蓮心堿對氯化鋰—匹魯卡品致癲模型急性期皮層腦電圖的影響

吳　靖,周宏斌,潘松青

(1.襄陽市中心醫院神經內科,湖北 襄陽　441021；2.武漢大學人民醫院神經內科,湖北 武漢　430060)

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蓮心堿對氯化鋰—匹魯卡品致癲模型急性期皮層腦電圖的影響

吳靖1,周宏斌1,潘松青2

(1.襄陽市中心醫院神經內科,湖北 襄陽441021；2.武漢大學人民醫院神經內科,湖北 武漢430060)

摘要：目的探討蓮心堿對氯化鋰—匹魯卡品致癲大鼠模型急性期皮層腦電圖的影響。方法32只SD大鼠隨機分為生理鹽水對照組(A組,10 μg)、低劑量蓮心堿組(B組,蓮心堿2.5 g·L(-1),25 μg)、高劑量蓮心堿組(C組,蓮心堿5 g·L(-1),50 μg)、左乙拉西坦組(D組,100 g·L(-1),1 mg),建立氯化鋰—匹魯卡品癲癇大鼠模型后側腦室注射藥物,記錄各組大鼠腦電圖的改變。結果蓮心堿組及左乙拉西坦組與對照組相比大鼠的癇性放電頻率減低,快波(β波)比率減少,慢波(δ波)比率增加； 高劑量蓮心堿組和左乙拉西坦組相比無統計學差異。結論蓮心堿在氯化鋰—匹魯卡品癲癇大鼠模型急性期具有抗癲癇作用。

關鍵詞：癲癇；蓮心堿；氯化鋰；匹魯卡品；皮層腦電圖

癲癇是神經科的常見病、多發病,抗癲癇藥物能控制80%患者的發作,仍約有20%左右的癲癇對現有的藥物治療無效成為難治性癲癇[1],因此開發更高效的抗癲癇藥物是當前癲癇研究的熱點。目前抗癲癇藥物主要是以鈉離子通道、鈣離子通道、鉀離子通道、谷氨酸受體、 GABA 通路及中樞突觸囊泡前膜蛋白等為靶點[2],其中阻滯離子通道是重要的作用機制之一[3]。蓮心堿(liensinine)是一種從中藥蓮子心中提出的雙芐基異哇琳單醚鍵型生物堿,大量研究證實其對Na+、K+、Ca2+的跨膜轉運具有抑制作用[4],亦有實驗證實蓮心堿能抑制青霉素致癇大鼠皮層腦電圖癲癇樣放電[5]。本實驗通過觀察蓮心堿對氯化鋰—匹魯卡品致癲大鼠皮層腦電圖的影響,進一步研究蓮心堿的抗癲癇作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物清潔級健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠32只,實驗起始體質量(210±30)g,由華中科技大學同濟實驗動物中心提供,許可證號：SCXK(鄂)2004-0007。

1.1.2藥品及儀器 匹魯卡品(pilocarpine,Pilo)購自美國FLUKA公司；氯化鋰(lithium chloride,LiCl2)購自武漢亦新生物技術有限公司；硫酸阿托品購自蕪湖康奇制藥有限公司；蓮心堿由武漢李時珍藥業公司制備(武漢大學人民醫院藥學部提供原料,純度≥98%)；烏拉坦購自國藥集團化學試劑有限公司。

RM6240生物信號采集處理系統(成都儀器廠生產)；江灣Ⅱ型立體定向儀(第二軍醫大學器材處)；微量進樣器(上海安亭微量進樣器廠)；不銹鋼套管針(武漢大學生理教研室提供)。

1.2方法

1.2.1癲癇動物模型制作經腹腔注射氯化鋰(0.125 g·kg-1),18～24 h后注射硫酸阿托品(1 mg·kg-1),30 min后再腹腔注射匹魯卡品(100 mg·kg-1)。根據Racine(1972)發作分級標準[6]達到Ⅳ～Ⅴ級發作0.5 h視為模型建立成功。

1.2.2側腦室置管及腦電圖描記模型建立成功后大鼠腹腔注射烏拉坦麻醉,固定于腦立體定位儀上。沿大鼠正中矢狀線切開皮膚,暴露顱骨及前后囟,剝離骨膜。根據George Paxions圖譜,坐標為前囟后1 mm,中線左側1.5 mm,深度4 mm,定位左側腦室,置入套管針備用。在前囟后6.3 mm,中線左右各旁開4.3 mm；人字縫后2 mm正中,用牙鉆鉆孔至硬腦膜,安置三個皮層電極,與RM6240生物信號采集處理系統連接。記錄參數為紙速400 ms/div,靈敏度500 μV·mm-1,濾波100 Hz,時間常數0.02 s。

1.2.3動物分組及處理32只大鼠(實驗共使用SD大鼠35只,32只模型成功)隨機分為生理鹽水對照組(A組)、低劑量蓮心堿組(B組)、高劑量蓮心堿組(C組)、左乙拉西坦組(D),每組各8只。各組記錄皮層腦電圖30 min后使用微量進樣器經套管針分別緩慢注射生理鹽水(10 μL),低劑量蓮心堿(2.5 g·L-1,10 μL),高劑量蓮心堿(5 g·L-1,10 μL),左乙拉西坦(100 g·L-1,10 μL),繼續記錄150 min。比較單位時間癲癇樣放電頻率的變化以及對腦波頻段分布的影響。

2結果

2.1正常大鼠皮層腦電圖和氯化鋰—匹魯卡品致癲大鼠皮層腦電圖 正常大鼠皮層腦電圖以α、θ波為主要波形,波幅小于75 μV。氯化鋰—匹魯卡品致癲大鼠皮層腦電圖表現為成簇性發放的棘波、尖波節律以及棘—慢、 尖—慢復合波等多種形式的癲癇樣放電(波幅100～1 000 μV,見圖 1)。

正常大鼠腦電圖氯化鋰—匹魯卡品致癲大鼠模型皮層腦電圖

圖 1大鼠皮層腦電圖

2.2各組大鼠腦電圖癲癇樣放電的變化 選用各組大鼠注射前30 min腦電圖癇樣放電與同組大鼠注射后每30 min進行比較。生理鹽水對照組皮層腦電圖呈成簇性發放的棘波、尖波節律,并可見棘—慢及尖—慢復合波等多種形式的癲癇樣放電(波幅100～1 000 μV),注射前后癇樣放電頻率無明顯變化。低劑量蓮心堿組、高劑量蓮心堿組和左乙拉西坦組皮層腦電圖可見棘波、尖波、棘—慢綜合波、尖—慢綜合波等癇樣放電頻率較注射前明顯降低(圖2,表1)。

生理鹽水對照組　　　　　　　　　　　　　　　　　　　低劑量蓮心堿組

高劑量蓮心堿組　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　左乙拉西坦組

組別給藥前30min給藥后/min0～3030～6060～9090～120120～150生理鹽水組7910±12577981±16027793±16797439±19197178±18677578±1935低劑量蓮心堿組8327±17737468±24416982±29065836±26674955±23934700±2018*高劑量蓮心堿組7748±10156909±13714833±15833792±16383486±17052633±1353左乙拉西坦組7489±11095570±14714207±19603733±16693671±16983399±1579

注：與同組前30 min比較,*P<0.01。

對各組癇樣放電的頻率變化進行組間對照,高劑量蓮心堿組及左乙拉西坦組與對照組相比有統計學差異(P<0.05),高劑量蓮心堿組與左乙拉西坦組之間無統計學差異(P=0.513)。

2.3各組大鼠腦電圖頻段分布的變化 選用各組大鼠注射前30 min腦電圖各腦波的頻段分布與同組大鼠注射后每30 min腦波頻段分布進行比較。生理鹽水對照組皮層腦電圖以α、θ頻段為主,其中以θ波頻段所占比率最大,注射前后皮層腦電圖各頻段分布無明顯變化。低劑量蓮心堿組、高劑量蓮心堿組和左乙拉西坦組藥物注射后快波(α、β波)頻段所占比率減少(P<0.05),慢波(θ、δ波)頻段所占比率增加(P<0.05)(表2)。

3討論

癲癇是一組由腦神經元反復發作的異常放電所引起的以中樞神經系統短暫性功能失常為特征的慢性腦部疾病。其發病機制非常復雜,目前較一致的觀點是癲癇系中樞神經系統興奮與抑制不平衡所致,而這種不平衡主要與離子通道、突觸傳遞及神經膠質細胞等等的功能和結構改變有關。近年的研究發現電壓依賴性鈉通道1亞基(SCN 1A )基因突變與熱性驚厥相關癲癇或癲癇伴熱性驚厥附加癥(EFS+),尤其伴失神、肌陣攣或者失張力性等全面發作為主的全面性癲癇伴熱性驚厥附加癥(GEFS+)、相關性顳葉癲癇、部分性癲癇伴熱性驚厥附加癥(PEFS+)和嬰兒重癥肌陣攣性癲癇(Dravet綜合征)的關系密切,突變造成的鈉通道功能障礙是其可能的發病機制[7-9],進一步證實了離子通道結構和功能的變化與癲癇發病的相關性。

作為一種從中藥蓮子心中提取出的雙芐基異哇琳單醚鍵型生物堿,蓮心堿能影響心肌慢反應動作電位及慢內向電流,降低離體兔竇房結(SAN)起搏細胞慢反應動作電位幅度(APA)及零相最大上升速率 (Vmax),延長竇性周長(SCL)；能明顯拮抗Bayk8644增大SAN起搏細胞及高K+誘發的豚鼠乳頭肌慢反應動作電位的APA和Vmax作用,抑制犬浦肯野氏纖維慢向內流；蓮心堿還能對抗乙酰膽堿縮短動作電位時程的作用,提示蓮心堿對Na+、K+、Ca2+的跨膜轉運具有抑制作用[4]。鑒于這些基礎,我們通過實驗探討蓮心堿對癲癇的作用。

±s,n=8)

注：與同組給藥前30 min比較，#P<0.05。

左乙拉西坦是一種新型的抗癲癇藥物,2005年美國食品藥品監督局(FDA)審批通過其片劑和口服液制劑適合應用4歲以上兒童和青少年的癲癇初次發作的聯合藥物治療,2007年通過我國的審批廣泛應用于臨床診療工作,取得的較好的療效[10]。研究發現左乙拉西坦能顯著縮短除最大電休克模型及戊四氮模型以外幾乎所有癲癇動物模型癲癇發作的時程,降低其癇性放電的頻率[11-12]。其中匹魯卡品動物模型建立前腹腔注射左乙拉西坦可以使癇樣放電的潛伏期延長；可以抑制53%的癇樣放電,減少58%的癲癇持續狀態發生；可以使模型死亡潛伏期延長116%,死亡率降低61%；同時能顯著延緩海馬皮質的同步化癇性放電[13-14]。而每日胃腸道給左乙拉西坦,2周后匹魯卡品模型癇樣放電亦較處理前顯著減低[15]。所以實驗中我們選用左乙拉西坦作為陽性對照,評價蓮心堿在匹魯卡品模型中的抗癲癇作用。

本實驗于匹魯卡品癲癇模型建立后隨即側腦室注射蓮心堿,結果顯示注射后模型大鼠皮層腦電圖癇樣放電頻率明顯下降。其中低劑量蓮心堿組注射后60 min癇樣放電頻率即有下降,以每15 min為單位進行分析,60～75 min下降有統計學意義(P<0.05),75～90 min下降有顯著統計學意義(P<0.01)；高劑量蓮心堿組注射30 min后放電頻率開始下降,30～45 min下降有統計學意義(P<0.05),45～60 min下降有顯著統計學意義(P<0.01)；左乙拉西坦組癇樣放電頻率在注射后即開始下降；生理鹽水對照組注射后癇樣放電則無明顯變化。我們進一步組間比較后發現高劑量蓮心堿組與左乙拉西坦組對模型大鼠腦電圖癇樣放電頻率的影響無統計學差異(P=0.513)。此結果表明蓮心堿可以抑制匹魯卡品大鼠模型的癇樣放電,功效與左乙拉西坦相當,并在一定范圍內呈量效相關性。

實驗同時顯示與藥物注射前30 min模型大鼠腦電圖的腦波頻段分配相比,蓮心堿組及左乙拉西坦組藥物注射后都出現腦電圖β波頻段所占比率明顯下降,而生理鹽水組無明顯變化。匹魯卡品癲癇模型急性期腦電圖癲癇樣放電以成簇的棘波節律為主,而棘波在腦電頻段分布中屬于β波范疇。此結果提示蓮心堿對腦電圖腦波頻段分配的影響與對癲癇樣放電頻率的影響一致,從而在腦波頻段分配上也證明蓮心堿可以抑制匹魯卡品癲癇模型的癇樣放電。

目前人類對癲癇發病機制的研究主要依靠動物實驗,癲癇產生機制的探討和最新進展亦多直接或間接來于動物模型研究[16]。匹魯卡品癲癇模型是一種符合人類癲癇發生發展特征的癲癇模型,呈典型的3期表現：一期表現為癲癇持續狀態的急性期(持續6～24 h),EEG表現連續高波幅、高頻率的棘波、棘慢波發放；二期表現為行為與EEG均正常的靜止期(持續平均14 d)；三期為表現自發性、反復性發作的慢性期,EEG可見突出于平坦背景波的周期性癲癇樣放電。同時病理學研究證實匹魯卡品能誘發海馬區神經元死亡及苔蘚出芽,因此氯化鋰—匹魯卡品致模型既可用于急性癲癇持續狀態模型的研究,又是理想的慢性顳葉癲癇模型[17]。我們的實驗結果證實蓮心堿作為一種對離子通道有明確阻滯作用的藥物,在氯化鋰—匹魯卡品癲癇大鼠模型急性期對癲癇樣放電具有抑制作用,作用與左乙拉西坦相當。由此我們推斷蓮心堿是一種潛在的具有抗癲癇持續狀態及抗顳葉癲癇作用的藥物,其作用機制可能與阻滯離子通道從而減少腦神經元的異常放電有關,其具體途徑有待于進一步研究。

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Effect of liensinine on electrocorticogram in lithium-pilocarpine induced acute epilepsy rats

WU Jing1,ZHOU Hong-bing1,PAN Song-qing2

(1.DepartmentofNeurology,XiangyangCentralHospital,Xiangyang,Hubei441021,China；2.DepartmentofNeurology,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan,Hubei430060,China)

Abstract：ObjectiveTo explore the effect of liensinine on electrocorticogram in lithium-pilocarpine induced acute epilepsy rats.MethodsThirty-two SD rats were randomized into four groups (8 rats in each group):epilepsy model group(group A,10 μg),low dose of liensinine group(group B,2.5 g·L(-1),25 μg),high dose ofliensinine group(group C,5 g·L(-1),50 μg),levetiracetam group (group D,100 g·L(-1),1 mg).Electrocorticogram of rats was recorded after lithium-pilocarpine model was induced and the drug wasintra-cerebroventricular injected.ResultsCompared with group A,the epileptic discharge was significantly decreased in groups B,C and D (P<0.05).The proportion of δ slow wave was enhanced,meanwhile β fast wave was decreased in groups B,C and D.And there was no significant difference between high dose of liensinine group and levetiracetam group.ConclusionsLiensinine has the role of anti-epilepsy in acute model of epileptic rats induced by lithium-pilocarpine.

Key words：epilepsy;liensinine;lithium;pilocarpine;electrocorticogram

(收稿日期:2015-08-21,修回日期：2015-10-09)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.03.011

通信作者：潘松青,男,主任醫師,碩士生導師,研究方向:癲癇及神經電生理,E-mail：p.s.q.@medmail.com.cn