浙江棉花黃萎病菌致病型菌株的鑒定及高溫抑制病害的表征分析

孫曉婷,鹿秀云,張敬澤*,祝水金

(1.浙江大學農業與生物技術學院生物技術研究所,杭州310058;2.河北省農林科學院植物保護研究所,河北保定071000;3.浙江大學農業與生物技術學院作物科學研究所,杭州310058)

浙江棉花黃萎病菌致病型菌株的鑒定及高溫抑制病害的表征分析

孫曉婷1,鹿秀云2,張敬澤1*,祝水金3*

(1.浙江大學農業與生物技術學院生物技術研究所,杭州310058;2.河北省農林科學院植物保護研究所,河北保定071000;3.浙江大學農業與生物技術學院作物科學研究所,杭州310058)

摘要用大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)落葉和非落葉致病型菌株特異性引物擴增并結合微菌核特征觀察,鑒定了浙江地區棉花黃萎病菌菌株的致病型,測定了溫度對病原菌生長發育的影響,分析了浙江地區夏季高溫對棉花黃萎病抑制現象的原因.特異性引物的聚合酶鏈式反應擴增結果表明,來自于浙江的5個代表性分離菌株(VD-h1、VD-h2、VD-h6、VD-h3和VD-h5)均屬于落葉型菌株.對不同類型菌株產生微菌核的觀察結果證實,落葉型和非落葉型的微菌核間形態及其長寬比存在差異.溫度對病原菌發育的影響結果顯示,來自浙江的2個菌株(VD-h1和VD-h6)和來自新疆的2個菌株(VD-101和VD-086)的最適生長溫度分別在22～28℃和22～26℃之間;32℃高溫顯著抑制了菌絲生長和分生孢子產生,并延遲了分生孢子萌發的時間.不同溫度試驗的結果間接證實了,棉花黃萎病在浙江夏季高溫條件下表現的隱退癥狀是因為高溫抑制了病原菌的生長和繁殖,這為病害發生規律研究提供了重要的科學數據.

關鍵詞棉花黃萎病菌;致病型;夏季高溫;病害抑制

棉花黃萎病是在棉花生產上危害最為嚴重的世界性病害之一,在我國主要是由大麗輪枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)引起的一種土傳病害.病原菌危害的嚴重程度依賴于病原菌分離系的毒性[1].SCHNATHORST等[2]首次報道了大麗輪枝菌株系間存在毒性水平差異,并依據病原菌引起棉花植株完全落葉或僅輕微枯萎但不落葉,把病原菌分為落葉(defoliating,D)和非落葉(nondefoliating,ND)致病型.D致病型株系引起的黃萎病癥狀出現較早,病害發生更迅速,導致棉花產量損失比ND致病型株系引起的更大[3-4];因此,明確病原菌的致病型有助于病害管理決策,如選擇適合的品種和避免在D致病型株系侵染的土壤中種植[5].同時,檢測病原菌的致病型,可了解土壤中病原菌種群動態,在病害防治上也有著重要的應用價值.國外已發展了基于聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)的特異性引物分子檢測技術用于大麗輪枝菌致病型菌株的劃分(D致病型和ND致病型)[68].該檢測技術也在我國廣泛應用于棉花黃萎病病原菌致病型的研究中[911].另外,一些研究顯示大麗輪枝菌產生的微菌核形態差異也與菌株的不同毒性相關:棉花D致病型菌株在水瓊脂培養基上產生長形和圓形混合的菌核;而ND致病型菌株在水瓊脂培養基上或在改良的多聚半乳糖醛酸鈉培養基上僅產生圓形菌核[1,12].LóPEZ-ESCUDERO等[13]進一步證實不同致病型株系間微菌核的長寬比存在顯著差異.這些研究為識別病原菌致病型株系提供了形態學上的性狀特征.

浙江不是我國棉花主要生產區域,2013年棉花栽培面積為17 264 hm2(浙江省農業廳統計數據),一直沒有觀察到田間黃萎病的發生.但在2014年,棉花黃萎病首次在浙江大學試驗田中嚴重發生.病害開始出現在6月上旬,嚴重發生在7月上旬.病害引起植株矮化,中下部葉片嚴重脫落(圖1A～B).然而,隨著氣溫升高,病害癥狀逐步緩解,新的病葉不再出現.到8月上旬,隨著棉花植株的生長發育,新葉數量增加,病株矮化現象已不明顯,雖然一些病株上還存在邊緣壞死的病葉,但典型黃萎病癥狀已不顯著(圖1C);其后,病株仍然開花結鈴.前期田間病害癥狀與描述的病原菌D致病型株系引起的非常相似[8],但后期又不完全一致,僅憑癥狀難以判斷病原菌的致病型.因此,本文主要通過基于PCR的分子檢測技術和微菌核形態特征,研究了浙江棉花黃萎病菌的致病型,并通過病原菌生物學特性分析,探明高溫抑制病害的成因,為進一步研究病害發生規律和病害防治策略提供科學數據.

圖1　棉花黃萎病落葉癥狀Fig.1 Defoliating symptoms of cotton verticillium wilt

1　材料與方法

1.1病原菌的分離和純化

采用常規分離培養方法對種植在浙江大學華家池校區試驗田中的棉花(中棉49和優質棉1號)病株樣品進行病原菌分離[14],然后進行單孢分離.采用菌餅加20%甘油的保藏方法,將單孢菌株保藏在-70℃低溫冰箱中.分離到的菌株通過形態學特征觀察和微菌核的產生情況,并結合分子序列特征(數據未顯示)被鑒定為大麗輪枝菌.本文選擇5個代表性分離菌株(VD-h1、VD-h2、VD-h6、VD-h3和VD-h5)進行研究.

供試參考菌株:2株致病型未知的菌株VD-101 (采集于新疆巴音郭楞州且末縣瓊庫爾勒隊)和VD-086(采集于新疆巴音郭楞州和碩縣塔哈其向陽4隊);2株非落葉型菌株BP2(江蘇省農業科學院植物保護研究所,南京)和TX9(河南新鄉);2株落葉型菌株VD-991(中國農業科學院植物保護研究所,來源于南京,強致病落葉型)和VD-084(河南新鄉).

1.2病原菌培養和DNA提取

將保存的大麗輪枝菌株系接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養基平板上進行活化,用打孔器(直徑0.5 cm)打取菌餅,接種到含有100 m L馬鈴薯葡萄糖肉湯(potato dextrose both,PDB)液體培養基的250 m L三角瓶中,置于搖床上,在25℃、黑暗和120 r/min條件下振蕩培養7 d.過濾收集菌體,用液氮冷凍干燥,然后研磨成粉,儲存在-70℃冰箱中.采用XIAO等[14]和ZHANG等[15]描述的十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)法提取DNA.獲得的基因組DNA溶解在50 m L超純水或TE(Tris-EDTA)緩沖液中,用溴化乙錠染色后在1%瓊脂糖凝膠上檢查.

1.3特異性引物的合成和擴增

根據致病型特異性引物的研究報道,引物對INTD2f(5′-ACTGGGTATGGATGGCTTTCAGG ACT-3′)和INTD2r(5′-TCTCGACTATTGGAAA ATCCAGCGAC-3′)是D致病型菌株的特異性引物,可擴增出462 bp片段[7];引物對INTND2f(5′-CTCT TCGTACA TGGCCATAGATGTGC-3′)和INTND2r(5′-CAATGACAATGTCCTGGGTGT GCCA-3′)是ND致病型菌株的特異性引物,可擴增出824 bp片段[67];引物對DB19(5′-CGGTGACAT AATACTGAGAG-3′)和espdef01(5′-CACACCGT CGGCTCAGAGT-3′)可對D致病型菌株擴增出334 bp片段[16].上述引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成.

用合成的引物對11個菌株的基因組DNA進行PCR擴增.其中,PCR擴增反應體系為50μL,包括10×緩沖液5μL,Mg2+3μL,2.5 mmol/L d NTP 1μL,引物2μL,Taq酶1μL(1.25 U),模板1μL,用雙蒸水補足至50μL.反應溶液在PCR儀(Eppendorf Mastercycler Pro S,德國)上進行擴增.擴增循環為:94℃預變性5 min;94℃變性45 s,60℃(INTD2f/INTD2r或INTND2f/INTND2r)或58℃(DB19/espdef01)退火1 min,72℃延伸1 min,30個循環;最后,72℃延伸10 min.PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.4菌核形成觀察

將供試菌株在PDA上活化,轉接到水瓊脂(water agar,WA)培養基上,在24℃黑暗條件下培養.每個菌株3個重復.20 d后,取菌落中心含有微菌核的瓊脂塊,用蒸餾水制備玻片.每個處理測量100個微菌核,統計和計算微菌核的長寬比.測量和攝影在Zeiss Axiophot 2顯微鏡下進行.

1.5溫度對真菌生長影響試驗

選取來自浙江的菌株VD-h6和VD-h1,以及來自新疆的菌株VD-101和VD-086在PDA上進行活化,然后從菌落邊緣用打孔器(直徑0.7 cm)切取菌餅,接種到PDA(200 g馬鈴薯,20 g葡萄糖,20 g瓊脂,1 L水)上,分別放置在12、14、16、18、20、22、24、26、28、30和32℃黑暗條件下進行培養.每個處理3次重復.檢查分生孢子產生情況,10 d后測量菌落生長半徑.

分別將菌株VD-086和VD-h1的分生孢子懸浮液(1×106m L-1)涂布于WA培養基上,置于32和34℃條件下培養,每個處理3次重復.于不同時間觀察分生孢子萌發、分生孢子梗發育、新的分生孢子形成及菌核形成情況.

2　結果與分析

2.1落葉型菌株的檢測結果

用大麗輪枝菌落葉型特異性引物對INTD2f/ INTD2r對11個棉花黃萎菌供試菌株進行PCR檢測,除菌株TX9(泳道6)和BP2(泳道8)外,均擴增到大小約為460 bp的特異性片段(圖2A).發生在浙江杭州的5個菌株(VD-h1、VD-h2、VD-h6、VD-h3和VD-h5)均被鑒定為落葉型,與已知落葉型參考菌株VD-084和VD-991一致.另外,來自新疆的2個菌株(VD-086、VD-101)也被鑒定為落葉型.

同樣,用大麗輪枝菌另外1對落葉型特異性引物對DB19/espdef01對11個棉花黃萎菌供試菌株進行PCR檢測,除菌株TX9和BP2外,均擴增到大小約為330 bp的特異性片段(圖2B).其鑒定結果完全一致于上述結果,即分離自浙江杭州的5個菌株(VD-h1、VD-h2、VD-h6、VD-h3和VD-h5)和來自新疆的2個菌株(VD-086、VD-101)均屬于落葉型.這也與以往的研究結果一致[6 8].

2.2非落葉型菌株的檢測結果

用大麗輪枝菌非落葉型特異性引物對INTND2f/INTND2r對11個棉花黃萎菌供試菌株進行PCR檢測,結果表明,僅菌株TX9和BP2擴增到一個大小約為820 bp的特異性片段(圖2C).

圖2　落葉型和非落葉型特異性引物PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agrose gel electrophoresis of PCR products of defoliating and nondefoliating pathotype isolates obtained with the specific primer pairs

2.3微菌核形成的觀察結果

對微菌核長寬比測定(表1)和其形態特征觀察結果(圖3)顯示:落葉型菌株的微菌核平均長寬比為4.11,范圍大約在3.16至5.79之間,大多數是長形的;而非落葉型菌株BP2的微菌核大多數近球形.供試菌株的微菌核長寬比測定結果與LóPEZESCUDERO等[13]的研究結果相似.

表1　落葉型及非落葉型菌株微菌核長寬比的測定結果Table 1 Length-to-width ratio of microsclerotia from defoliating and nondefoliating pathotype isolates

圖3　在水瓊脂上不同致病型微菌核的形態特征Fig.3 Morphological characters of microsclerotia for different pathotypes of Verticillium dahliae on water agar medium

2.4溫度對大麗輪枝菌的影響結果

在PDA平板上培養10 d后測量菌落半徑,結果(圖4)表明,4個菌株(VD-h6、VD-h1、VD-101和VD-086)在12～32℃范圍內具有相似的生長趨勢,但不同菌株間存在差異.來自新疆的菌株VD-101和VD-086最適生長溫度在22～26℃之間,而來自浙江的菌株VD-h6和VD-h1最適生長溫度在22～28℃之間.相比較,在28℃條件下來自浙江的菌株(VD-h6和VD-h1)比來自新疆的菌株(VD-101和VD-086)菌落生長更快,顯示出耐高溫特性.4個菌株的菌落在30℃下生長緩慢,菌絲變薄,呈現不規則形,尤其是來自新疆的菌株VD-101對溫度最敏感.在32℃條件下,菌株VD-101完全停止生長,而其余3個菌株在顯微鏡下可觀察到在菌餅邊緣產生了幾個很短的菌絲體.

圖4　溫度對大麗輪枝菌菌絲生長的影響Fig.4 Effect of temperature on mycelial growth of V.dahliae isolates from cotton

溫度對分生孢子產生影響的結果表明,在12～28℃條件下培養10 d后,4個菌株的分生孢子梗發育和形成的分生孢子球特征相似,但在30℃條件下,高溫顯著抑制了產孢.菌株VD-101菌絲發育形成不規則畸形,分生孢子梗和產孢體數量減少,個別分生孢子梗上產生幾個孢子形成的孢子球.在其余3個菌株中分生孢子梗和產孢體數量也明顯減少.在32℃培養10 d后,菌株VD-101菌絲停止生長,沒有分生孢子梗產生;而菌株VD-086在菌餅周圍形成稀疏的菌絲,產生的分生孢子梗數量很少,個別分生孢子梗具有一層輪枝,其余分生孢子梗不分枝,產孢體頂端產生一個孢子球.來自浙江的菌株VD-h1和VD-h6在菌餅周圍也產生少量短而稀疏的菌絲,分生孢子梗和分生孢子的形成類似菌株VD-086,但產生的分生孢子梗和分生孢子數量相對較多.

孢子萌發試驗表明,在32℃培養條件下,4個菌株的孢子雖然都萌發,但萌發時間延長.菌株VD-086在培養18 h后孢子開始萌發,VD-101在36 h后開始萌發,而VD-h1和VD-h6在3 d后開始萌發.不同時間觀察結果顯示,VD-101孢子萌發后不久就停止生長;其余3個菌株在10 d后都不能形成肉眼可見的菌落,僅在菌餅邊緣產生稀疏的菌絲體,在菌絲體上雖然都產生分生孢子梗和形成孢子球,但不形成典型輪枝.菌株VD-086的分生孢子梗上產生很少產孢體,或無產孢體,僅頂端產生一個分生孢子球(圖5A);菌株VD-h1的分生孢子梗變短,其上產生少量的產孢體和分生孢子球(圖5B);而菌株VD-h6具有與VD-h1的相似特征(圖片未顯示).在32℃條件下,3個菌株都能產生少量微菌核(圖5A和B),但微菌核都不變黑(可能由于黑色素合成途徑受阻).在34℃培養條件下,4個菌株的孢子都不萌發.

3　討論

圖5　32℃高溫對分生孢子梗和產孢體的影響Fig.5 Effect of high temperature at 32℃on conidiophores and conidiogenous cells

棉花栽培在浙江已有很長的歷史,然而,并沒有棉花黃萎病發生的報道,其原因尚不清楚.本研究首次報道了棉花黃萎病在浙江的發生,并測定了病原菌的致病型,為了解大麗輪枝菌的毒性變異和病害防治提供了重要信息.一些研究顯示,落葉型特異性引物對INTD2f/INTD2r和DB19/espdef01對于個別菌株不能擴增出產物[10-11];因此,我們同時用這2對引物對病原菌菌株進行了PCR擴增,都獲得了一致的結果.檢測的5個來自浙江杭州的菌株均是落葉型,這不同于我國其他地區棉花黃萎病菌具有2種致病型的報道[9-11].與已有的報道[1718]相似.一些研究認為棉花黃萎病菌在30℃通常不引起棉花病害[18].依據天氣網(www.tianqi.cn)中氣象數據記錄,杭州市2014年7月平均最高溫度32.74℃,中、下旬持續高溫(最高溫度達到37℃),而8月月平均最高溫度30.26℃(最高溫度達到36℃).比較病原菌生物學特性認為,田間持續高溫可能抑制了病原菌在寄主內的擴展、分生孢子的產生和萌發.在此期間,一方面由于植物擺脫了病原菌進一步擴展和侵染,另一方面此溫度范圍的高溫促進了植物的生長和發育[1920];因此,植物新的葉片產生并迅速生長,矮化現象逐步消失,棉花黃萎病癥狀出現隱退現象.另外,一些研究顯示,水勢減少有利于病原菌耐熱性稍微增強,反之降低(如低水勢時,真菌可在35℃生長,高水勢時,真菌不能在33℃生長)[18].杭州市2014年

我們在WA平板上檢查落葉型菌株和非落葉型菌株的微菌核形態學特征發現:9個落葉型菌株具有相似的形態學特征,在產生微菌核時,單個菌絲上可連續產生多個菌核;而非落葉型菌株BP2(TX9喪失了微菌核產生能力)大多數產生單個,偶爾連續產生2～3個微菌核,菌核間距較大.雖然本文觀察的非落葉型菌株數量有限,需要進一步研究證實這個性狀的普遍性,但提供了該微菌核特性的重要信息.結合微菌核長寬比,我們的結果為落葉型菌株和非落葉型菌株識別提供了形態學上的有用依據.

為了說明病原菌菌株的適應性和高溫抑制病害的現象,我們測定了浙江2個菌株對溫度的影響,并選擇地理來源和氣候差異較大的新疆2個菌株作為對照.來自浙江的2個菌株最適生長溫度為22～28℃,而新疆的2個菌株為22～26℃,反映了不同來源真菌的適應性.溫度對菌絲生長、分生孢子產生和萌發測定結果表明,高溫抑制了菌絲生長,導致分生孢子梗和分生孢子數量急劇減少,延長了分生孢子萌發時間或完全抑制了分生孢子萌發.這些結果也7月份雨日數17 d,8月份雨日數22 d,降雨增加了田間的水勢,也可能是影響棉花黃萎病隱退的另外因素.總之,本文結果為病害防治決策制定和棉花黃萎病發生規律的深入研究積累了重要的科學數據.

參考文獻(References):

[1] LóPEZ-ESCUDERO F J,BLANCO-LóPEZ M A.Isolation and morphologic characterization of microsclerotia of Verticillium dahliae isolate from soil.Biotechnology,2005, 4(4):296-304.

[2] SCHNATHORST W C,MATHRE D E.Host range and differentiation of a severe form of Verticillium alboatrum in cotton.Phytopathology,1966,56(10):1155-1161.

[3] BEJARANO-ALCáZAR J,MELERO-VARA J M,BLANCOLóPEZ M A,et al.Influence of inoculum density of defoliating and nondefoliating pathotypes of Verticillium dahliae on epidemics of verticillium wilt of cotton in southern Spain.Phytopathology,1995,85(12):1474-1481.

[4] BEJARANO-ALCáZAR J,BLANCO-LóPEZ M A,MELEROVARA J M,et al.The influence of verticillium wilt epidemics on cotton yield in southern Spain.Plant Pathology,1997,46(2):168-178.

[5] TJAMOS E C.Prospects and strategies in controlling verticillium wilt of olivel.EPPO Bulletin,1993,23(3): 505-512.

[6] MERCADO-BLANCO J,RODRíGUEZ-JURADO D, PéREZ-ARTéS E,et al.Detection of the nondefoliating pathotype of Verticillium dahliae in infected olive plants by nested PCR.Plant Pathology,2001,50(5):609-619.

[7] MERCADO-BLANCO J,RODRíGUEZ-JURADO D, PéREZ-ARTéS E,et al.Detection of the defoliating pathotype of Verticillium dahliae in infected olive plants by nested PCR.European Journal of Plant Pathology,2002, 108(1):1-13.

[8] PéREZ-ARTéS E,GARCíA-PEDRAJAS M D,BEJARANOALCáZAR J,et al.Differentiation of cotton-defoliating and nondefoliating pathotypes of Verticillium dahliae by RAPD and specific PCR analyses.European Journal of Plant Pathology,2000,106(6):507-517.

[9] 王莉梅,石磊巖.北方棉區棉花黃萎病菌落葉型菌系鑒定.植物病理學報,1999,29(2):181-189.WANG L M,SHI L Y.Identification of defoliating strains of Verticillium dahlia from cotton in North China.Acta Phytopathologica Sinica,1999,29(2):181-189.(in Chinese with English abstract)

[10] 王彥,鹿秀云,郭慶港,等.河北省棉花黃萎菌落葉型和非落葉型菌系初步鑒定.華北農學報,2010,25(4):196-200. WANG Y,LU X Y,GUO Q G,et al.Molecular identification of defoliating pathotype and non-defoliating pathotype of Verticillium dahliae from cotton in Hebei Province.Acta Agriculture Boreali-Sinica,2010,25(4):196-200.(in Chinese with English abstract)

[11] 朱陽陽,徐齊君,雷娟,等.陜西棉黃萎菌落葉型及非落葉型的鑒定.西北農業學報,2012,21(9):166-173. ZHU Y Y,XU Q J,LEI J,et al.Identification of defoliating and non-defoliating pathotype of Verticillium dahliae isolated from Shaanxi.Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica,2012,21(9):166-173.(in Chinese with English abstract)

[12] BEJARANO-ALCáZAR J.The virulence and inoculum density of Verticillium dahliae Kleb.in soil related to the epidemiology of verticillium wilt of cotton in The Guadalquivir Valley.Córdoba,Spain:University of Córdoba,1990:382.

[13] LóPEZ-ESCUDERO F J,ROCA J M,VALVERDECORREDOR A,et al.Correlation between virulence and morphological characteristics of microsclerotia of Verticillium dahliae isolates infecting olive.Journal of Phytopathology, 2012,160(7/8):431-433.

[14] XIAO Z L,KEVIN D H,ZHANG J Z.Synonymy of two species of Bipolaris from aquatic crops of Poaceae. Mycotaxon,2015,130(1):131-143.

[15] ZHANG J Z,GUAN P G,TAO G,et al.Ultrastructure and phylogeny of Ustilago coicis.Journal of Zhejiang University Science B,2013,14(4):336-345.

[16] MERCADO-BLANCO J,RODRIGUEZ-JURADO D, PARRILLA-ARAUJO S,et al.Simultaneous detection of the defoliating and nondefoliating Verticillium dahliae pathotypes in infected olive plants by duplex,nested polymerase chain reaction.Plant Diseas e,2003,87(12): 1487-1494.

[17] DE VAY J E,PULLMAN G S.Epidemiology and ecology of diseases caused by Verticillium species,with emphasis on verticillium wilt of cotton.Phytopathologia Mediterranea, 1984,23(2/3):95-108.

[18] HILLOCKS R J.Cotton Diseases.Wallingford,UK:CAB International,1992:82-126.

[19] ROUSSOPOULOS D,LIAKATAS A,WHITTINGTON W J.Controlled-temperature effects on cotton growth and development.The Journal of Agricultural Science,1998, 130(4):451-462.

[20] ROSOLEM C A,OOSTERHUIS D M,DE SOUZA F S. Cotton response to mepiquat chloride and temperature. Scientia Agricola,2013,70(2):82-87.

SUN Xiaoting1,LU Xiuyun2,ZHANG Jingze1*,ZHU Shuijin3*
(1.Institute of Biotechnology,College of Agriculture and Biotechnology,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China;2.Institute of Plant Protection,Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Baoding 071000,Hebei,China;3.Institute of Crop Science,College of Agriculture and Biotechnology,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

Summary China is the largest cotton producing country in the world.Zhejiang Province owned cotton growing area of about 17 264 hectares in 2013,was not major cotton producing area in China.Verticillium wilt,caused by Verticillium dahliae,is one of the most important disease of cotton and causes great economic losses in almost all cotton producing areas,but has not been found in fields in Zhejiang region.However,in 2014,the serious verticillium wilt disease of cotton was observed in the experimental field of Zhejiang University.The disease began to appear in the early June and occurred seriously in the early July.The disease caused the serious defoliation onthe middle and lower parts of plants and the diseased plants were significantly dwarf.However,the disease became to remit gradually in the early August during high temperature in summer and dwarf phenomenon of the diseased plants was not obvious with new leaf formation.Since then,the diseased plants were still able to bloom and produce bolls.The symptom of the disease was similar to that caused by the defoliating pathotype strains of V.dahliae but in the later period,not identical to that.

Based on the importance of verifying pathotype of pathogen and understanding the phenomenon of high temperature inhibiting disease for disease control,we detected the isolates causing the verticillium wilt disease of cotton by using the specific primers of defoliation and nondefoliation pathotypes of V.dahliae and characteristics of microsclerotia.Meanwhile,the effect of temperature on growth and development of pathogen was determined and the reason for the phenomenon of high temperature inhibiting disease was analyzed as well.

Results of polymerase chain reaction(PCR)amplification using the specific primers showed that the isolates (VD-h1,VD-h2,VD-h6,VD-h3 and VD-h5)obtained all belonged to the defoliating pathotype.The results of observation for characters of microsclerotia formation confirmed that the difference of microsclerotia length-towidth ratio between defoliating and nondefoliating pathotype isolates was remarkable.Temperature had a significant influence on Verticillium isolates.The optimal growth temperature of two isolates(VD-h1 and VD-h6) from Zhejiang was 22- 28℃and two(VD-101 and VD-086)from Xinjiang was 22- 26℃,whereas at 32℃, fungal hyphal growth was all inhibited.At the same time,the numbers of produced conidial decreased and conidial germination was delayed.Combining biological properties of fungus and meteorological data,research results indirectly verified that the reason for disappearance of disease symptoms was that the growth and reproduction of pathogen were inhibited under the condition of high temperature in summer.

In sum,this study provides important scientific data for studying the regulation of disease occurrence in future.

Key wordsVerticillium dahliae;pathotype;high summer temperature;disease inhibition

Identification of pathotype of Verticillium dahliae isolates on cotton in Zhejiang Province and phenotypic analysis on inhibitory effect by high temperature.Journal of Zhejiang University(Agric. &Life Sci.),2016,42(6):671- 678

DOI:10.3785/j.issn.1008-9209.2015.11.161 ?

中圖分類號S 435.62;Q 93-331

文獻標志碼A

基金項目:國家公益性行業(農業)科研專項(201503109).

*通信作者(Corresponding authors):張敬澤(http://orcid.org/0000-0001-8604-8280),E-mail:jzzhang@zju.edu.cn;祝水金(http:// orcid.org/0000-0001-6209-9630),E-mail:sjzhu@zju.edu.cn

收稿日期(Received):2015 11 16;接受日期(Accepted):2016 05 30;網絡出版日期(Published online):2016 11 19

第一作者聯系方式:孫曉婷(http://orcid.org/0000-0002-7474-1122),E-mail:xiaoting397@126.com

URL:http://www.zjujournals.com/agr/CN/article/download ArticleFile.do?attach Type=PDF&id=10427