褪黑激素對羊生殖活動調控的研究進展

蔣維東，石長青

（新疆塔里木大學動物科學學院，新疆阿拉爾市843300）

褪黑激素對羊生殖活動調控的研究進展

蔣維東，石長青*

（新疆塔里木大學動物科學學院，新疆阿拉爾市843300）

隨著分子生物學技術的發展，對于褪黑激素的研究日漸增多。研究發現，褪黑激素不僅是一種由松果體分泌的神經內分泌激素，而且在動物機體繁殖中的重要性也逐漸被人們認識。為了給褪黑激素的后續研究和在實踐生產中的應用提供參考，本文從國內外學者對褪黑激素的合成代謝、與光照的互作關系、對羊生殖活動的影響和應用的研究以及褪黑激素受體在羊生殖活動中的作用和調控的研究進展這四個方面進行綜述，說明褪黑激素及其受體在機體繁殖方面的重要性。

褪黑激素；內分泌；褪黑激素受體；生殖調控；生產應用

10.16863 /j.cnki.1003-6377.2016.05.001

褪黑激素(Melatonin,MLT)是一種帶有吲哚環的神經內分泌生物活性物質，主要由松果體分泌，在視網膜、紅細胞、血小板、腸嗜鉻細胞、副淚腺和外周單核細胞等也可合成分泌[1]。褪黑激素可與5-HT、多肽等生物活性物質一起參與和調控機體的生長、發育、成熟和衰老等生命過程，具有十分廣泛的生理作用。本文從MLT合成代謝、受體及其影響因素和MLT對羊生殖活動的影響及應用等方面，就近年來國內外的研究進展作一綜述，為MLT的后續研究及在生產中的應用提供參考。

1 MLT合成與代謝特點

MLT主要由松果體合成，其過程如下[2]：首先色氨酸在色氨酸羥化酶的作用下轉變成5-羥基色氨酸，然后在5-羥基色氨酸脫羧酶催化作用下生成5-羥色胺，最后在5-羥色胺-N-乙酰轉移酶（NAT）和羥基吲哚氧位甲基轉移酶（HIM-OT）的作用下轉變成MLT。MLT合成分泌后立即釋放入腦脊液、血液[3]，隨體液運輸到中樞神經系統與外周組織器官靶細胞膜上[4]與MLT受體相結合。

MLT的降解主要是在肝細胞中的肝微粒輕化酶作用下，生成6-羥基-N-乙?；?5-甲氧基色胺。其中，70％～80％[5]與硫酸根結合，5％與葡萄糖醛酸結合，以硫氧化MLT的形式從尿中排出，約1％的MLT可直接從尿中排出，另外的MLT可經去甲基途徑代謝[6]。

2 MLT分泌與光照的互作關系

研究發現，MLT的合成與分泌受光/暗周期信號[7]的調節：視網膜在受到光的刺激后,光信號依次傳導至視交叉上核（SCN）[8]、脊髓旁核（IML）、交感神經腎上腺皮質纖維、頸上神經節（SCG）、松果體后，由松果腺將光照信息轉化為內分泌信息輸出。根據光照的變化，交感神經末梢傳遞相應的內分泌信息，使松果腺細胞釋放去甲腎上腺素（NE），NE作用在松果腺細胞膜上的α和β-腎上腺素能受體，激活或者抑制NAT的活性，增加或者減少MLT含量[9]。由于受到外界光線的影響，它在松果體的合成與釋放中的節律性十分明顯，同時黑暗環境也會刺激松果體的分泌。光/暗周期信號的節律性變化與松果腺中酶活性節律性變化的同步化，使MLT合成與釋放的節律性十分明顯，具有晝夜規律性分泌的特點。但是，Vanecek（1988）研究發現，MLT的這種調節作用需要與其受體相結合后，才能發揮其生物學功能。

3 MLT受體在羊生殖活動中的作用及調控

3.1MLT受體的類型

MLT受體（MLTR）屬于膜受體，是G蛋白偶聯受體超家族的一員，總共包括7個跨膜段，由包含5’非翻譯區到第1個細胞內環的編碼區一個內含子和包含3’非翻譯區及剩余的編碼區的兩個外顯子構成（Weaver etal.1996）。哺乳動物中MLTR大多含有350個氨基酸殘基（Roca et al.1996），依其分布而分為膜受體和核受體（如一些核內孤兒受體）兩大類（Karasek et al.2003；Pandi-Perumal et al.2008）；根據與2-125I-MLT結合的藥理和動力學特性，可將MLTR分為高親和力的MLTR1受體和低親和力的MLTR2（MLT3）受體；根據分子生物學方法（包括DNA和氨基酸順序及蛋白質同源性）又將MLTR分為N端含有兩個糖基化位點、高親和力的MLTR1a型、N端僅含有一個糖基化位點的低親和力MLTR1b型和醌還原酶家族的MLTR1c 3個亞型（Reppert等，1994；Sethi等，2008）。三種亞型的同源性在60％～80％。通常，低濃度的MLT借助MLTR1a發揮作用，高濃度的MLT借助MLTR1b發揮作用（Celiaj etal.1991）。將MLTR分為MLTR1、MLTR2、MLTR3三種亞型是在1998年的IUPHAR會議上，其中MLTR1是哺乳動物中的主要亞型。

3.2影響MLTR表達的因素

研究發現，品種、光照對MLT受體的表達都有影響。

3.2.1 品種對MLTR表達的影響

汪運舟等（2011）采用DDRT-PCR技術研究發現MLTR雖然在處于發情期的多胎的濟寧青山羊與單胎的沂蒙黑山羊發情期卵巢組織中均有表達，但是前者的表達量顯著低于后者（P＜0.05），說明產羔數不同的品種卵巢中MLTR表達有差異，且發情期MLTR基因在卵巢組織中的高表達是限制山羊排卵和產羔數的重要因素之一。Vanecek等（1988）認為，哺乳動物MLTR的分布比較稀疏，非哺乳動物MLTR的分布則十分廣泛，而且存在種間差異。

3.2.2 光照對MLTR表達的影響

研究證明MLT存在明顯的晝夜節律，而且MLT需要與其受體結合才能夠發揮生物學效應。通過對MLT影響動物繁殖效應的研究，發現光照周期對MLT的表達與MLTR的分布和表達存在周期性的節律，且MLTR節律具有自主性。Piketty和Pelletier（1993）發現綿羊的垂體結節部/正中隆起中MLTR數量存在日周期性節律變化，從光到暗時最高，最低值出現在夜間結束時，日中值和午夜值則處于中間水平。但是，日周期下，MLTR得親和力并無顯著變化。

Barrett等（1989）證實，MLT可抑制綿羊PT細胞中MLTR1amRNA的合成與積累，并推測可能與MLT抑制cAMP合成有關（Morgan etal.，1989）。然而，Barrett等（1989）發現MLT并不完全消除MLTR1a mRNA水平，故此認為其可能只對轉錄效率有影響，而不能啟動轉錄過程。

日光照周期和年光照周期對綿羊MLTR存在節律性影響（Pelletier etal.1985)。雖然MLT與MLTR的親和力方面沒有明顯的日變化，但是在非繁殖季節，兩者最大結合量與PT部的MLTR1a數量均低于繁殖季節。王忻等[10]通過對非繁殖季節綿羊進行光照控制的研究中發現，光照長度能影響下丘腦中MLTR1a基因表達水平，且兩者存在顯著的負相關。

以上研究表明，日光照周期從光到暗與年光照周期中的短日照可提高垂體和下丘腦部位的MLTR1a表達水平。

3.3MLTR對羊生殖活動的調控

研究發現MLTR不僅存在于胚胎組織（Reppert et al.1995；MacKenzie etal.2002)、下丘腦和垂體（張勇等，2009；郭婷婷等，2010)，而且存在于視網膜、子宮基底膜、胃腸道、中樞神經系統[6]以及外周組織中（Helliwell etal.1994)。Mahle,etal.（1997)通過原位雜交試驗發現在雄性動物的附睪中也存在高親和力的MLTR1a型受體。Clemens etal.（2001)關于大鼠卵巢的研究揭示了激素可調節卵巢MLT高親和位點表達。張勇（2009)等利用RT-PCR技術研究了蒙古羊成年母羊卵巢組織中MLT受體，發現卵巢確實有MLT受體MLTR1a亞型的mRNA表達，這暗示著MLT可以通過與卵巢上的MLTR1a相結合，直接作用于卵巢，對綿羊的生殖功能產生直接的調節作用。

在綿羊MLTR1a的研究中，Messer等（1997)利用兩點連鎖分析和微衛星標記方法發現MLTR1a基因存在于綿羊26號染色體。同時，Barrett等（1997)從綿羊的cDNA文庫中分離出編碼MLTR1a的基因突變型，并將其命名為MLTR1aβ。研究發現在藥理學特性及生理學功能方面，MLTR1aβ受體與以前稱為MLTR1aα的受體基本相似。李廣錄等（2008)也通過對實驗研究發現綿羊品種出現了3種基因型：AA、AB、BB，且各基因型的構成與綿羊的品種有關[11]。說明了MLTR1a基因多態性的存在。

目前研究普遍證明，改變光照或補充MLT可影響機體特定部位MLTR1a基因的表達量[12～15]。但是，在季節性繁殖與MLTR1a基因多態性的相關性研究方面，Polletier等[16]Notter等[17]認為兩者之間具有明顯的相關性，而Migaud等[18]研究得到了兩者之間相關性不明顯的不同結論。為此，Messager等[19]進行了進一步驗證試驗，其結果與Migaud相似。由此推測：環境或品種可能對這種相關性有一定的影響，或者MLTR1a基因只是對季節性繁殖進行微調，產生主要作用的還有其他的基因?；贛LTR1b和MLTR1a基因結構非常相似[20]，也有些研究者認為MLTR1b基因也對繁殖季節具有一定的作用。

4 MLT對羊生殖活動的影響及應用

4.1MLT對生殖系統的抑制/促進作用

在機體生殖系統中，下丘腦-垂體-性腺軸（HPG)是控制動物機體性激素分泌的重要分支[21]。Lincoln和Maeda、Malpaux等發現只有將MLT微膠囊埋植于下丘腦的中間底側部和垂體結節部之后，才能導致機體LH分泌增加[22]，FSH、β-內啡肽水平升高[23]和影響PRL的分泌。后來研究發現，MLT主要通過選擇性抑制垂體促性腺細胞對GnRH的應答反應來影響機體性腺的分泌功能，參與機體的性成熟和生殖行為。

近年來研究發現，MLT可通過HPG[24]在下丘腦水平上調節GnRH的釋放，從而對性腺類固醇激素、FSH、松弛素、LH和抑制素的合成與釋放進行調控，進一步影響機體生殖系統功能。同時，也有研究發現，MLT還可與性腺上的受體相結合，對性腺激素的合成與分泌進行直接的調節[25]。使其濃度發生變化，從而實現對大腦、下丘腦和垂體的反饋調節。這說明MLT除了能通過影響下丘腦和垂體對促性腺激素的分泌而間接影響性腺之外，也能直接作用于性腺調節動物生殖。

國內外學者通過測定動物體內MLT的水平、補充外源性MLT或通過改變光照周期等多種方式研究發現：MLT對綿羊、山羊、鹿等短日照動物的生殖系統有促進作用，表現為經MLT處理后，機體LH和血漿孕酮水平均有提高，PRL水平降低，且能使羔羊提前性成熟和成年綿羊繁殖季節提前到來5周左右[26.27.28]。

4.2MLT對季節性發情的影響

綿羊是季節性發情動物，研究發現這種季節性繁殖活動受到MLT的調控[29]。近年來，人工MLT成功合成后，多采用人為改變光照與MLT埋植相結合的方法調節其繁殖的季節性。Kennaway發現夏季每天下午在飼料中添加MLT，可使綿羊發情期提前兩個月；Lincoln使用皮下埋植MLT緩釋植入物、Nowak和Rodway使用陰道內MLT緩釋器均使綿羊繁殖季節提前；法國科學家利用改變光照和埋入MLT相結合的方法，使母羊初情期提早出現,繁殖季節提前6個月。澳大利亞Genielkn公司研制出MLT制劑，通過皮下埋植可使綿羊繁殖季節提前6～7周。國內張海容等通過埋植褪黑素的實驗表明：實驗組中第一只母羊發情時間比對照組早30 d，發情率比對照組提高40個百分點。

4.3MLT機體繁殖性能的影響

MLT對繁殖性能的影響可以從對生殖細胞、排卵率、胚胎存活率和產羔率四個方面的影響來論述。

4.3.1 M LT對生殖細胞的影響

有研究表明MLT不僅對雄性動物睪丸組織細胞cAMP的合成[30]有影響，而且對雌性動物卵巢功能及體外狀態下黃體細胞和卵泡顆粒細胞[31]與甾類合成均有影響。夏銀等研究表明，通過控制光照影響MLT水平可使公羊初情期和精細胞生成活動提前，使其遺傳進化加快[32、33]。而且補充外源性MLT后，機體睪丸中單倍體與四倍體細胞的數量有明顯差異[34]。

4.3.2 MLT對排卵率的影響

Forcada等（1992）和Rondon等（1996）均研究發現，動物在繁殖季節具有較高的排卵率，而在非繁殖季節或者是繁殖季節的結束和開始階段排卵率較低。有研究報道埋植MLT能夠增加排卵率（Haresign，1992），而對同期化母羊進行MLT處理的相關研究認為：MLT處理不是通過改變卵泡發生的周期提高排卵率，而是通過減少中等卵泡和大卵泡的閉鎖增加了排卵卵泡的數量（Bister etal.1999）。然而，也有研究得出了相反的結論：無論是在繁殖季節（McEvoy etal.1998）和非繁殖季節（Forcada etal.2006）進行超數排卵時實施MLT處理均未明顯誘導排卵率的增加，認為少數FSH注射程序可能利用了所有卵泡相對獨立的閉鎖機制（McEvoy etal.1998）。無論是繁殖季節還是非繁殖季節，從屠宰羊的卵巢上分離得到的卵母細胞的數量和體外培養（IVM）的成熟率上都沒有差異（Rao etal.2002）。Luther et al.（2005）研究表明非繁殖季節對母羊進行MLT埋植沒有增加卵母細胞的數量和體外培養成熟率。Abecia et al.（2007）的研究表明MLT對非繁殖季節或繁殖季節從綿羊卵巢分離卵母細胞經體外成熟培養沒有提高其成熟率。

4.3.3 MLT對胚胎存活率和產羔率的影響

反芻動物妊娠的開始和維持建立于胚胎對母體系統的信號，母體對妊娠的識別已經被限定為早期妊娠期黃體的退化被阻止的過程。反芻動物黃體溶解機制包括子宮內膜產生的PGF2a和催產素的反饋調節系統。雌二醇和孕酮是子宮功能的主要調節物，二者通過它們的分子受體調節黃體溶解的時間（Meikle etal.2004）。另外，MLT影響黃體對孕酮的分泌已經在綿羊（Durotoye etal.1997）上得以報道，McEvoy et al.（1998）發現，無論給母羊是否進行MLT的處理，胚胎轉移、生存均沒有不同。但是，Haresign et al.（1992）和Chemineau et al.（1991）發現：非繁殖季節進行MLT處理能夠通過提高黃體的功能或降低黃體溶解蛋白機制而提高胚胎的存活率來提高產羔率。而Abecia et al.（2007）給三個品種羊（Rasa Aragonesa，Assaf and Merino）在產羔季節開始時埋植MLT的研究進一步表明：埋植MLT提高了非繁殖季節母羊超數排卵胚胎存活率，明顯降低了不能夠成活的胚胎細胞（退化的細胞和生長遲緩的細胞）的數量和比例。Scott et al.（2009）研究表明：在配種后的45 d～90 d埋植緩釋MLT表明自然繁殖季節外源性的緩釋MLT能夠提高19％的窩產仔數。

綜上所述，有關MLT對綿羊生殖活動的調節作用日益得到研究者的重視，而且在實際生產中得到應用，取得了一定的效果，但綿羊在季節性繁殖過程中MLT與MLTR的時空互作機制仍然需要進一步研究與探索。

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Research on Regulation of Sheep Reproduction with M elatonin

JIANGWei-dong，SHIChang-qing*（Institute of animal science,Tarim University,Alar Xinjiang 843300,China）

In recent years,with the developmentofmolecular biology,the research onmelatonin is increasing. It is found thatmelatonin is a neuroendocrine hormone secreted by the pineal gland,whose importance in animal reproduction is gradually being recognized.To provide reference for follow-up study on melatonin and its application in reproduction,this paper reviews the four aspects of relevant study both from home and abroad,including anabolism of melatonin,interaction with light,influence and application in sheep reproduction and the role and regulation of its receptor in sheep reproduction,and illustrates the importance ofmelatonin and its receptor in reproduction.

melatonin;endocrine;melatonin receptor;reproduction regulation;production application

S826

：A

：1003－6377（2016）05－0001-06

國家自然基金項目（31460597）；新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室開放課題（HS201401）；塔里木大學校長基金（TDZKCX201401）

蔣維東（1993-），男，碩士研究生，主要從事獸醫相關研究。E-mail：972240982@qq.com

石長青（1971-），男，四川人，碩士生導師，副教授，主要從事動物神經內分泌研究。E-mail：scq926@163.com

2016-04-12，

：2016-05-30