水稻劍葉角度qFla-8-2位點的精細定位

朱長豐　梁利君　曾思遠　李天偉　董冠杉　洪德林

(南京農業大學 作物遺傳與種質創新國家重點實驗室，南京 210095；*通訊聯系人，E-mail: delinhong@njau.edu.cn)

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水稻劍葉角度qFla-8-2位點的精細定位

朱長豐梁利君曾思遠李天偉董冠杉洪德林*

(南京農業大學 作物遺傳與種質創新國家重點實驗室，南京 210095；*通訊聯系人，E-mail: delinhong@njau.edu.cn)

朱長豐, 梁利君, 曾思遠, 等.水稻劍葉角度qFla-8-2位點的精細定位. 中國水稻科學， 2016， 30(1)： 27-34.

摘要:為更好地理解水稻大劍葉角的分子遺傳機制，對已初定位的控制劍葉角度的qFla-8進行精細定位和候選基因預測。利用以863B為受體親本、A7444為供體親本衍生的BC3F3群體中僅在目標基因區段雜合的172個單株自交構建的次級分離群體，對qFla-8所在的RM6215-RM8265區間9個SSR標記的基因型進行鑒定，結合表型數據進一步縮短qFla-8所在染色體區段。結果發現qFla-8位點所在染色體區段存在兩個緊密連鎖的位點qFla-8-1和qFla-8-2。其中，qFla-8-1位于RM6215和RM3153之間，可解釋22.33%的表型變異；qFla-8-2位于RM1309和RM3491之間，可解釋23.81%的表型變異。進一步對加性效應較大的qFla-8-2精細定位，通過開發插入缺失(InDel)分子標記，將qFla-8-2位點限定于InDel標記Z7和SSR標記RM23071之間，該區間的物理距離為67 kb。該區段包含3個預測基因Os08g0408200,Os08g0408300和Os08g0408500，分別編碼功能類似GAMYB的WD40結構域蛋白、假定蛋白以及類APETALA2蛋白。

關鍵詞:水稻； 劍葉角度； QTL； 精細定位

水稻劍葉角度是指劍葉與穗頸之間的夾角，是水稻株型的重要組成因素之一。在水稻生產上，一般認為劍葉角度小的直立型葉可以提高光合能力，增加籽粒充實度，對提高產量有利[1]。但在雜交稻制種過程中，需要人工趕粉提高不育系的異交結實率，劍葉角度小的上舉葉不利于田間不育系輔助授粉[2]。為此，在雜交稻制種過程中要將不育系的劍葉頂部1/3或1/2割去。該環節不僅勞動強度大，而且需要較高的操作技術，否則會割到正在抽出的幼穗。同時，割葉造成的傷口對水稻植株的正常生長亦有不利影響。因此，培育出水稻大劍葉角度(≥90°)的不育系，既可免去制種田人工割葉，又可為加快實現雜交稻制種全程機械化提供便利。

經典遺傳學研究表明，水稻的劍葉角度受一對主基因和多對微效基因控制，小角對大角有部分顯性作用[3]。迄今為止，利用分子標記已鑒定出57個與劍葉角度相關的QTL，分布于水稻第10染色體之外的11條染色體上。第1至第9染色體上分別有9、6、6、4、6、6、6、4、4個，第11和12染色體上各有3個，這些QTL的貢獻率為4.49%～14.60%[4-12]。汪得凱等[13]從T-DNA插入轉基因株系的水稻突變體庫中分離得到一個所有葉角增大的突變體lla，并克隆了控制大葉角性狀的基因OsWRKY11。然而，除文獻[10]和[12]外，上述這些研究所使用的雙親(或突變體與野生型)之間的劍葉角度差異較小(7.58°～42.75°)，劍葉仍是上舉的，不適于雜交稻制種中大劍葉角度不育系的培育。此外，成株期所有葉角偏大的植株可能不利于光合作用。

汪得凱等[13]和金偉棟等[14]在研究太湖流域粳稻地方品種資源多樣性的過程中，發現了一個具有特大劍葉角度(約150°)的粳稻品種A7444，表現為劍葉下伸，其余葉片均上舉，年度間性狀穩定[14-15]。利用863B/A7444//863B組合的BC1F1群體，檢測出4個控制劍葉角度的QTL[12]。根據初定位結果，利用分子標記輔助選擇(MAS)技術構建了以863B為遺傳背景、包含A7444qFla-2和qFla-8位點染色體片段近等基因系在內的回交重組自交系群體[16]。本研究的目的是：1)精細定位qFla-8，提供與其緊密連鎖的兩側標記，為通過MAS改良不育系的劍葉角度服務；2)篩選候選基因，為大劍葉角度等位基因的克隆、功能分析以及最終闡明這一農藝性狀的遺傳代謝機理奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料為小劍葉角度的粳稻保持系863B、大劍葉角度的太湖粳糯稻地方品種A7444，以及863B為受體親本、A7444為供體親本衍生的BC3F3群體目標基因區段雜合的單株自交產生的次級分離群體。863B是江蘇省雜交粳稻審定組合86優8號(蘇種審字第363號)的保持系，從孕穗到成熟劍葉角度變幅為10°～30°(圖1-A～C的左側)，A7444是在823份太湖水稻地方品種資源中發現的粳糯稻品種，從孕穗到成熟劍葉角度變幅為120°～160°(圖1-A～C的右側)。

1.2田間種植與目標單株鑒定

863B、A7444和863B/A7444//863B組合的BC3F3群體的84個株系于2013年5月10日播種，6月11日移栽。863B和A7444各栽10行，84個株系各栽3行，每行8株。分蘗期利用SSR分子標記鑒定84個株系中各單株的標記基因型，從中篩選出僅在RM6215-RM8265區間段標記基因型分離的8個株系用于進一步定位。根據進一步定位結果，鑒定目標染色體區段雜合而其余區段均純合的863B基因型的大劍葉角度單株(圖1-C， CF14-3)。成熟期收獲68個目標單株的自交種子(次級F2種子)。次級F2分離群體于2014年5月12日播種，6月16日移栽。次級 F2分離群體正常生長發育株數為4539。所有供試材料均種植于南京農業大學江浦試驗站水稻試驗田。單本栽插，株距16.7 cm，行距20.0 cm。常規田間管理。

1.3性狀調查

劍葉角度測量方法：始穗期選取目標單株的主莖穗(最高穗)，用量角器測量水稻劍葉葉片與穗軸之間的夾角(圖2)。863B和A7444各測量10株，以10株的平均值作為表型觀察值；分離群體以單株測量值作為表型觀察值。

1.4DNA提取和PCR擴增

DNA提取采用Dellaporta等[17]的方法。

PCR擴增采用10 μL反應體系：DNA工作液1.0 μL，引物(2 pmol/μL)0.7 μL，10×緩沖液(無 MgCl2)1.0 μL，dNTP(2.5 mmol/L)0.2 μL，MgCl2(25 mmol/L)0.6 μL，Taq酶(5 U/μL)0.1 μL，ddH2O 6.4 μL。PCR反應程序如下：95°C下預變性5 min；95°C下變性30 s，50°C～65°C退火30 s，72°C下延長1 min，32個循環；最后72°C下延伸7 min。

電泳后的聚丙烯酰胺凝膠先用固定液(10%的酒精，0.5%的冰乙酸)固定10 min，ddH2O清洗兩次；再用0.2%的AgNO3溶液染色10 min，ddH2O清洗兩次；最后加入顯色液(1.5%的NaOH溶液，1%的甲醛)顯色，條帶清晰后終止顯色反應，用數碼相機拍照并記錄實驗結果。

1.5SSR標記篩選和InDel標記開發

SSR標記篩選：在公布的微衛星數據庫(http://www.gramene.org/microsat)中查找初定位RM6215-RM8265區間中的引物。

A-863B(左)和A7444(右)孕穗期的劍葉角度，bar=5 cm； B-863B(左)和A7444(右)灌漿期的劍葉角度，bar=10 cm； C-863B(左)、CF14-3(中,863B近等基因系)和A7444(右)成熟期的劍葉角度，bar=10 cm。白色箭頭指的是劍葉角度。

A, Flag leaf angle of 863B (left) and A7444 (right) at the booting stage, bar=5 cm; B, Flag leaf angle of 863B (left) and A7444 (right) at the filling stage, bar=10 cm; C, Flag leaf angle of 863B (left), CF14-3 (middle， NIL of 863B) and A7444 (right) at the mature stage, bar=10 cm. Flag leaf angle was showed by the white arrows.

圖1863B和A7444不同生育期的劍葉角度

Fig. 1. Flag leaf angle of 863B and A7444 at different growth stages.

圖2水稻劍葉角度測量方法(左)及863B和A7444灌漿期劍葉角度(右)

Fig. 2. Measuring method (left) of flag leaf angle and the flag leaf angle of 863B and A7444 at the filling stage (right).

InDel標記開發：比較日本晴和9311基因組的序列差異，在插入或缺失大于10 bp的位點處使用NCBI的在線Primer BLAST程序設計相應的InDel引物(擴增產物大小為100～300 bp)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

SSR引物和InDel引物均由金斯瑞生物科技有限公司(南京)合成。

1.6目標區段縮短和候選基因預測

在BC3F3群體中選擇僅qFla-8所在區間(RM6215-RM8265)標記基因型分離的8個株系共172個單株組成了一個小定位群體(POP1, 次級F2群休4539株中的一部分)。根據POP1群體的目標區段9個分子標記信息，利用IciMapping version 4.0軟件(www.isbreeding.net/)中的MAP程序構建區段遺傳圖譜；然后結合POP1群體的劍葉角度表型數據，采用IciMapping version 4.0軟件中的完備復合區間作圖法進行QTL定位，用以縮短qFla-8位點所在染色體區段。QTL檢測時，以3.0為LOD閾值，當估算得到的LOD值高于LOD閾值時即認為在該位置處存在一個QTL，并估算相應的加性效應和貢獻率。

表1縮短qFla-8所在區間用到的SSR引物

Table 1. SSR primers used for further narrowing qFla-8 region.

引物名稱Primername正向引物(5'-3')Forwardprimer(5'-3')反向引物(5'-3')Reverseprimer(5'-3')產物長度Productionlength/bpRM23021CTCAATGATGTTCTCGGCTTCCGCCACAACGGTCAAGTAAAGAGC200RM6215TTCAGCAGAGAGATGACGCAAGGGTACAAACCAGCCCTCCGAGACG190RM3153GTGTGATGGTGACGGATTACATGTGCCATGCTGCAGAATTTCCATGTTGG402RM3689CGTCAGCCGAAACTACTATCTAAACCGTTTCACTGCACTCTGGTTTGC293RM1309GAGGACACTGACGACAGCTTGGCGCGCAAATCATTAAGTTCAGG186RM3491GTGTTCTGATGTTCCCTCTCTGCCCAACAAGGACTCACATGTCTCG120RM8264TTCTACGGAATTTCTCCCTCTGGCTAATCAATCTCTCGCGTTCTTGG162RM8265TCGGCTGATCTGACCGTACATCCGTGCATGCAACCACCTCTTGG185RM5808GGGAGTAGGAGGGAGGGAGAAAGAGGCAGAACCAGCGAGGGAAACACC112

在對目標區間進行標記加密后，根據目標基因位點與分子標記之間重組體單株數目，最終確定與目標基因位點緊密連鎖的兩側分子標記。通過查找NCBI數據庫，將兩側分子標記錨定于日本晴的具體染色體基因組位置，進而預測候選基因。

2結果與分析

2.1qFla-8所在染色體區段存在兩個緊密連鎖的位點

利用POP1群體進一步縮小控制劍葉角度qFla-8的標記區間。為了確保qFla-8位點在檢測區間中，對完全包含RM6215-RM8265區間的RM23021-RM5808區間進行標記加密，利用較均勻分布在此區間的29對SSR引物對863B和A7444進行多態性檢測，其中5對SSR引物在親本之間具有多態性，與RM23021、RM6215、RM8265和RM5808共9對標記被用于qFla-8位點的進一步分析。引物篩選結果如表1所示。

黑色箭頭表示qFla-8所在位置。

The black arrow indicatesqFla-8.

圖3第8染色體上qFla-8的遺傳解析

Fig. 3. Genetic analysis of qFla-8 on chromosome 8.

利用這9對SSR標記分析POP1群體的172個單株，發現在qFla-8位點所在染色體區段內存在兩個緊密連鎖的位點(圖3)，分別命名為qFla-8-1和qFla-8-2。qFla-8-1位于SSR標記RM6215和RM3153之間，可解釋22.33%的表型變異，增效等位基因來源于863B；qFla-8-2位于SSR標記RM1309和RM3491之間，可解釋23.81%的表型變異，增效等位基因來源于A7444。qFla-8-1所在區間段的物理距離是76 kb，qFla-8-2所在區間段的物理距離是460 kb。

2.2qFla-8-2的遺傳分析和精細定位

從qFla-8-2 單位點分離群體(4539株)中選取438株具有極大劍葉角度的單株(≥90°)，利用qFla-8-2的兩側標記RM1309和RM3491分析這438個單株的標記基因型，在這兩個標記處共篩選到21個重組體單株，其中RM1309和qFla-8-2之間有13個重組體單株，而RM3491和qFla-8-2之間有8個重組體單株。進一步對RM1309-RM3491區間進行標記加密，通過查詢SSR引物數據庫，發現該區間存在12對SSR引物(引物名稱及序列未列出)，其中僅有2對SSR引物在863B和A7444間呈現多態；為此新開發了35對InDel引物，同樣只有2對在親本間有多態(表2)。利用這4個標記分別對21個重組體單株進行分析，結果表明RM23065和qFla-8-2之間有12個交換，Z5和qFla-8-2之間有9個交換，Z7和qFla-8-2之間有5個交換，RM23071和qFla-8-2之間有4個交換。因此，qFla-8-2位點被限定在InDel標記Z7和SSR標記RM23071之間，其間物理距離為67 kb(圖5-A)。

圖4單位點qFla-8-2 F2分離群體163個單株的劍葉角度分布

Fig. 4. Frequency distributions of the flag leaf angle of 163 plants in F2segregating generation of qFla-8-2 locus.

2.3 67 kb區間候選基因

基于日本晴序列的基因組注釋數據庫(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的序列預測信息，在精細定位的67 kb基因組區間內共包含3個候選基因，分別是Os08g0408200，Os08g0408300和Os08g0408500(圖5-B)。其中，Os08g0408200含有10個外顯子，編碼功能類似于GAMYB蛋白的WD40結構域蛋白，在植物生長發育以及細胞信號轉導方面具有重要作用；Os08g0408300含有1個外顯子，編碼一種假定蛋白；Os08g0408500含有1個外顯子，編碼APETALA2-like protein，在植物的抗逆性方面發揮重要作用。初步認為Os08g0408200是大劍葉角度候選基因。

表2精細定位qFla-8-2所用SSR和InDel標記

Table 2. SSR and InDel markers used for fine mapping of qFla-8-2.

引物名稱Primername正向引物(5'-3')Forwardprimer(5'-3')反向引物(5'-3')Reverseprimer(5'-3')產物長度Productionlength/bpRM1309GAGGACACTGACGACAGCTTGGCGCGCAAATCATTAAGTTCAGG189RM23065CCACGAACTCTCCCTATATCTACTGCCGTGCACACCTGAAGAGTATGG135RM23071GTTCCGCCGTTGAGTGATGACCTCCTCAGTCCTCCCTCTCCTTCC287Z5GTCAAATCAGCTGGTTCAGTGATTTGACCTAACGATTGCGA200Z7ATCCACGTCACCCACAACTCCCCACGGAAAACCAAAACAT102RM3491GTGTTCTGATGTTCCCTCTCTGCCCAACAAGGACTCACATGTCTCG266

A-利用438個單株的作圖群體對qFla-8-2基因進行的精細定位。黑色水平線下面的數字表示標記與基因之間的交換單株數。B-qFla-8-2基因最終被縮到67 kb的DNA區段上。粗黑色箭頭代表的是預測基因。

A, Fine mapping ofqFla-8-2 genome region using mapping population with 438 plants. Numbers below the black horizontal line represent the numbers of recombinants between the marker and gene. B,qFla-8-2 was finally narrowed to a 67 kb DNA fragment. The thick black arrows mean predicted genes.

圖5qFla-8-2的圖位克隆

Fig. 5. Map-based cloning of qFla-8-2.

3討論

3.1與前人研究成果的比較

通過QTL分析將劍葉角度基因qFla-8-2定位于第8染色體長臂靠近著絲點的位置，在InDel標記Z7和SSR標記RM23071之間67 kb的區段上，所在區間的物理圖譜為19,579,753 bp～19,644,684 bp。第8染色體上曾報道過3個與劍葉角度相關的QTL，分別位于RM4085-RM1111區間、XNpb187-XNpb56區間和CT195-G1073區間[6,8-9]。第一個標記區間位于第8染色體短臂上，相應的物理圖譜為4,472,206 bp～4,772,713 bp；后兩個標記區間則位于第8染色體長臂上，相應的物理圖譜分別是22,469,139 bp～26,383,574 bp和20,677,675 bp～20,740,799 bp。這3個區間段均沒有出現和本研究定位的QTL區段相互交叉的部分，說明qFla-8-2是一個新的控制劍葉角度的基因。

3.2大劍葉角度基因在育種中的應用

將性狀作為形態學標記應用于育種中早有報道。如白化轉綠突變體ysa成熟后其株高、分蘗數、有效穗長度、結實率等主要農藝性狀與野生型沒有明顯差異，將該白化轉綠性狀應用到雄性不育系中作為葉色標記，在苗期就可以剔除假的雄性不育株[18]。曹立勇等[19]將葉色標記與不育系相結合，成功培育出中紫S。目前，借助于不斷發展的分子標記輔助選擇技術，國內外不少研究者開展了水稻劍葉的研究，越來越多的劍葉角度QTL被鑒定出來。但大多數的QTL所控制的劍葉角度都很小，難以應用于雜交稻制種中。本研究的qFla-8-2控制的劍葉角度在苗期、分蘗期與野生型相比并沒有表現出典型特征，但從孕穗期開始表現出劍葉下伸。利用與大劍葉角度性狀緊密連鎖的分子標記進行鑒定，通過回交選育出大劍葉角度的保持系，繼而通過回交轉育為大劍葉角度的不育系，繁殖制種過程中可以免去割葉的程序，不僅節省繁殖制種勞力成本，而且有利于實現機械化制種，提高效率。由于qFla-8-2位點是隱性，只要制種父本是小劍葉角度，配制的雜種一代的植株劍葉將是上伸的，理論上不會影響雜種一代優勢的發揮，但可能會影響保持系的繁殖產量。

3.3葉角的遺傳機理

目前，已報道的關于葉角突變的遺傳機理主要與激素的生物合成或信號轉導有關，相關機理可分為以下三種：一是葉枕近軸端處的細胞延長。如d2突變體，為D2基因缺失型突變體。D2基因編碼一種細胞色素P450蛋白，該蛋白屬于CYP90超級家族，和擬南芥中參與油菜素內酯合成酶的CPD蛋白具有高度同源性，類似于BR合成酶的作用。通過調控BR的生物合成，增加了葉枕近軸端的細胞長度，使葉角度增大[20]。另一基因ILI1通過過表達功能類似擬南芥PRE1蛋白的一種HLH蛋白，增加了葉枕近軸端處的細胞長度，促進葉片向下彎曲[21]。二是增加葉枕近軸端處的細胞分裂。如位于第2染色體上的lc2基因，通過促進與細胞分裂相關基因的表達，使葉枕近軸端處的細胞快速分裂，從而增大了葉片角度[22]。三是降低葉枕處的機械組織強度。如ila1基因，該基因的表達抑制了細胞分裂素的形成，導致葉枕部位機械組織變小，細胞壁主要成分纖維素和木聚糖的含量下降，葉枕處機械強度下降，導致葉夾角增大[23]。本研究通過精細定位，將控制劍葉角度的qFla-8-2限定于第8染色體InDel標記Z7和SSR標記RM23071之間67 kb的區段上，該區間包含3個預測基因，分別是Os08g0408200,Os08g0408300和Os08g0408500?；蚬δ茏⑨尡砻?，Os08g0408200基因編碼一種WD40結構域蛋白，該蛋白和赤霉素(GA)的轉錄因子MYB具有相同的功能，在細胞的信號轉導方面發揮重要作用，該基因最有可能是候選基因。

參考文獻：

[1]Sakamoto T, Morinaka Y, Ohnishi T, et al. Erect leaves caused by brassinosteroid deficiency increase biomass production and grain yield in rice.NatBiotechnol, 2006, 24: 105-109.

[2]董國軍,藤本寬,滕勝,等.水稻劍葉角度的QTL分析.中國水稻科學, 2003, 17(3): 219-222.

Dong G J, Teng B K, Ten S, et al. QTL analysis of the flag leaf angle in rice.ChinJRiceSci, 2003, 17(3): 219-222.(in Chinese with Engish abstract)

[3]沈福成.水稻劍葉長、寬、角度及比葉重的遺傳.貴州農業科學,1983, 6: 18-25.

Shen F C. Inheritance of flag leaf length, width, angle and specific leaf weight.GuizhouAgricSci, 1983, 6: 18-25.(in Chinese)

[4]Yan J Q, Zhu J, He C X, et al. Molecular marker assisted dissection of genotype×environment interaction for plant type traits in rice (OryzasativaL.).CropSci, 1999, 39: 538-544.

[5]Li Z K, Paterson A H, Pinson S R M, et al. RFLP facilitated analysis of tiller and leaf angles in rice (OryzasativaL.).Euphytica, 1999, 109: 79-84.

[6]Kobayashi S, Fukuta Y, Morita S, et al. Quantitative trait loci affecting flag leaf development in rice (OryzasativaL.).BreedingSci, 2003, 53: 255-262.

[7]張克勤,戴偉民,樊葉楊,等.水稻劍葉角度與主穗產量的遺傳剖析.中國農學通報, 2008, 24(9): 186-192.

Zhang K Q, Dai W M, Fan Y Y, et al. Genetic dissection of flag leave angle and main panicle yield traits in rice.ChinAgricSciBull, 24(9): 186-192.(in Chinese with Engish abstract)

[8]羅偉,胡江,孫川,等.水稻抽穗期功能葉葉型相關性狀遺傳分析.分子植物育種,2008, 6(5): 853-860.

Luo W, Hu J, Sun C, et al. Genetic analysis of functional leaf related traits at heading stage in rice.MolplantBreeding, 2008, 6(5): 853-860.(in Chinese with Engish abstract)

[9]蔡晶.水稻劍葉性狀的遺傳分析和QTL定位.北京:中國農業科學院,2009.

Cai J. Genetic analysis and QTL mapping of the flag leaf traits in rice (OryzasativaL.). Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2009.(in Chinese with English abstracter)

[10]王盈盈.水稻劍葉角度的QTL定位分析.南京:南京農業大學,2009.

Wang Y Y. Mapping of flag leaf angle QTLs in rice (OryzasativaL.) . Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2009.(in Chinese with English abstract)

[11]Bian J M, He H H, Shi H, et al. Quantitative trait loci mapping for flag leaf traits in rice using a chromosome segment substitution line population.PlantBreeding, 2014, 133: 203-209.

[12]胡文德,張紅,江建華,等.粳稻大劍葉角資源的發現及劍葉角度的遺傳分析與QTL定位.中國水稻科學,2012, 26(1): 34-42.

Hu W D, Zhang H, Jiang J H, et al. Genetic analysis and QTL mapping of large flag leaf angle trait in japonica rice.ChinJRiceSci, 2012, 26(1): 34-42.(in Chinese with Engish abstract)

[13]汪得凱,張紅心,胡國成,等.一個水稻大葉角度突變體lla的遺傳分析及基因克隆.科學通報,2005, 50(4): 399-401.

Wang D K, Zhang H X, Hu G C, et al. Genetic analysis and gene cloning of a large leaf angle mutantlla.ChinSciBull, 50(4): 399-401.(in Chinese with Engish abstract)

[14]金偉棟,程保山,洪德林.基于SSR標記的太湖流域粳稻地方品種遺傳多樣性研究.中國農業科學,2008, 41(11): 3822-3830.

Jin W D, Cheng B S, Hong D L. Genetic diversity analysis of japonica rice landraces (OryzasativaL.) in Tai Lake Region based on SSR markers.SciAgricSin, 41(11): 3822-3830.(in Chinese with Engish abstract)

[15]洪德林,江建華,胡文德,等.粳稻劍葉斜下伸資源的發現與大劍葉角度的遺傳和SSR標記.雜交水稻，2010, 25, 285-293.

Hong D L, Jiang J H, Hu W D, et al. Discovery of flag leaf oblique extension resource and genetics of large flag leaf angle and SSR marker.HybridRice, 2010, 25: 285-293. (in Chinese with English abstract)

[16]張紅.粳稻制種相關性狀及其雜種優勢的分子遺傳基礎研究與以863B為遺傳背景的A7444 CSSL群體構建.南京:南京農業大學, 2012.

Zhang H. Molecular genetic basis research of cross correlation properties and heterosis in japonica rice and construction of CSSL population. Nanjing： Nanjing Agricultural University, 2009. (in Chinese with English abstract)

[17]Dellaporta S L, Wood J, Hicks J B. A plant DNA miniprepration: Version Ⅱ.PlantMolBiolRep, 1983, 1: 19-21.

[18]Su N, Hu M L, Wu D X, et al. Disruption of a rice pentatricopeptide repeat protein causes a seedling-specific albino phenotype and its utilization to enhance seed purity in hybrid rice production.PlantPhysiol, 2012, 159(1): 227-238.

[19]曹立勇,錢前,朱旭東,等.紫葉標記秈型光溫敏核不育中紫S的選育及其配組的雜種優勢.作物學報,1999, 25(1): 44-49.(in Chinese with Engish abstract)

Cao L Y, Qian Q, Zhu X D, et al. Breeding and combining heterosis of purple S with purple leaf marker indica PTGMS.JCropSci, 1999, 25(1): 44-49.

[20]Hong Z, Miyako U T, Kazuto U, et al. A rice brassinosteroid-deficient mutant,ebisudwarf(d2), is caused by a loss of function of a new member of cytochrome P450.PlantCell, 2003, 15: 2900-2910.

[21]Zhang L Y, Bai M Y, Wu J X, et al. Antagonistic HLH/bHLH transcription factors mediate brassinosteroid regulation of cell elongation and plant development in rice andArabidopsis.PlantCell, 2009, 21: 3767-3780.

[22]Zhao S Q, Hu J, Guo L B, et al. Rice leaf inclination2, a VIN3-like protein, regulates leaf angle through modulating cell division of the collar.CellRes, 2010, 20: 935-947.

[23]Ning J, Zhang B C, Wang N L, et al. Increased leaf angle1, a raf-like MAPKKK that interacts with a nuclear protein family, regulates mechanical tissue formation in the lamina joint of rice.PlantCell, 2011, 23(12): 4334-4347.

Fine Mapping ofqFla-8-2 for Flag Leaf Angle in Rice

ZHU Chang-feng, LIANG Li-jun, ZENG Si-yuan, LI Tian-wei, DONG Guan-shan, HONG De-lin*

(StateKeyLaboratoryofCropGeneticsandGermplasmEnhancement,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China;*Correspondingauthor,E-mail:delinhong@njau.edu.cn)

ZHU Changfeng, LIANG Lijun, ZENG Siyuan, et al. Fine mapping of locusqFla-8-2 for flag leaf angle in rice. Chin J Rice Sci, 2016, 30(1): 27-34.

Abstract:To better understand the genetic mechanism regulating large rice flag leaf angle, qFla-8 detected previously was further fine-mapped and the candidate genes were predicted. Using a secondary segregating population, composed of 172 selfing individual plants with heterozygous region of target gene merely in BC3F3 population derived from the backcross between 863B (recipient parent) and A7444 (donor parent), genotypes of nine SSR markers in the interval of RM6215-RM8265 containing qFla-8 were identified. Combining the phenotypic data, chromosome segment containing qFla-8 was further narrowed and there are two closely linked loci, qFla-8-1 and qFla-8-2.qFla-8-1 was localized between RM6215 and RM3153, explaining 22.33% of phenotypic variation,and qFla-8-2 was localized between RM1309 and RM3491, explaining 23.81% of phenotypic variation. By developing insertion-deletion (InDel) markers, qFla-8-2 with higher additive effect was finally limited to 67 kb region between InDel marker Z7 and SSR marker RM23071,which contains three predicted genes, Os08g0408200 encoding WD40 domain containing protein similar to GAMYB-binding protein, Os08g0408300 encoding hypothetical protein and Os08g0408500 encoding APETALA2-like protein.

Key words:rice; flag leaf angle; QTL; fine mapping

文章編號:1001-7216(2016)01-0027-08

中圖分類號:Q343.1+5; S511.032

文獻標識碼:A

基金項目:國家863 計劃資助項目(2010AA101301)； 高等學校博士學科點專項科研基金資助項目(20130097110001)； 中央高?；究蒲袠I務費專項資金項目(KYZ201202-9)。

收稿日期:2015-06-15； 修改稿收到日期: 2015-08-24。