.4 統計學方法 應用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，多組均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 熱打擊大鼠中心體溫及血壓變化 大鼠熱打擊后肛溫逐漸上升，在約60 min達到42℃。大鼠熱打擊后MAP呈小幅度逐漸上升，45～70 min MAP迅速升高至160 mmHg左右，此后MAP呈下降趨勢。在約77 min降低25 mmHg左右，此時即為重癥中暑造模發生時間。

2.2 各組血漿和心肌RA、AngII水平比較 三組間血漿和心肌RA、AngⅡ差異有統計學意義(P＜0.05)。多重比較顯示：與對照組比較，熱打擊后2 h組大鼠血漿和心肌RA、AngⅡ顯著升高(P＜0.05)，熱打擊后24 h組大鼠血漿和心肌RA、AngII亦有明顯升高(P＜0.05)。與熱打擊后2 h組比較，熱打擊后24 h組大鼠血漿和心肌RA、AngⅡ明顯降低(P＜0.05)，見表1。

2.3 各組心肌AT1R、AT2R蛋白表達水平 三組間心肌AT1R差異有統計學意義(P＜0.05)。多重比較顯示：與對照組比較，熱打擊后2 h組大鼠心肌AT1R表達顯著上調(P＜0.05)，熱打擊后24 h組大鼠心肌AT1R表達亦顯著升高(P＜0.05)。與熱打擊后2 h組比較，熱打擊后24 h組大鼠心肌AT1R表達仍處于高水平，差異無統計學意義(P＞0.05)。熱打擊后心肌AT2R表達有增高趨勢，但三組間AT2R差異無統計學意義(P＞0.05)。見表2。

表1 各組血漿和心肌RA、AngII水平比較(±s)

表1 各組血漿和心肌RA、AngII水平比較(±s)

注：與對照組比較，aP＜0.05；與熱打擊后2 h組比較，bP＜0.05。

組別 只數 血漿心肌熱打擊后2 h組熱打擊后24 h組對照組F值P值888 RA[ng/(L·h)] 2237.0±173.2a1498.0±172.3ab785.4±43.2 132.139＜0.01 AngⅡ(ng/L) 143.4±19.8a76.8±21.6ab42.8±8.6 78.429＜0.01 RA[pg/(g·h)] 10.63±0.59a8.49±0.92ab1.66±0.38 91.954＜0.01 AngⅡ(pg/g) 279.9±11.3a212.5±10.1ab39.6±6.3 2839.115＜0.01

表2 各組心肌AT1R、AT2R蛋白表達水平比較(±s)

表2 各組心肌AT1R、AT2R蛋白表達水平比較(±s)

注：與對照組比較，aP＜0.05。

組別 只數AT1R(%)AT2R(%)熱打擊后2 h組熱打擊后24 h組對照組F值P值888 49.8±14.1a52.6±15.8a13.0±5.0 26.017＜0.01 14.1±6.2 16.8±7.3 9.8±4.5 3.407 0.052

3 討 論

隨著全球氣溫增高，重癥中暑發病率逐年增高。熱打擊作為一種主要的應激源扮演著重要的角色[4]。心臟是熱打擊下機體最先和最易受到損傷的部位[5]。熱打擊所致的心肌損傷近年來越來越受到重視，但對于其發病機制目前仍不明確[6-7]。研究表明，熱打擊所致的心肌損害有其特點。熱打擊可引起廣泛的心肌細胞水腫、變性、壞死等。而這些病理損傷與體溫升高的持續時間、程度等直接相關。隨著熱打擊的持續時間延長和程度的加劇，心肌的損害由開始的可以逆性逐漸發展為不可逆性損害。此時，即使脫離高溫環境心肌的損害仍然會繼續進展[5-6]。因此，熱打擊所致的心肌損害一直是國內外學者研究的熱點之一。對于其復雜的機制及臨床防治方法尚不甚明確?，F已明了，腎素-血管緊張素系統(RAS)是機體的重要應激激素反應系統之一。而血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是RAS的主要活性肽，它是通過與AT受體結合發揮作用。過去認為，血管緊張素Ⅱ的生物活性類似于大多數內分泌因子是通過血液循環到達靶器官和組織。隨后的基礎和臨床研究發現，在體內包括心臟、腎臟等多種器官和局部組織也存在RAS。局部產生的AngⅡ可能起著自分泌、旁分泌和胞內分泌的作用[8]，這種作用在正常生理條件下的意義并不十分明確。然而大量的研究發現心臟局部RAS在一些疾病的發生發展過程中有著十分重要的病理生理意義。有證據顯示心臟局部RAS在心肌梗死及再灌注損傷等缺血性心臟病、心功能不全、心力衰竭、燒傷等多種病理過程中起著重要的作用[9-10]。

本實驗中觀察了熱打擊后血漿及心肌局部RA及AngⅡ的變化。結果顯示，熱打擊后大鼠血漿及心肌RA、AngⅡ顯著升高。這說明作為應激反應的重要組成部分，RAS在熱打擊后迅速被激活，同時作為循環的重要調節系統，心肌局部RAS也在熱打擊早期迅速被激活。需要注意的是，本實驗中熱打擊后24 h心肌RAS的激活水平雖然仍較高，但相對于熱打擊后2 h卻顯示出迅速下降的趨勢。熱打擊時循環與組織AngⅡ增高在一定范圍內對機體有積極的防御意義，而持久的血漿與組織AngⅡ增多則可能帶來不利影響。研究發現，心肌局部RAS主要參與心肌局部血管緊張性和血流量的調節，并增加交感神經末梢釋放兒茶酚胺，促進血管內皮素釋放以及對心肌收縮功能的調節[9]。文獻報道局部增多的AngⅡ直接或刺激交感神經而增強對冠脈和心肌的收縮作用，使心臟做功加強但心肌供血卻相對不足，心肌氧耗增加而氧供卻減少，以致能量耗竭，細胞的鈣轉運能力下降，不能有效地將鈣轉運至肌漿網和胞外，造成細胞內鈣超載，胞內蓄積的鈣在線粒體與氧化磷酸化競爭能量，使呼吸鏈功能更加紊亂[11]，從而加重心肌損傷。此外，過量的AngⅡ還可以通過引起冠脈的收縮使得冠脈循環障礙，內皮細胞受損及自由基產生增多，對機循環系統等帶來不利的影響[12]。但是其他具體機制仍不清楚。研究認為，病理狀態下RAS激活造成的心肌損傷主要集中在其促進氧化應激損傷方面。ROS是一種具有高度活性的非特異性分子。在生理情況下所產生的活性氧，可以被機體利用并發揮重要的生理功能。但在病理情況下，氧化應激增強，則可以造成生命大分子物質的氧化損傷、鈣穩態失衡及引發細胞凋亡，從而造成心肌損傷。

目前認為AngⅡ的經典生物學作用由AT1R介導，其效應主要有血管收縮、心肌肥厚和細胞外基質增生、增加醛固酮釋放、介導炎癥及氧化應激反應等。本研究中熱打擊后大鼠心肌AT1R表達顯著上調。這顯然使得RAS能迅速參與到熱打擊后機體的應激反應當中。AT2R的功能尚未完全清楚，目前的研究結果認為AT2R具有拮抗AT1R的功能，AT2R可能和酪氨酸激酶相偶聯，引起血管擴張、抗平滑肌細胞增殖、促進細胞凋亡等效應。也就是說，AT2R介導了拮抗AT1R的生物學效應，兩者處于動態平衡之中[13-14]。本研究中熱打擊后心肌AT2R表達雖組間差異無統計學意義，但仍能看出有升高的趨勢。AT2R/AT1R比值有所上升。提示AT2R通過拮抗AT1R發揮潛在的心臟保護作用在熱打擊后的短時間內尚不能充分發揮出來。大量研究表明，在包括心力衰竭、心肌梗死在內的多種疾病中均可以見到AT2R表達上調，AT2R/AT1R上升[15-16]。占優勢地位的AT2R與AngⅡ結合激活，從而改善心臟功能，對于心臟是一種內源性保護機制。但是這些研究提示這種AT2R表達的上調均發生于24 h之后，乃至更晚[17]。本實驗中觀察到心肌AT1R與AT2R在熱打擊后表現出相反的變化趨勢，是與既往研究結果相符合的。并且進一步證實了AT2受體與AT1受體在熱打擊中介導了不同的反應。

綜上所述，在病理狀態下，RAS作為應激反應系統之一，發揮了機體保護作用，但同時其過度激活也對機體帶來一定的損傷作用。心血管系統是RAS調控的主要靶點，也是其損傷作用的突出表現所在。心肌局部存在的RAS在重癥中暑后迅速被激活，早期的激活可能對機體維持自身內環境的穩定有一定的作用，但隨著時間的延長，其激活程度有所下降，從而限制了心臟的進一步損傷。其機制尚不明確?？赡芘cAT2R和AT1R在熱打擊中表現出不同的變化趨勢從而介導了不同的機體反應有關。對于RAS系統各成分及相應受體的變化的具體機制還需要在今后的實驗中進一步研究。

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Effect of severe heatstroke on local cardiac renin angiotensin system in rats.

QU Ting1,ZHENG Wei-hong1,LU Cheng-xiang2.Department of Neurology1,Intensive Care Unit2,Zhongshan Hospital Xiamen University,Xiamen 361004, Fujian,CHINA.

ObjectiveTo investigate the effects of severe heatstroke on rat cardiac renin angiotensin system (RAS).MethodsA total of 24 male Wistar rats were randomly divided into control group,2 hours after severe heatstroke group and 24 hours after severe heatstroke group,with 8 rats in each group.Renin activity(RA)and angiotensinⅡ(AngⅡ)in plasma and myocardium were determined with radioimmunoassay.Cardiac angiotensinⅡtype 1,2 receptor(AT1R,AT2R)protein levels were examined by immunohistochemical method.ResultsAfter 60 minutes of heatstroke,rectal core temperature of rats reached 42℃or above,and mean arterial pressure decreased to 25 mmHg after 77 minutes.When these conditions meet the requirements,the severe heatstroke model was successfully established.Com-pared with control group,2 and 24 hours after heat stroke groups had significantly higher RA and AngⅡin plasma and myocardium[plasma RA:(2237.0±173.2),(1498.0±172.3)vs(785.4±43.2),P＜0.05;plasma AngⅡ:(143.4±19.8),(76.8± 21.6)vs(42.8±8.6),P＜0.05;myocardium RA:(10.63±0.59),(8.49±0.92)vs(1.66±0.38),P＜0.05;myocardium AngⅡ: (279.9±11.3),(212.5±10.1)vs(39.6±6.3)P＜0.05];Compared with 2 hours after heat stroke groups,24 hours after heat stroke groups had significantly lower RA and AngⅡin plasma and myocardium[plasma RA:(2 237.0±173.2)vs(1 498.0± 172.3),P＜0.05;plasma AngⅡ:(143.4±19.8)vs(76.8±21.6),P＜0.05;myocardium RA:(10.63±0.59)vs(8.49±0.92),P＜0.05;myocardium AngⅡ:(279.9±11.3)vs(212.5±10.1),P＜0.05].Compared with control group,AT1R protein levels notably increased in 2 and 24 hours after heat stroke groups[(49.8±14.1),(52.6±15.8)vs(13.0±5.0),P＜0.05].No apparent changes were observed in AT2R protein level[(14.1±6.2),(16.8±7.3)vs(9.8±4.5),P＞0.05].ConclusionHeat stroke can significantly activate renin angiotensin system in both plasma and myocardium in rats in the early stage.

Wistar rat;Heat stroke;Myocardium;Renin-angiotensin

R-332

A

1003—6350（2016）12—1905—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.12.004

2015-12-22)