北京紅地球葡萄內生菌的種群多樣性分析

王雁南，張 珣

(1.清華大學附屬實驗學校，北京 100084；2.中國農業大學植物保護學院植物病理學系，北京 100193)

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北京紅地球葡萄內生菌的種群多樣性分析

王雁南1，張 珣2*

(1.清華大學附屬實驗學校，北京 100084；2.中國農業大學植物保護學院植物病理學系，北京 100193)

摘要[目的]探究北京紅地球葡萄不同部位內生菌的種類及多樣性。[方法]對北京市葡萄主產區種植的紅地球葡萄葉片、果梗、果肉、果皮各部位進行內生菌的分離、鑒定和多樣性分析。[結果]紅地球葡萄不同部位的內生菌數量存在差異，果梗中內生細菌數量最多，果肉中內生真菌數量最多；共分離獲得內生細菌11株，16S rDNA序列鑒定結果表明果肉中內生細菌種類多樣性高于果梗、果皮和葉片，芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)在各組織中均有分布；變性梯度凝膠電泳(DGGE)結果表明不同部位內生細菌菌群存在差異性。[結論]試驗結果為葡萄內生微生態系統多樣性的深入研究提供了理論依據。

關鍵詞葡萄；內生菌；多樣性分析

Diversity Analysis of Endophytic Microorganisms of Red Globe Grape in Beijing

WANG Yan-nan1, ZHANG Xun2*(1. The Experimental School Affiliated to Tsinghua University, Beijing 100084; 2. Department of Plant Pathology, Institute of Plant Protection, China Agricultural University, Beijing 100193)

Abstract[Objective] To research the diversity analysis of endophytic microorganisms of red globe grape in Beijing. [Method] We isolated endophytic microorganisms from grape leaves, stems, pulps and peels which were collected from a vineyard in Beijing. Further identification and diversity analysis were carried out. [Result] There were differences in the endophyte number of different parts of red globe grape. Endophytic bacteria were the maximum in stems; and endophytic fungi were the maximum in pulp. A total of 11 endophytic bacteria strains were isolated. Based on the 16S rDNA gene sequence aligment, the species diversity of endophytic bacteria in pulps were higher than that in leaves, stems and peels.Bacillussp. was the dominant genus existed in all the tissues. DGGE profiles further proved the diversity of endophytic microorganisms in different tissues of red globe grape. [Conclusion] This research provides theoretical foundation for the in-depth research on diversity of grape endophytic microorganisms.

Key wordsGrape; Endophyte; Diversity

植物內生菌是指能定殖在健康植物體內，通常被宿主細胞膜包圍或是細胞基質包圍，與宿主植物互惠共生的植物體內所有腐生、寄生和共生微生物的統稱，包括真菌、細菌和放線菌[1]。植物內生菌是植物微生態系統中一個重要的組成部分，具有一定的特異性、區域性和層次性。內生菌由于具有在植物體內獨立自主的分裂繁殖和傳遞的特性，可能成為生物防治中有潛力的微生物農藥和增產菌。目前，植物微生態系統多樣性的研究已有很多報道，但多半集中在植物根際(圍)和葉圍微生物系統的研究上，對植株體內微生物多樣性的研究較少，特別是葡萄內生微生物系統的研究尚未見報道。

變性梯度凝膠電泳(DGGE)是Fischer等于1983年提出的用于檢測點突變的一種電泳技術，Muyzer等于1993年首次將其應用于微生物群落結構研究[2]。目前，該技術已被廣泛用于多種環境介質的微生物生態學研究，成為研究微生物群落結構的主要分子生物學方法之一。國內對微生物種群結構的研究以DGGE、T-RFLP為主[3]。鑒于此，筆者采用DGGE技術研究了北京紅地球葡萄不同部位內生菌的種類及多樣性，旨在為葡萄內生微生態系統多樣性的深入研究提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試材料。紅地球葡萄健康植株的葉片和果實采自北京市昌平區乃干屯紅地球葡萄園。

1.1.2培養基。TSA培養基(胰蛋白胨15 g，大豆蛋白胨5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉15 g，水1 L)用于內生細菌的分離；PDA培養基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，水1 L)用于內生真菌的分離。

1.2方法

1.2.1分離材料的表面消毒。分別選取成熟期紅地球葡萄健康植株的葉片、果實和果梗，各組織經流水沖洗后用70%乙醇浸30 s，再分別用2%次氯酸鈉溶液處理5 min，無菌水沖洗4次，最后一次沖洗液涂TSA、PDA平板，28 ℃培養3 d，檢測表面消毒效果。所有樣品采集后立即帶回實驗室處理，在6 h內完成分離試驗。

1.2.2內生菌的分離與純化。取表面消毒徹底的材料，用無菌的鑷子分離果實的果皮和果肉，分別稱量葉片、果梗、果肉、果皮2.0 g于無菌研缽中，加18 mL無菌水和少許無菌石英砂，研磨成勻漿。取上清液100 μL涂TSA和PDA平板，每個處理3次重復，置于28 ℃恒溫培養箱中培養5 d后，計菌落數，并挑取菌落形態不同的具有代表性的單菌落進行純化，保存備用。

1.2.3內生細菌的鑒定。分別提取分離獲得的內生細菌基因組，使用細菌16S rDNA通用引物63F/1387R擴增16S rDNA基因進行鑒定[4]，引物序列、擴增程序見表1。擴增產物由北京博邁德生物有限公司進行序列測定，測序結果用NCBI的Blast軟件與GenBank數據庫進行比對。

1.2.4紅地球葡萄不同部位內生總基因組提取。用改良CTAB法提取各組織基因組[5-6]。稱取表面消毒的各組織2.0 g，加液氮研磨成粉末狀，加500 μL CTAB提取液和100 μL 20% PVP，充分混勻，65 ℃水浴45 min，每隔10 min顛倒混勻1次，加入等體積(600 μL)氯仿-異戊醇混合液(24∶1，V/V)，充分混勻，室溫12 000 r/min離心20 min，吸取上清液，加等體積-20 ℃預冷的異丙醇，輕輕顛倒析出DNA，用70%乙醇溶液清洗2次，室溫干燥后，用50 μL ddH2O溶解DNA，置于-20 ℃冰箱中保存備用。

1.2.5DGGE。采用引物27F/1530R擴增細菌16S rDNA V1~V10區基因片段，膠回收后，再用引物341F-GC/534R擴增16S rDNA的 V3區基因片段[7]，引物序列見表1，擴增產物用試劑盒純化濃縮。DGGE采用聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度為35%~65%，每泳道上樣30 μL的V3區PCR純化產物，電泳條件為：60 ℃，120 V，7 h。

表1　PCR引物序列及擴增程序

2結果與分析

2.1紅地球葡萄不同組織部位內生菌數量差異紅地球葡萄葉片、果梗、果肉、果皮組織中內生菌的分離結果表明，不同組織部位的內生菌數量不同(表2)。同一組織部位分離獲得的內生細菌數量大于內生真菌，果梗中內生細菌數量最多，為11.90×103cfu/g，其次為果肉(10.33×103cfu/g)，葉片和果皮中數量較少，分別為2.00×103、1.67×103cfu/g。內生真菌以果皮中含菌量最多，為2.33×103cfu/g，其次為果梗(1.33×103cfu/g)，葉片和果肉中內生真菌數量最少。

表2紅地球葡萄不同組織部位內生菌數量

Table 2Population density of endophyte isolated from different tissues of red globe grape

×103 cfu/g

2.2紅地球葡萄不同組織部位內生細菌種類差異從北京紅地球葡萄健康植株的葉片、果梗、果肉、果皮中共分離獲得內生細菌11株，16S rDNA序列比對分析將其鑒定為芽孢桿菌屬、泛菌屬、葡萄球菌屬、微球菌屬4個細菌菌群(表3)。不同分離部位內生細菌種類存在差異(表4)，果肉中內生細菌種類最豐富，其次為果皮，葉片和果梗中種類較少。芽孢桿菌屬在各部位均能分離獲得，說明芽孢桿菌廣泛存在于成熟期紅地球葡萄健康植株中。

2.3紅地球葡萄不同組織部位內生細菌PCR-DGGE多樣性分析

2.3.1不同組織部位內生細菌16S rDNA基因片段V1~V10區PCR擴增。用改良的CTAB法提取紅地球葡萄各組織總 DNA，以此為模板，采用細菌16S rDNA V1~V10區通用引物 27F 和 1530R 擴增產物，目的片段大小為1 500 bp(圖1)。

表3紅地球葡萄不同組織部位內生細菌序列16S rDNA鑒定結果

Table 3Identification of endophytic bacteria isolated from different tissues of red globe grape by 16S rDNA sequence

菌株編號Strainscode分離部位Isolatedtissue內生菌種類SpeciesY-1葉片分散泛菌(Pantoeadispersa)Y-2葉片特基拉芽孢桿菌(Bacillustequilensis)G-1果梗泛菌屬(Pantoeasp.)G-3果梗芽孢桿菌屬(Bacillussp.)R-1果肉芽孢桿菌屬(Bacillussp.)R-4果肉葡萄球菌屬(Staphylococcussp.)R-6果肉枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)R-7果肉微球菌屬(Micrococcussp.)P-1果皮解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)P-3果皮微球菌屬(Micrococcussp.)P-4果皮枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)

表4紅地球葡萄不同部位內生細菌種類數量

Table 4Species number of endophytic bacteria in different tissues of red globe grape

個

2.3.2不同組織部位內生細菌16S rDNA基因片段V3區PCR擴增?；厥铡?.3.1”產物并以此為模板，采用細菌16S rRNA V3區通用引物341F-GC 和 534R 擴增產物，在瓊脂糖凝膠200 bp 處有1條明亮單一的條帶，純度高，可用于下一步試驗(圖2)。

2.3.3PCR產物的DGGE分析。由圖3可知，每個樣品經變性梯度凝膠電泳后都分離出數目不等的電泳條帶，并且各條帶的強度和遷移率各不相同，部分條帶染色強度較高，也有一些弱帶，各樣品之間有共有條帶，也有一些特有條帶。根據DGGE的分離原理，不同條帶代表不同的細菌類型，說明各樣品間存在一些共有的細菌類型，也具有各自特有的細菌類型。由此可見，成熟期紅地球葡萄內生細菌具有較豐富的種群多樣性。

注：1.葉片；2.果梗；3.果肉；4.果皮；5.陰性對照?！　　ote：1.Leaf；2.Stem；3.Pulp；4.Peel；5.Negative control. 圖1　引物27F/1530R擴增紅地球葡萄不同組織部位內生細菌16S rDNA基因片段Fig.1　Segment of 16S rDNA PCR amplification of endophytic bacteria from different tissues of red globe grape by primer 27F/1530R

注：1、2.葉片；3.果梗；4.果肉；5.果皮；6.陰性對照?！　　ote：1，2.Leaf；3.Stem；4.Pulp；5.Peel；6.Negative control.圖2　引物341F-GC/534R擴增紅地球葡萄不同組織部位內生細菌16S rDNA基因片段Fig.2　Segment of 16S rDNA PCR amplification of endophytic bacteria from different tissues of red globe grape by primer 341F-GC/534R

注：P.果皮；R.果肉；G.果梗；Y：葉片?！　　　ote：P.Leaf；R.Pulp；G.Stem；Y.Leaf.圖3　紅地球葡萄不同組織部位內生細菌群落DGGE分離圖譜Fig.3　DGGE separation map of endophytic bacteria from different tissues of red globe grape

3結論與討論

該研究表明，成熟期北京紅地球葡萄健康植株葉片、果梗、果肉、果皮不同組織部位內生細菌具有多樣性。上述結果為葡萄內生微生態系統多樣性的深入研究提供了理論依據。

植物內生細菌數量與植物的種類、基因型、器官、生長階段和環境條件等有關。該研究對成熟期紅地球葡萄健康植株葉片、果梗、果肉、果皮不同組織內生菌的分離結果顯示，不同組織部位的內生菌數量存在差異，且內生細菌數量大于內生真菌，這與史應武等[8-9]對其他種類植物中內生菌的研究報道一致。

對內生細菌的鑒定結果表明，芽孢桿菌屬存在于各組織部位的分離樣品中，包括枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等，說明芽孢桿菌可能是成熟期紅地球葡萄健康植株中廣泛存在的優勢菌屬。植物內生菌種類不僅受宿主植物自身的影響，植株外部生長環境如土壤、溫度、光照、雨水、空氣濕度等，也會間接影響內生菌的分布。目前，研究者認為植株內生菌的來源主要有2條途徑：一是來自根際土壤微生物，經根系運輸進入植株體內；一是來自大氣中微生物，經氣孔進入植株體內[10]。

在微生物群落多樣性的研究中，非培養法獲得的群落結構更接近實際，其包含了可培養的內生細菌和大量不可培養細菌的信息，PCR-DGGE技術是一種較理想的方法。該研究結果表明，成熟期紅地球葡萄健康植株中不同部位內生細菌具有多樣性，但具體哪些菌群是優勢菌群及不同部位間內生細菌菌群結構的相互關系還需深入研究。

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收稿日期2016-01-06

作者簡介王雁南(1998-)，男，北京人，清華大學附屬實驗學校高中生。*通訊作者，博士研究生，研究方向：植物病害生物防治。

基金項目農業公益性行業科研專項(201203035)。

中圖分類號S 432.4+4

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)03-013-03