鈣和水楊酸對低溫下黃瓜幼苗抗氧化酶同工酶的影響

王素平

摘要： 以黃瓜品種津綠11號為試驗材料，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術，研究了外源葉面噴施2 mmol/L CaCl2和1 mmol/L SA預處理對低溫下黃瓜幼苗抗氧化酶同工酶的影響。結果表明：噴施2 mmol/L CaCl2對低溫處理下的黃瓜幼苗SOD和POD同工酶酶帶的條數和強度沒有明顯影響，但明顯增強了CAT同工酶酶帶的強度；噴施1 mmol/L SA明顯增強了低溫處理下黃瓜幼苗的SOD1～SOD4、POD1、POD3～POD 6、CAT1和CAT2酶帶。暗示鈣和SA通過影響抗氧化酶同工酶表達參與黃瓜植株低溫耐性的調節。

關鍵詞： 鈣；水楊酸；低溫；黃瓜；抗氧化酶；同工酶

中圖分類號： S642.201 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0168-03

黃瓜（Cucumis sativus L.）是我國溫室栽培的主要蔬菜作物之一，黃瓜屬喜溫性作物，對低溫反應很敏感[1]，在冬春設施栽培期間經常遭受不同程度的低溫脅迫，對黃瓜植株的生長、光合、碳和氮的代謝、酶活性和干物質積累產生不同程度的影響。植物體內存在的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）等有助于植物抵御不良環境造成的活性氧傷害。Ca2+既是細胞的結構物質，又是耦聯胞外信號與胞內生理生化反應的第二信使，在調控溫度、水分以及鹽脅迫下植物防御生理響應方面具有重要作用[2]。鈣能提高逆境下植物組織或細胞的抗性，可提高辣椒（Capsicum annuum L.）幼苗的抗寒性[3]，降低低溫脅迫下水稻（Oryza sativa L.）幼苗的丙二醛含量[4]，增強茄子（Sloanum melongena）幼苗抗膜脂過氧化能力[5]。水楊酸（salicylic acid，SA）是植物體內普遍存在的一種小分子酚類物質，在誘導植物抗病性、信號轉導、激活植物過敏反應和系統獲得性抗性等方面起著重要的調節作用[6]。外源SA能夠緩解低溫脅迫對黃瓜植株生長的抑制作用[7]。本試驗以黃瓜幼苗為材料，研究了外源鈣和SA預處理對低溫下黃瓜幼苗抗氧化酶同工酶的影響，探討鈣和SA對黃瓜幼苗低溫耐性的調節機制，以期為提高設施蔬菜作物低溫耐性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和處理

供試黃瓜品種為津綠11號（天津市綠豐園藝新技術開發有限公司），購自河南省商丘市種子公司。在商丘師范學院玻璃溫室內培育黃瓜幼苗。黃瓜種子經溫湯浸種并催芽后，于50孔穴盤中育苗，2葉1心時，定植于13 cm×12 cm軟塑料營養缽中，3葉1心時將黃瓜幼苗隨機分成3組，每組30株，分別進行以下不同處理。試驗共設3個處理：（1）低溫：將黃瓜幼苗放入人工氣候箱進行低溫處理，處理條件為：晝/夜溫度為15 ℃/8 ℃；光/暗時間為12 h/12 h。（2）低溫+2 mmol/L CaCl2：記作2 mmol/L Ca2+，在低溫處理黃瓜幼苗前葉面噴施CaCl2水溶液。（3）低溫+1 mmol/L SA：記作 1 mmol/L SA，在低溫處理黃瓜幼苗前葉面噴施SA水溶液。CaCl2和SA處理：采用葉面噴施法進行預處理，分別于低溫處理開始前60、48、36、24 h噴施4次，處理（1）同時噴施等體積的水，葉片正反面均噴到。所有處理均添加0.01%吐溫。

低溫處理4 d時，取黃瓜幼苗生長點下面第2張展開葉進行SOD、POD和CAT同工酶電泳。試驗重復3次。

1.2 同工酶電泳

1.2.1 酶液提取 SOD、POD和CAT同工酶電泳采用同樣的酶提取液。取黃瓜幼苗葉片0.4 g加1.5 mL磷酸鈉緩沖液（0.05 mol/L，pH值7.8，內含0.1 mmol/L EDTA和1% PVP），冰浴研磨至勻漿。以4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液，即得SOD、POD和CAT酶液，用于SOD、POD和CAT同工酶電泳。

1.2. 2 同工酶電泳 SOD、POD和CAT聚丙烯酰胺同工酶電泳采用垂直板電泳槽進行，分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為3.75%，在濃縮膠中穩定電壓為90 V，進入分離膠后穩定電壓為200 V，3～4 h完成電泳。SOD同工酶電泳采用鄰聯（二）茴香胺法[8]進行染色；POD同工酶電泳采用醋酸聯苯胺法[9]進行染色；CAT同工酶電泳在分離膠中加入總體積 0.5% 的可溶性淀粉，并采用H2O2-KI法[10]進行染色。

2 結果與分析

2.1 鈣和SA對低溫下黃瓜幼苗SOD同工酶的影響

從圖1可以看出，低溫處理的黃瓜幼苗SOD同工酶顯現出SOD1、SOD2、SOD3、SOD4和SOD5共5條主酶帶，其中SOD2、SOD4和SOD5酶帶出現較早，屬于強帶；SOD1酶帶顯色較晚，著色淺，屬于弱帶。與低溫處理相比，2 mmol/L Ca2+預處理的黃瓜幼苗SOD同工酶酶帶條數不變，其著色程度與低溫處理相近；1 mmol/L SA預處理明顯增強了黃瓜幼苗SOD1～SOD4酶帶，SOD5酶帶著色程度與低溫處理相近。

2.2 鈣和SA對低溫下黃瓜幼苗POD同工酶的影響

由圖2可以看出，低溫處理的黃瓜幼苗POD同工酶顯現出6條主酶帶，分別為POD1、POD2、POD3、POD4、POD5和POD6，其中POD4、POD5和POD6酶帶出現較早，屬于強帶；POD1酶帶顯色較晚，著色淺，屬于弱帶。與低溫處理相比，2 mmol/L Ca2+預處理的黃瓜幼苗POD同工酶酶帶條數不變，其著色程度與低溫處理相近；1 mmol/L SA預處理明顯增強了黃瓜幼苗POD1、POD3～POD6酶帶，POD2酶帶著色程度與低溫處理相近。

2.3 鈣和SA對低溫下黃瓜幼苗CAT同工酶的影響

由圖3可以看出，低溫處理的黃瓜幼苗CAT同工酶顯現2條酶帶，分別為CAT1和CAT2。與低溫處理相比，2 mmol/L Ca2+和1 mmol/L SA預處理的黃瓜幼苗CAT同工酶酶帶條數不變，CAT1和CAT2酶帶明顯增強，尤以2 mmol/L CaCl2預處理的CAT酶帶為最強。

3 討論

活性氧包括超氧陰離子（O-2 · ）、H2O2、羥自由基（·OH）和單線態氧（1O2）等，植物中活性氧水平受抗氧化酶活性和抗氧化劑的調節?？寡趸窼OD以 O-2 · 為底物進行歧化反應，起到清 O-2 · 的作用，其酶促反應產生的H2O2仍是有毒害的，H2O2可經POD和CAT等催化降解為無害的H2O。通過SOD、POD和CAT等抗氧化酶協同作用，使植株體內活性氧維持在一個較低水平，減少對細胞的傷害。同工酶的功能在生理上表現為對代謝的調節作用，同工酶分析是認識基因存在和表達的工具[11]。

Ca2+能維持細胞壁、細胞膜及膜蛋白的穩定性，在植物感應、傳遞抗寒信號、產生生理響應過程中起著重要作用[12-13]。Ca2+可以提高低溫脅迫下黃瓜[14]、辣椒[3]、番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）[15]、甜瓜（Cucumis melo L.）[16]和棉花（Gossypium spp.）[17]幼苗葉片SOD、POD、CAT活性，降低丙二醛含量，防止膜脂過氧化，維持膜完整性。本試驗中，葉面噴施 2 mmol/L CaCl2對低溫處理下的黃瓜幼苗SOD和POD同工酶酶帶的條數和強度沒有明顯影響，但明顯增強了CAT同工酶酶帶的強度。表明Ca2+通過影響抗氧化酶同工酶表達參與黃瓜植株低溫耐性的調節。王芳等采用CaCl2營養液澆灌玉米（Zea mays L.）幼苗[18]，姜秀梅等采用CaCl2葉面噴施辣椒幼苗，其研究結果均以10 mmol/L CaCl2處理緩解低溫傷害的效果最為明顯[19]。李曉明等則采用0.5 mmol/L CaCl2葉面噴施低溫下黃瓜幼苗[14]。由此可知，由于采用的植物材料和品種不同，Ca2+處理的方法、濃度、次數和時間不同，低溫處理的強度和時間長短不同，導致研究結果存在差異。

SA被認為是植物在脅迫反應中產生的一種信號分子[20]。SA可能直接作為一種抗氧化劑淬滅活性氧或者通過激活抗氧化劑的活性調節氧化還原平衡[21-22]，通過增加維生素C和谷胱甘肽的含量，降低錳脅迫對黃瓜植株造成的氧化傷害[23]，通過調節抗氧化代謝促進鹽脅迫下蔬菜作物的生長[24]。馬德華等對黃瓜幼苗進行低溫鍛煉，可使葉片游離態SA含量增加2.5倍以上，表明SA可能與植物的抗低溫脅迫有關[25]。SA在H2O2參與下，通過減輕逆境下植物細胞的結構變化、調節抗氧化酶活性和質外體蛋白含量提高植物的抗寒性[26]。劉偉等、常云霞等、王紀忠等的研究表明，SA通過提高低溫脅迫下黃瓜幼苗SOD、POD和CAT活性，增強葉片細胞膜的穩定性，緩解低溫脅迫造成的冷害[27-29]。本試驗中，葉面噴施1 mmol/L SA明顯增強了低溫處理下黃瓜幼苗的SOD1～SOD4、POD1、POD3～POD6、CAT1和CAT2酶帶，表明SA通過影響抗氧化酶同工酶表達參與黃瓜植株低溫耐性的調節。

綜上所述，葉面噴施2 mmol/L CaCl2明顯增強了低溫處理下黃瓜幼苗CAT同工酶酶帶的強度，葉面噴施1 mmol/L SA明顯增強了黃瓜幼苗SOD1～SOD4、POD1、POD3～POD6、CAT1和CAT2酶帶，表明鈣和SA通過影響抗氧化酶同工酶表達參與黃瓜植株低溫耐性的調節。

參考文獻：

[1]閆世江，司龍亭，馬志國，等. 不同來源黃瓜親本苗期耐低溫鑒定[J]. 沈陽農業大學學報，2006，37（5）：766-768.

[2]李益清，李天來. 外源鈣及鈣抑制劑對番茄耐弱光特性的調控作用[J]. 西北農業學報，2011，20（8）：121-126.

[3]張化生，郭曉冬，王 萍. 低溫脅迫下硝酸鈣處理對辣椒幼苗抗冷性的影響[J]. 甘肅農業大學學報，2008，43（2）：66-69.

[4]李美如，劉鴻先，王以柔，等. 水稻幼苗冷鍛煉過程中鈣的效應[J]. 植物學報，1996，38（9）：735-742.

[5]王鳳華，王貴學，賴鐘雄，等. CaCl2處理對茄子幼苗膜脂過氧化的影響[J]. 江西農業大學學報，2005，27（4）：545-547，552.

[6]Ahtúzar-Molina A R，Munoz-Sánchez M，Vázquez-Flota F，et al. Phospholipidic signaling and vanillin production in response to salicylic acid and methyl jasmonate in Capsicum chinense L.cells[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2011，49：151-158.

[7]李 亮，董春娟，尚慶茂. 內源水楊酸參與黃瓜葉片光合系統對低溫脅迫的響應[J]. 園藝學報，2013，40（3）：487-497.

[8]張愛群，沈文梅. 乙醇對超氧化物歧化酶活性鄰聯〔二〕茴香胺染色法的影響[J]. 生物化學與生物物理進展，1993，20（2）：161-162.

[9]王秀芬. 過氧化物酶同工酶最佳染色法[J]. 河北農業大學學報，1990，13（4）：78-80.

[10]陳毓荃. 生物化學實驗方法和技術[M]. 北京：科學出版社，2002：239-241.

[11]周光宇. 有關同工酶分析的幾個問題[J]. 植物生理學通訊，1983（1）：1-4，9.

[12]Carpaneto A，Ivashikina N，Levchenko V A，et al. Cold transiently activates calcium-permeable channels in Arabidopsis mesophyll cells[J]. Plant Physiology，2007，143（1）：487-494.

[13]Hepler P K. Calcium：a central regulator of plant growth and development[J]. Plant Cell，2005，17（8）：2142-2155.

[14]李曉明，陳勁楓，逯明輝，等. 低溫下鈣對黃瓜幼苗抗氧化酶活性及POD同工酶譜的影響[J]. 西北植物學報，2006，26（2）：241-246.

[15]李天來，高曉倩，劉玉鳳. 夜間低溫脅迫下鈣對番茄幼苗根系活力及活性氧代謝的調控作用[J]. 西北農業學報，2011，20（8）：127-132.

[16]彭向永，徐永茹，唐 萍，等. 外源鈣對低溫脅迫下甜瓜幼苗膜穩定性和滲透調節物質的影響[J]. 曲阜師范大學學報：自然科學版，2011，37（1）：81-84.

[17]廖金柯，趙 克，胡小燕，等. 低溫脅迫后鈣對棉花幼苗的影響[J]. 江蘇農業科學，2012，40（9）：90-91.

[18]王 芳，王丹丹，趙 娟，等. 鈣對低溫脅迫下玉米幼苗氧化損傷的保護作用[J]. 干旱地區農業研究，2014，32（1）：155-160.

[19]姜秀梅，秦 勇，郭光照，等. 外源物質處理對辣椒幼苗抗冷性的影響[J]. 中國農學通報，2013，29（25）：87-92.

[20]李兆亮，原永兵，劉成連，等. 黃瓜細胞中水楊酸的信號傳遞研究[J]. 植物學報，1998，40（5）：45-51.

[21]Popova L P，Maslenkova L T，Yornanova R Y，et al. Expogenous treatment with salicylic acid attenuates cadmium toxicity in pea seedlings[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2009，47：224-231.

[22]Saidi I，Ayouni M，Dhieb A，et al. Oxidative damages induced by short-term exposure to cadmium in bean plants：protective role of salicylic acid[J]. South African Journal of Botany，2013，85：32-38.

[23]Shi Q H，Zhu Z J. Effects of exougenous salicylic acid on manganeses toxicity，element contents and antioxidative system in cucumber[J]. Environmental and Experimental Botany，2008，63：317-326.

[24]Hayat Q，Hayat S，Irfan M，et al. Effect of exogenous salicylic acid under changing environment：a review[J]. Environmental and Experimental Botany，2010，68（1）：14-25.

[25]馬德華，龐金安，李淑菊，等. 溫度逆境鍛煉對高溫下黃瓜幼苗生理的影響[J]. 園藝學報，1998，25（4）：39-44.

[26]孟雪嬌，邸 昆，丁國華. 水楊酸在植物體內的生理作用研究進展[J]. 中國農學通報，2010，26（15）：207-214.

[27]劉 偉，艾希珍，梁文娟，等. 低溫弱光下水楊酸對黃瓜幼苗光合作用及抗氧化酶活性的影響[J]. 應用生態學報，2009，20（2）：441-445.

[28]常云霞，徐克東，陳 璨，等. 水楊酸對低溫脅迫下黃瓜幼苗葉片抗寒生理指標的影響[J]. 北方園藝，2013（12）：1-4.

[29]王紀忠，周 青. 外源水楊酸對持續低溫脅迫下黃瓜幼苗生長和細胞膜穩定性的影響[J]. 長江蔬菜，2010（16）：29-32.