轉雙價抗蟲基因大白菜新種質的獲得及其抗蟲性分析

蘭創業,劉　釗,賈曉軍,周　進

(1 山西省農業科學院 蔬菜研究所,太原 030031;2 新疆建設兵團 第六師農業科學研究所,新疆五家渠市 831300)

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轉雙價抗蟲基因大白菜新種質的獲得及其抗蟲性分析

蘭創業1,劉釗1,賈曉軍2,周進2

(1 山西省農業科學院 蔬菜研究所,太原 030031;2 新疆建設兵團 第六師農業科學研究所,新疆五家渠市 831300)

摘要:采用超聲波輔助花粉介導方法,將雙價抗蟲基因BmkIT-Chitinase導入早熟型大白菜自交系20-19-3,最終獲得了5個轉基因大白菜優良自交系純合株系Z1-5、Z2-7、Z9-6、Z11-6和Z20-13;以轉基因大白菜株系和非轉基因對照植株為材料,對BmkIT-Chitinase基因在大白菜中的遺傳規律、基因表達及抗蟲性進行進一步分析。結果顯示:(1)轉化株后代多代(T1～T4) PCR、Southern blotting等分子跟蹤檢測表明,目的基因已成功導入受體植株,且能夠穩定遺傳;用該轉基因方法對大白菜進行基因轉化所獲得的轉基因植株分析顯示,外源基因多數以多拷貝形式整合于核基因組,少部分外源基因以單拷貝形式整合。(2)Elisa 分析結果證明,所導入的外源基因可高效表達,T4代株系新鮮葉片中表達產物量最高達到0.069 μg·g-1左右。(3)轉基因株系田間抗蟲性統計分析表明,轉化株系與對照在抗蟲性方面有顯著差異,其對小菜蛾及菜青蟲抗性普遍提高2～3級。研究認為,轉BmkIT-Chitinase基因大白菜中BmkIT-Chitinase基因的表達可有效提高大白菜的抗蟲性。

關鍵詞:大白菜;花粉介導;BmkIT基因;Chitinase基因;雙價抗蟲基因

大白菜(BrassicacampestrisL.ssp.pekinensis)起源于中國,又稱結球白菜、白菜等,是中國乃至亞洲重要的栽培食用蔬菜之一。由于其富含維生素、糖、礦物質等營養成分,深受廣大消費者喜食。但在大白菜的栽培過程中,蟲害一直是影響其高產、穩產及品質的重要制約因素,其中,菜青蟲(PierisrapaeL.)、菜螟(Hellulaundalis)和小菜蛾(Plutellaxylostella)等鱗翅目昆蟲對其危害尤為嚴重[1]。由于白菜類蔬菜作物中缺乏有效的抗蟲資源,無法通過常規手段培育出抗蟲白菜類蔬菜作物品種[2]。因此通過生物技術手段對其進行抗蟲基因轉化及改造成為大白菜轉基因育種研究的重要內容。

近年來,通過農桿菌介導等轉基因方法,已經相繼獲得了轉雪花蓮凝集素基因[3]、馬鈴薯蛋白酶抑制劑基因[4]、豇豆胰蛋白酶抑制劑基因[5-6]、慈姑胰蛋白酶抑制基因[6]和蘇云金芽孢桿菌基因[7]等抗蟲大白菜新種質,但國內外最主要的、應用最廣泛還是源自蘇云金芽胞桿菌基因的轉Bt殺蟲晶體蛋白基因cry1Ab和cry1Ac白菜[7]。盡管如此,轉基因抗蟲大白菜與其它轉基因抗蟲作物(轉Bt殺蟲晶體蛋白基因玉米、棉花等)相比,其抗蟲性普遍較差,這可能與抗蟲目的基因在白菜類蔬菜作物中的表達水平偏低有關[1];另外,單抗蟲基因的轉化,抗蟲譜較窄,它只對某幾種或一小類害蟲具有毒殺作用,易使害蟲產生耐受性。因此,開發培育新型抗蟲基因,聯合使用2種或2種以上不同殺蟲機制的抗蟲基因對大白菜轉化是極其重要的。

昆蟲特異性蝎神經毒素是來源于東亞鉗蝎神經毒素中的一種富含生物活性的多肽物質,其對昆蟲有專一性麻痹致死作用,而對哺乳動物無害或毒性很小,因而被廣泛應用于生物殺蟲劑和抗蟲轉基因植物的研究[8]。在轉蝎神經毒素基因抗蟲植物研究方面,Barton等[9]首先將昆蟲蝎毒素基因AaIT、BeIT1和BeIT2等轉入煙草,表明了其對棉鈴蟲幼蟲有較強的致死性。姚斌等[10]將蝎毒素基因AaIT基因轉入煙草,監測到殺蟲活性。Wu等[11]也將昆蟲蝎毒素基因AaHIT基因轉入棉花中,使其對棉鈴蟲的致死率到44%～98%。而對于鱗翅目昆蟲而言,幾丁質是其消化道內壁和身體表皮的重要組成部分,昆蟲在蛻皮時分泌幾丁質酶以分解幾丁質,并蛻掉舊皮。如果將昆蟲幾丁質酶導入植物,使其在植物中持續表達,就會阻止入侵害蟲的正常發育,從而起到保護植物的作用。在轉昆蟲幾丁質基因抗蟲植物研究方面,Gopalakrishnan等[12]首次將煙草天蛾幾丁質酶基因插入苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒中,使其對草地貪夜蛾半致死時間大大下降。Ding等[13]也將煙草天蛾幾丁質酶基因通過農桿菌Ti質粒介導轉化到煙草中,獲得了抗煙蚜轉基因植株,但對煙草天蛾幼蟲抗蟲性不明顯。郝曜山等[14]將煙草夜蛾幾丁質酶基因與東亞鉗蝎神經毒素基因雙價基因導入玉米中,所獲得的轉基因玉米植株對玉米螟表現出明顯抗蟲性。在轉基因植物安全性日益受到重視的情況下,對這2種基因轉化進行研究并完善,將會有良好的應用前景。

本研究通過自己發明的超聲波輔助花粉介導的方法,將克隆構建的含有東亞鉗蝎昆蟲特異性神經毒素基因BmkIT[7]與具有廣譜殺蟲作用的煙草夜蛾幾丁質酶基因Chitinase[7]的雙價抗蟲基因,導入早熟型大白菜自交系20-19-3中,獲得了包含BmkIT和Chitinase基因的轉基因植株,通過對轉化株后代進行多代的PCR、Southern blotting等分子跟蹤檢測及田間抗蟲性鑒定和觀察,最終獲得了穩定遺傳的轉BmkIT-Chitinase雙價抗蟲基因大白菜。并證實了轉基因植株及其后代對2種鱗翅目昆蟲的抗性作用,豐富了轉基因大白菜抗蟲材料。

1材料和方法

1.1試驗材料

本研究所用受體材料為早熟型大白菜自交系20-19-3,株高40 cm,開展度35 cm×35 cm,生育期50 d,外葉綠色,葉肋成白色,黃心,在太原地區周年可以種植。由山西省農業科學院蔬菜研究所培育。

研究使用的農桿菌菌株為LBA4404,重組質粒pBI101-BmkIT-chi攜有東亞鉗蝎昆蟲特異性神經毒素基因(BmKIT)、煙草夜蛾幾丁質酶基因(Chitinase)及nptⅡ抗性基因等,載體所用的啟動子為花椰菜花葉病毒的CaMV-35s啟動子,終止子為Ti質粒中胭脂堿合成酶基因的終止序列nos,該菌株質粒由山西省農業科學院生物技術研究中心提供(圖1)。

1.2轉化和篩選

將經過低溫春化處理的大白菜自交系20-19-3幼苗,于春天移栽入專用實驗田,在其開花期每日上午10:00～11:00采集新鮮花粉,置于200 g/L蔗糖緩沖溶液中進行超聲波預處理,超聲波預處理參數為功率100 W,工作時間5 s,間隔15 s,工作5次。加入質粒DNA后,再次對花粉懸浮液進行超聲波處理,處理功率150 W,其他參數同前。將處理好的花粉滴加100 mg/L硼酸和200 mg/L硝酸鈣后快速涂抹于待轉化柱頭上,以促進其花粉萌發。授粉后用防蟲網袋隔離并標記。

圖1　質粒pBI101-BmkIT-Chitinase

將收獲的T0代種子用70%酒精滅菌后播于鋪有浸濕濾紙的培養皿中,卡那霉素發芽篩選濃度為150 mg /L,28 ℃下光照培養,3～4 d后根據其出芽情況,子葉及真葉顏色變化,初步篩選確定卡那霉素抗性苗,并將其移到營養缽中繼續培養,待苗壯后于4℃下低溫春化處理 1月,轉到大盆并置于溫室栽培,準備進行分子檢測并通過蕾期授粉以收獲種子得到自交后代。

1.3轉化株DNA提取及PCR檢測

取其嫩葉提取總DNA,提取DNA方法采用本單位改良的CTAB 法[15](提取緩沖液中加入0.5%乙基黃原酸鉀,將NaCI的濃度提高至2.5 mol/L,可使大白菜提取的DNA濃度及質量大大提高)。使用提取的卡那霉素抗性植株DNA模板進行PCR 擴增,擴增過程中以未轉化大白菜基因組DNA 為陰性對照,無菌水為空白對照,質粒為陽性對照。

Chitinase基因上游引物(5′-ATGCGAGCGA-CACTGG-3′)和下游引物(5′-TTGACATTCGCG-AGC-3′),擴增片段大小為1 800 bp。擴增采用20 μL體系,PCR擴增程序為95 ℃預變性5 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,35個循環,72 ℃終延伸10 min。PCR 產物4 ℃保存,1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。

BmkIT基因上游引物(5′-ATGAAATTTTTC-CTTATA-3′)和下游引物(5′-TTAACCAATTAT-TTGGAC-3′),擴增片段大小為280 bp。擴增時采用20 μL體系,PCR擴增程序為95 ℃預變性5 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個循環,72 ℃終延伸10 min。保存PCR產物,經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。

將重復均擴增出2個外源基因陽性條帶的植株確定為轉化株。引物合成是由上海生工生物工程公司完成。

1.4轉基因植株Southern blotting檢測

將PCR 檢測T2代呈陽性株的大白菜提取總DNA為待測樣品,以非轉基因大白菜DNA為陰性對照,陽性對照質粒DNA,用HindⅢ酶對待檢測樣品進行酶切,將酶切產物于1.2%瓊脂糖凝膠上電泳分離,進行Southern blotting雜交檢測。試驗中,DNA探針分別使用外源基因Chi基因1 800 bp和Bmk基因280 bp的全長基因。Southern blotting試驗按照Roche公司的DIG DNA Labeling and Detection Kit試劑盒的說明書進行。具體實驗如DNA 變性、轉移及雜交方法,雜交后用X-光片自顯影曝光參照《分子克隆》[16]。

1.5轉BmkIT-Chitinase基因白菜的Elisa檢測

為對外源雙價抗蟲基因在受體內表達水平進行定量分析,選取Chitinase標準樣品按每孔100 ng(1/10)n,n=1～10的標準稀釋10個濃度梯度,作為陽性對照,以水為空白;以非轉化大白菜蛋白為陰性對照,制作標準曲線。所有樣品的405 nm光吸收值均取3次重復測定結果的平均值[17]。

1.6轉化大白菜抗蟲鑒定

(1)田間網室抗蟲鑒定選取3代以上穩定遺傳的轉BmkIT-Chitinase基因白菜于專用溫室內鑒定。材料于2014年4月播種育苗,待幼苗4葉1心后將其移栽入溫室中,和非轉基因對照白菜單行種植,每份材料種植重復3次。取羽化歷期基本一致的小菜蛾成蟲(雌雄各半)按蟲苗比1∶10接蟲。2～3周后對葉片危害情況進行調查。

(2)田間抗蟲鑒定選取3代以上穩定遺傳的轉BmkIT-Chitinase基因白菜與非轉基因大白菜,在實驗田內雙行相間種植,全生育期少打或不打農藥防治,在春秋兩季菜青蟲高發期進行田間統計觀察分析。

(3)實驗室菜青蟲飼喂實驗選取3代以上穩定遺傳的轉BmkIT-Chitinase基因白菜與非轉基因大白菜,在實驗室培養皿內進行菜青蟲飼喂實驗。菜青蟲為田內人工抓取,每培養皿接蟲10條,放大小基本相同葉片飼喂12 h后拍照觀察并分析統計。

以上鑒定方法均根據葉片的咬食情況分級,抗性分級參考王欣[18]的抗性調查方法和分級標準。咬食級:網室田間鑒定危害情況;0級無蟲:全部葉片生長正常;1級有蟲:葉片有輕微危害癥狀,有小孔,但小孔不相連;3級有蟲:葉片危害癥狀較嚴重,葉片小孔相連,但葉片完整;5級有蟲:葉片危害癥狀嚴重,葉片有大洞,但葉片基本完整或有大量葉片殘余;7級有蟲:葉片危害癥狀極為嚴重,葉片僅剩葉脈及不完整葉片。

2結果與分析

2.1轉基因大白菜T0代種子的獲得及其卡那霉素抗性初步篩選

將超聲波處理過的含有外源基因雙價抗蟲基因表達構件pBI101-BmkIT-Chi的大白菜花粉,人工涂抹于待轉化花序(蕾期)上。共處理大白菜30株,由于處理后的花粉萌發率較低,最終獲得T0代種子6 000余粒。

轉化獲得的轉BmkIT-Chitinase基因大白菜應同時被賦予卡那霉素抗性,本試驗對T0代種子進行了卡那霉素抗性篩選。首先,分別將非轉基因大白菜種子在鋪有浸濕濾紙的培養皿中培養,浸濕濾紙附加卡那霉素濃度分別為0、50、100、150、200、250、300 mg/L[19],最終可以看到150 mg/L濃度正好可抑制全部非轉基因大白菜的種子正常生長萌動后子葉發黃以至死亡(圖2,A),因此,以濃度150 mg/L定為導入后代的卡那霉素抗性篩選濃度。最終在該濃度下T0代種子培養共獲得T1代抗性苗57株。

2.2轉基因大白菜PCR檢測

將初步獲得的卡那霉素抗性苗繼續培養并移栽到溫室。待苗壯后全部取樣并提取總DNA進行PCR檢測。重復3次。結果表明,T1代植株擴增出約為1 800 bpChitinase基因特異條帶的陽性植株有26株,擴增出約280 bpBmkIT基因特異條帶的陽性植株有31株,雙基因同時被檢測到的陽性植株為25株。PCR結果條帶清晰,少有雜帶,和陽性對照大小一致;陰性對照、水對照均未擴增出目的條帶,雙基因同時檢出重合率較高,表明操作過程中無污染,結果可靠。圖3為部分轉基因株系的檢測結果。

T1代雙抗蟲基因檢測為陽性植株經蕾期人工自交授粉獲得后代種子,經低溫春化后繼續種植獲得T2代轉基因大白菜,對其進行PCR檢測,檢測陽性植株繼續種植,連續3代PCR跟蹤(表1只列出了部分典型材料統計數據結果)。

從表1中可以看到,利用超聲波輔助花粉介導法轉化所獲得的T1代株系在其后代多代PCR分子檢測時,如果把所獲得的目的性狀外源基因作為顯性性狀的話,按照孟德爾分離規律理論,其T2、T3和T4代檢測陽性比率在后代整個群體中性狀分離比率應為3∶1、5∶1與9∶1,但在實際檢驗時其分離比率出現3種情況,如表1中Z1-5、Z2-7轉化事件中,其檢測結果后代分離比率與預期比率是基本擬合的,符合孟德爾遺傳分離規律,但這部分材料只占所獲得轉化事件1/5;另一情況材料在所獲得轉化事件中占大多數,如Z2-3、Z5-1檢測結果顯示,其T2代似乎就已經高度純合,檢測結果陽性率遠高于理論值,不符合孟德爾遺傳,考慮到所使用的轉基因方法,推測這些轉化事件中,外源基因并不是以單拷貝存在,而是多拷貝,多整合位點存在;第三種情況只在個別轉化事件中發現,如Z7-3。T2代材料檢測中只表現出極低的陽性率,將陽性植株再種植到T3代時未能檢測出陽性植株。

A.非轉基因種子在150 mg/L濃度卡那霉素水溶液培養(CK1);B.T0代轉化種子在150 mg/L濃度

轉化事件No.ofsamplesT2(預期陽性率75%)T2generation(expectableratio75%)陽性率Requencyofpositiveresult/%χ2PT3(預期陽性率83%)T3generation(expectableratio83%)陽性率Requencyofpositiveresult/%χ2PT4(預期陽性率90%)T4generation(expectableratio90%)陽性率Requencyofpositiveresult/%χ2PZ1-580.41.30.25187.61.00.31393.51.00.301Z2-395.721.8097.212.80.00399.59.00.002Z2-765.24.60.03082.60.10.95088.50.10.738Z5-189.210.00.00187.50.90.32593.20.80.368Z7-310.5218.000--0--Z9-655.619.1075.43.90.04685.20.91.171

M.DL2000;P.陽性對照;B.空白水對照;N.陰性對照;(A)1～18、(B)1～15.轉基因植株

2.3轉基因大白菜Southern檢測

對T2代PCR檢測仍呈陽性的植株進行了Southern blotting雜交檢測。檢測結果表明(圖4),PCR檢測的25個轉化事件中,有19個轉化事件的后代檢測到雙基因特異性雜交信號。初步證明外源抗蟲基因已經成功整合到了大白菜自交系基因組中。同時,Southern blotting雜交檢測結果呈陰性,PCR檢測結果呈陽性的幾個轉化事件在T3代PCR檢測也均表現為陰性結果,再次證明了轉化過程中存在少部分假陽性事件。而對Southern blotting雜交檢測結果進行分析表明,用該轉化方法對大白菜進行基因轉化時,大部分轉化事件為多拷貝、多位點整合到大白菜基因組中。

A.幾丁質酶基因;B.蝎毒基因;P.質粒;

2.4轉雙價抗蟲基因大白菜的Elisa檢測

對T4代PCR及Southern blotting雜交雙基因均呈陽性反應的轉基因植株進行Elisa分析?；趯氲耐庠椿驗殡p價抗蟲基因,本研究只對導入的Chitinase基因進行了蛋白表達濃度測定。首先,用酶聯免疫檢測儀測定chi標準樣品405 nm光吸收值,以蛋白質量濃度為橫坐標,以405 nm光吸收值為縱坐標,應用SigmaPlot軟件制作Elisa檢測標準曲線[17],相關性分析表明,標準蛋白相關系數為0.992,線性回歸方程為y=0.705x+0.004,之后,利用酶聯免疫檢測方法,分別對各轉化事件后代純合材料和陰性對照進行405 nm光吸收值測定,并根據標準曲線計算各被檢樣品的Chitinase蛋白濃度,部分結果如圖5。

檢測結果顯示,來源于Z1-5轉化事件中的 Z1-5-3株系,外源基因表達的幾丁質酶表達量最高,鮮葉片含量達到0.069 μg·g-1。而在轉化事件中占大多數的多拷貝、多整合位點的轉化株(如表中Z2-3、Z5-1等)在該檢測中表達量反而遠低于單拷貝的轉化株系(如Z1-5、Z2-7等),這也與后期蟲試結果基本吻合。

2.5轉雙價抗蟲基因大白菜抗蟲性網室及田間觀察鑒定

對所獲得的經各代分子檢測均為陽性,嚴格經過蕾期人工授粉所獲得的轉基因大白菜自交系T4代進行網室及田間抗蟲性觀察鑒定(圖6)。統計分析顯示(表2),各轉化事件T4代植株抗蟲性與對照相比有顯著差異,其對小菜蛾及菜青蟲抗性普遍提高2～3級,并且抗蟲性能夠穩定遺傳。

從表2可以看到,各轉化事件不僅與對照受體間在抗蟲性方面差異達5%顯著性水平,其相互之間也存在差異,如Z1-5、Z2-7和其他轉化事件如Z9-6、Z19-1等相比,在抗蟲性上也表現出很高的優勢。圖6可以直觀看到部分轉基因大白菜與對照在田間與實驗室人工飼喂的結果差異顯著。產生這種差異的原因和外源基因的插入位點、拷貝數的多少及外源基因在宿主細胞內表達量的多少相關。田間抗性結果與前期的分子檢測結果基本吻合。

圖5　部分轉基因大白菜株系目的基因的Elisa檢測結果

材料編號Linenumber小菜蛾各抗性級別植株比率InsecticidalratiooftransgenicChinesecabbagetodiamondmoth/%0～1級Level0-13級Level35級Level57級Level7菜青蟲各抗性級別植株比率InsecticidalratiooftransgenicChinesecabbagetoP.rapaeL./%0～1級Level0-13級Level35級Level57級Level7Z1-337.29±1.77c38.98±1.18ab20.82±2.25bc1.30±3.42cd60.08±2.45bc29.84±2.58cd9.78±2.08b0±0bZ1-567.33±1.22a20.27±1.30c11.13±3.31d0±0d88.13±1.71a11.68±2.62e0±0c0±0bZ2-321.99±0.40f41.92±2.98ab31.53±2.54b3.57±2.76c50.02±3.53cd35.27±1.75bc13.53±1.71ab0±0bZ2-751.00±0.88b21.55±1.87c24.85±2.28bc0±0d90.52±3.23a9.56±1.43e0±0c0±0bZ5-124.48±0.84ef35.67±0.19ab23.97±3.28bc14.77±2.35b44.65±1.68de40.60±2.47abc12.48±2.00ab0±0bZ6-327.99±0.63de35.99±0.90ab25.95±1.32bc9.36±2.48b43.97±2.32de37.99±0.68abc17.76±2.46ab0±0bZ9-646.89±3.23b34.32±4.63ab17.77±2.36cd0±0d66.04±1.39b31.79±2.51bcd2.00±0.83c0±0bZ11-327.47±0.87e30.96±1.82b45.99±1.14a0±0d49.98±3.04cd39.93±2.43bcd10.26±1.15b0±0bZ19-15.97±0.69g31.96±1.42b59.99±1.41a11.39±3.68b34.95±1.78e51.00±2.07a13.06±2.42ab0±0bZ20-529.38±0.98d44.99±1.45a24.50±2.28bc0±0d53.36±1.68bcd22.10±3.95d15.79±2.27ab0±0bCK4.11±1.84g19.84±2.08c46.97±2.33a23.63±3.84a31.72±3.71e43.98±1.76ab20.23±3.55a3.83±1.75a

注:不同小寫字母表示轉基因株系與對照受體間抗蟲性差異達到0.05顯著性水平。

Note:The different letters indicate statistic result of insect resistance between the different transgenic lines and control plant at the 0.05 level.

a.非轉基因對照;b～f.部分轉基因大白菜:b.z1-5;c.z2-7;d.z19-1;e.z9-6;f.z20-13

3討論

本研究首次實現了利用超聲波輔助花粉介導法對大白菜自交系的轉化,盡管在所獲得的6 000余粒種子中通過初篩及分子檢測最終只得到25個轉化事件,轉化效率僅為0.4%。但使用該方法不經過組織培養,當代就可以獲得種子,有效地避免了組織培養基因型限制、周期長等問題,其操作簡單、費用低廉,不失為一種優秀的白菜轉化基因方法。在研究過程中也發現,該方法在大白菜所獲得的轉化事件中外源基因在宿主基因組中以多拷貝、多位點整合方式存在較多,這與杜建中等[20]在玉米、王景雪等[21]在芥菜等作物上轉化結果不同,在一定程度上降低了其轉化效率。在轉化過程中也發現轉化事件中存在一定的假陽性事件,也存在雙基因只檢測出一個基因,而另一個基因檢測不到的情況,證明該方法在轉化過程中只有部分基因導入的現象,這可能與前期超聲波處理質粒結構破損有關,這與郝曜山等[14]在玉米上結果是相同的。

本研究所獲得轉基因大白菜新品系在溫室及田間的抗蟲性鑒定結果證明了雙價抗蟲基因BmkIT-Chitinase編碼的2種殺蟲蛋白對鱗翅目害蟲有較好的抗性。2種抗蟲基因在大白菜中同時表達,可以有效地避免該種蔬菜大面積種植時田間害蟲對該基因表達的蛋白產生抗性及耐受性。鑒于其與商業上廣泛采用的Bt殺蟲晶體蛋白完全不同的殺蟲機理,及其專一作用于昆蟲體內特殊靶標位點而對哺乳動物無害的特性,認為對該新品系的研發一方面豐富了大白菜的抗蟲基因材料,另一方面也可以有效解決鱗翅目害蟲抗性風險。

對所獲得的轉化事件從T1代到T4代進行了PCR、Southern blotting雜交和外源基因表達的蛋白等分子檢測,并以此結果為依據對大白菜自交系進行了選擇,最終獲得了較純合的轉BmkIT-Chitinase基因大白菜新品系。在此過程中,雙價抗蟲基因BmkIT-Chitinase在大部分材料中能夠隨白菜核DNA穩定遺傳,且其蛋白表達檢測與田間抗蟲鑒定結果表現出較高的一致性。但在各代跟蹤檢測調查中,也發現了很多外源基因在各代遺傳中并沒有符合現有的遺傳規律,如材料z2-1、z5-1等在T2代的PCR檢測中似乎就表現出很高的純合率,后來的Southern blot雜交檢測證明了該轉化事件中外源基因是以多拷貝的形式存的,結合該材料的分離情況,我們推測此事件中外源基因不僅存在多個拷貝,而且其整位點應該處于多條染色體上。研究中還發現了小部分材料,如Z7-3等,其在T1和T2代材料中PCR檢測呈陽性,且其陽性率較低,而在T3代材料后均檢測不到陽性植株,Southern blotting雜交檢測結果為陰性,排除了污染等實驗室人為情況,此假陽性事件是如何繼續到T2代的,推測是否存在伴隨母體的細胞質遺傳,在這些方面我們將會進一步深入研究。

在轉BmkIT-Chitinase基因大白菜遺傳穩定的株系中,盡管經分子檢測選擇抗蟲基因已基本純合,其田間抗蟲性與對照表現出明顯差異,但不同株系間抗蟲性程度也存在明顯差異,研究表明,外源基因的拷貝數與外源基因的表達及田間抗蟲性相關。高拷貝數基因表達及田間表現反而低于低拷貝數的轉化事件,這與郭美錦等[22]和 Hohenblum H等[23]在畢赤酵母上的外源基因表達研究結論是相似的。同時也發現,同樣為單拷貝的轉化事件在田間抗蟲程度方面也存在較大的差異,這可能和外源基因的插入位點及方式也有一定的相關性。因此,在選育轉雙價抗蟲基因大白菜新品系時,還結合了田間調查,與常規育種技術相結合逐代選留了具有較高抗蟲性的單株、自交留種和單株播種方法,最終獲得了5個轉BmkIT-Chitinase雙價抗蟲基因大白菜優良自交系,這些自交系所導入的外源基因可高效表達,在田間抗蟲性表現與對照有顯著差異,抗性普遍提高了2～3級。

參考文獻:

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(編輯:宋亞珍)

Acquirement of Transgenic Chinese Cabbage withBmkIT-ChitinaseGene and Their Insect -resistant Bioassay

LAN Chuangye1,LIU Zhao1,JIA Xiaojun2,ZHOU Jin2

(1 Shanxi Academy of Agriculture Sciences Vegetables Research Institute,Taiyuan 030031,China;2 Institute of Agricultural Research,6th Branch of XPCG,Wujiaqu,Xinjiang 831300,China)

Abstract:At the present study,the binary insect-resistant BmkIT-Chitinase gene was successfully transformed into the Chinese cabbage inbred line 20-19-3 via pollen mediated transformation approach assisted by supersonic.Five transgenic Chinese cabbage inbred lines Z1-5,Z2-7,Z9-6,Z11-6 and Z20-13 were obtained.The genetic rules,transgenic expression and insect resistance of above transgenic materials were compared with untransformed control.The PCR amplification and Southern blot hybridization detection on transgenic plants and their progeny showed that:(1)BmkIT-Chitinase gene has been transformed into the genome of receptors and the transgenics can inherit stably.Most transgenics exist in multi-copy form and single copy transgenics appeared in few translines.(2)ELISA assay verified the expression of foreign gene and the expression product of BmkIT-Chitinase gene in T4transgenic plants were high to 0.069 μg·g-1fresh leaves.(3)Field insect-resistant bioassay showed that there are significant differences on insect resistance between transformed inbred lines and their control groups.The level of insect resistance activities of Pieris rapae Linnaenus and Plutella xylostella Linnaenus enhanced 2-3 degree.

Key words:Chinese cabbage;pollen mediated transformation;BmkIT gene;Chitinase gene;binary insect-resistant gene

中圖分類號:Q785;Q786

文獻標志碼:A

作者簡介:蘭創業(1980-),男,碩士,助理研究員,主要從事大白菜種質資源創新研究。E-mail:1424054138@qq.com

基金項目:科技援疆項目(2014072008)

收稿日期:2015-08-06;修改稿收到日期:2015-12-25

文章編號:1000-4025(2016)01-0008-09

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.01.0008