生物膜致慢性創面難以愈合的病理機制及其治療*

牟天易 綜述，簡華剛 審校

(重慶醫科大學附屬第二醫院急診外科　400010)

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·綜述·

生物膜致慢性創面難以愈合的病理機制及其治療*

牟天易 綜述，簡華剛△審校

(重慶醫科大學附屬第二醫院急診外科400010)

生物膜；傷口愈合；慢性創面；病理機制

慢性創面(chronic wounds)是指機體正常皮膚及組織損傷后，因內外因素作用，接受超過1個月的正規治療，而無法經過及時、有序、正常的修復程序，達到解剖及功能上完整、無愈合傾向的創面[1-2]。臨床上常見慢性創面有糖尿病足潰瘍、創傷性潰瘍、壓力性潰瘍、下肢靜脈潰瘍等。由于缺血缺氧、高血糖、失神經等情況，慢性創面中具有先天免疫功能的表皮受損，皮下組織外露，具有濕潤環境，豐富營養，為細菌生物膜的形成提供理想環境。近年來，細菌生物膜的形成在慢性創面中所起的作用逐漸被重視，現代研究認為，除了缺氧、缺血再灌注損傷和宿主內在因素外,細菌生物膜的形成成為慢性創面難以愈合的主要障礙[3]。更加深入地了解細菌生物膜致慢性創面難愈合的機制及如何控制慢性化的惡性循環，將為慢性創面的治療提供方法。本文就生物膜定義、生物膜致慢性創面難以愈合的病理機制、生物膜的臨床治療作簡要綜述。

1　生物膜的定義及生物膜存在于慢性創面

生物膜為微生物黏附于物體及活性組織表面或彼此黏附，包被于自身分泌的由蛋白質、DNA、多糖等組成的細胞外基質(extracelluar polymeric substance，EPS)，形成一個與其浮游狀態完全不同的生長方式的群落，對宿主免疫系統及抗菌藥物治療形成天然抵抗，產生持續致病性的微生物聚集體[4]。生物膜是微生物針對不利環境形成的一種保護性生長方式。James等[5]調查生物膜的存在時發現，只有6%的急性創面發現生物膜，而60%的慢性創面中表現出生物膜的存在；這表明生物膜更多存在于慢性創面，而很少在急性創面，這可能與慢性創面難以愈合有關。創面生物膜的形成可能是創面慢性化的重要原因之一[3]；由于生物膜形成是細菌耐藥的機制之一[6]，慢性創面中細菌生物膜的形成可能與臨床上細菌多重耐藥有關；慢性創面中生物膜作為細菌的儲存庫，源源不斷地釋放出浮游細菌，持續刺激機體產生炎性反應，讓創面停滯于炎性反應期，生物膜在延遲慢性創面愈合中起著重要作用[7-8]。

2　生物膜致慢性創面難以愈合的病理機制

急性創面愈合經過凝結，炎性反應期，增生性階段(肉芽組織形成)及再上皮化或重塑階段，重建皮膚結構及功能的完整性；由于細菌生物膜不當的調節創面炎癥細胞、實質細胞、炎癥因子、細胞因子及pH值等，使慢性創面固定于炎性反應期，無法成功地進入增生性階段及再上皮化或重塑階段；由于生物膜的結構特點，形成一個致密物理屏障，對抗菌藥物及免疫系統耐受，細菌生物膜難以被清除，持續存在于慢性創面，引起慢性創面出現持續低效應炎性反應。

2.1炎癥細胞慢性創面中生物膜的持續存在，生物膜內的細菌及其分泌的細胞外基質作為趨化因子，源源不斷地趨化和招募炎癥細胞至創面。在創面發生時，中性粒細胞是到達創面第一批炎癥細胞,通過消除細菌、異物、壞死組織,并釋放細胞因子促進血管再生和肉芽組織的形成，有助于傷口愈合。然而,由于細菌生物膜致密的細胞外基質，中性粒細胞難以大量滲透到生物膜內部，即使部分滲透到生物膜周圍，也難以對其發揮吞噬作用。在群體感應系統作用下，各種細菌毒力因子的產生，抑制了中性粒細胞的活性；有報道稱銅綠假單胞菌生物膜的群體感應系統控制的毒力因子——鼠李糖脂,能引起中性粒細胞快速溶解[9]，致使生物膜難以被清除；中性粒細胞在感染部位持續的聚集，產生大量的溶細胞酶、活性氧、蛋白酶(彈性蛋白酶和金屬蛋白酶)。而低水平的活性氧作為胞內信號的重要介質可有效地促使創面愈合；不受控的活性氧釋放，導致細胞組件如磷脂、蛋白質、細胞質酶和核酸等破壞，使創面周圍正常細胞發生壞死及凋亡[10]。蛋白酶降解參與傷口愈合級聯的關鍵蛋白質和細胞外基質及生長因子，對鄰近的健康組織造成傷害，從而抑制創面愈合。

2.2實質細胞角質細胞及成纖維細胞是創面愈合的主要細胞，但在慢性創面中細菌生物膜致角質細胞及成纖維細胞失活，并加速其凋亡。Secor等[11]在金黃色葡萄球菌生物膜及其浮游狀態對人類角質細胞影響的實驗中發現，以暴露于金黃色葡萄球浮游菌的角質細胞為對照，暴露于生物膜的角質細胞發生快速凋亡在4 h及24 h，并在24 h后相互黏附的細胞數目顯著下降；在4 h時暴露于生物膜基質的角質細胞產生更多的細胞因子，但在24 h后，除腫瘤壞死因子α(TNF-α)外，其角質細胞產生細胞因子顯著減少，這可能與生物膜抑制角質細胞活性并加速其凋亡有關。Kirker等[12]在研究耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的浮游菌和生物膜對人類成纖維細胞的影響時發現：在48 h后，成纖維細胞的細胞活性明顯降低，且黏附于培養皿的細胞數目顯著減少。

2.3炎癥因子及細胞因子細菌生物膜存在的慢性創面有異常的炎癥因子、生長因子的表達，可能延遲創面的愈合。Kirker等[12]檢測MRSA的浮游菌和生物膜對人類成纖維細胞相關細胞因子水平的影響發現，生物膜組IL-6、IL-8水平顯著減少，但生物膜組的細胞產生TNF-α水平明顯增加。IL-6可刺激成纖維細胞生長因子產生，同時增加中性粒細胞黏附于成纖維細胞，從而促進創面愈合；IL-8作為一個強有力的血管生成因子，在促進角質細胞的遷移和血管再生方面發揮著重要作用，TNF-α能夠誘導許多細胞凋亡，可能加速創面愈合的實質細胞凋亡，而延遲創面愈合。Guggenheim等[13]在體外生物膜實驗中發現細胞因子被生物膜降解，通過對生物膜的蛋白質組學分析，生物膜中的蛋白酶可能與細胞因子的降解有關。Kirker等[12]檢測了人類角質細胞代表性生長因子[血管內皮生長因子(VEGF)、轉化生長因子β1(TGF-β1)]和肝素結合表皮生長因子(HB-EGF)，暴露于生物膜的細胞產生的生長因子(VEGF、TGF-β1和HB-EGF)水平明顯降低，生長因子將促進角質細胞和成纖維細胞進行有絲分裂，這表明促進創面愈合的生長因子減少，可能與生物膜存在的慢性創面難以愈合有關。

2.4創面pH值細胞內外的pH值是創面愈合另一重要因素，且不同的治療階段需要不同pH值范圍。創面愈合依賴于細胞內外pH值,其變化將影響血管生成、膠原蛋白的形成、中性粒細胞及巨噬細胞功能、抗菌藥物活性。正常皮膚的pH值范圍在4.0～6.0，皮膚表面有酸性外膜，這對皮膚功能和抑制微生物致病是至關重要的，低的pH(pH=5.0)抑制微生物生長[14]，已被證實正常創面的愈合發生在低pH值環境下，而慢性創面通常被檢測為堿性環境。酸化的創面床已經發現有助于創面感染的控制,而堿性環境則減慢創面愈合的進程。有研究表明慢性創面pH值范圍從6.5～8.5(平均在7.4)[15]，增加pH值將增加的生物膜的產生[16]，堿性化的環境可能是由壞死組織、細菌及其產物氨造成,堿性環境的形成將進一步促進細菌增殖。生物膜存在的慢性創面，有持續的炎性反應，致中性粒細胞在創面聚集，中性粒細胞釋放過多彈性蛋白酶及金屬蛋白酶，堿性環境增加基質金屬蛋白酶和中性粒細胞的彈性蛋白酶活性，增加正常組織和細胞因子的破壞，從而損傷創面的愈合；酸性的環境抑制中性粒細胞過度釋放蛋白酶和其破壞性的影響，將有利于慢性創面。大多數抗菌劑表現為pH依賴的抗菌活性，聚維酮碘在低pH時抗菌活性增強，而在高pH時抗菌活性明顯減弱[14]。直接或間接降低創面pH值的敷料有助于防止感染和可能更利于快速愈合。pH值降低,標準氧合血紅蛋白解離曲線向右移動，氧合血紅蛋白釋放更多的氧氣，從而改善創面愈合[17]。

3　生物膜的臨床治療措施

3.1清創術在慢性創面中，創面清創術主要是清除創面分泌物、壞死組織、生物膜，減少細菌在創面的負荷量，并促進中性粒細胞和巨噬細胞趨化到創面,從而有利于清除殘留于創面的細菌[18]。清創術是去除和破壞生物膜最有效的方式[19]；但在清創后菌落計數分析揭示細菌負荷量的降低是短時間的，在清創后48 h內，細菌負荷量幾乎恢復到初始水平,表明清創術只能短暫消除生物膜感染，如何防止清創后生物膜的再形成，需要其他治療的協助；在清除創面床深部的細菌生物膜時，要警惕清創術可能導致深層組織的感染[20]。

3.2抗菌藥物慢性創面中細菌生物膜難以清除的另一個原因是細菌生物膜對全身和局部抗菌藥物的耐藥。有研究表明，生物膜細菌耐受抗菌藥物濃度比其浮游狀態下高10～1 000倍[6,21]。生物膜的生長分黏附期、種植期、生長期、成熟期、播散期。在黏附期及播散期的浮游細菌，對各種抗菌藥物相對比較敏感，及時應用敏感、足量抗菌藥物可阻止或破壞生物膜的形成。Wolcott等[22]在研究新形成的細菌生物膜對抗菌藥物敏感性實驗中發現，在抗菌藥物治療的第一個24 h內生物膜對其敏感，48 h后生物膜變得越來越耐受，可能是早期生物膜未發育成熟，其致密的結構未完全形成，抗菌藥物能有效的滲透到生物膜的內部發揮殺菌作用，隨著時間推移，生物膜發育成熟，由于滲透限制，導致抗菌藥物在生物膜內達不到有效殺菌濃度。播散期及清創后生物膜釋放出來的浮游細菌，常常是造成臨床上常見的慢性感染急性發作及形成新的生物膜的重要原因，全身及局部使用抗菌藥物能夠抑制或殺滅生物膜釋放出的浮游細菌，從而控制慢性感染急性發作及新生物膜的形成。

3.3銀離子含銀離子抗菌劑是目前臨床治療慢性創面生物膜較為常用的敷料，其療效得到肯定。Valente等[18]在體外創面模型中，單獨使用銀離子敷料治療3 d，銀離子敷料覆蓋的金黃色葡萄球菌生物膜的細菌數量被降低超過100 000倍；使用銀離子敷料5 d減少了生物膜大多數細菌數量，表明銀離子敷料可抑制細菌生物膜的發展，認為活性銀離子能夠對細菌的細胞壁的許多結構組件和生化途徑產生毒性作用。Percival等[23]調查含銀離子創面敷料在銅綠假單胞菌、腸桿菌屬及金黃色葡萄球菌生物膜的療效時，發現生物膜暴露于銀離子敷料48 h后,生物膜內的細菌被全部殺死。Bjarnsholt等[24]研究銀離子對銅綠假單胞菌生物膜的療效時，發現5～10 mg/mL濃度磺胺嘧啶銀鹽能根除生物膜,但1 mg/mL的濃度沒有殺滅的效果。

3.4負壓封閉引流治療負壓封閉引流治療在治療慢性難愈合創面的作用逐漸得到共識，其主要機制是保持創面生理濕潤的愈合環境，減少細菌負荷，增加局部血流量和促進肉芽組織的形成。Valente等[18]在慢性創面的體外實驗中，聯合局部銀離子敷料和負壓封閉引流治療對生物膜的影響研究中發現，負壓封閉引流治療引起生物膜結構性變化,生物膜中結構性改變涉及到其對銀離子敏感性增加,同時應用銀離子敷料和負壓封閉引流治療生物膜的感染，生物膜中細菌數量顯著降低，銀離子敷料和負壓封閉引流治療聯合治療生物膜比單獨使用銀離子敷料抑制至少強10倍，證實負壓封閉引流治療與銀離子對治療生物膜有協同效果。

4　展　　望

隨著肥胖、慢性疾病、老齡人口的增加，慢性創面在臨床中患病率將越來越高。細菌生物膜對慢性創面炎癥細胞、實質細胞、炎癥因子、細胞因子及pH值造成不利影響，使創面出現持續低效應炎性反應，且停滯在炎性反應期，未能成功地進入增生性階段及再上皮化或重塑階段，從而導致創面延遲愈合。細菌生物膜作為慢性創面難以愈合的主要障礙之一，積極阻止生物膜的形成將有助于控制創面慢性化，有效清除生物膜將是未來治療慢性創面研究的熱點，如何阻斷生物膜引起慢性創面持續低效應的炎性反應，將可能有助于創面的愈合。

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牟天易(1987-)，在讀碩士，主要從事慢性創面研究?！?/p>

，E-mail:hgjian@sohu.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.07.043

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1671-8348(2016)07-0988-03

2015-09-02

2015-11-15)