超聲波輔助氯化汞消毒污染組培棗苗的研究

陳宗禮， 張枝嬋， 韓愛琴， 柏 勇， 楊 洋， 張樂元

(延安大學 生命科學學院 陜西省紅棗重點實驗室， 延安 716000)

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超聲波輔助氯化汞消毒污染組培棗苗的研究

陳宗禮， 張枝嬋， 韓愛琴， 柏 勇， 楊 洋， 張樂元

(延安大學 生命科學學院 陜西省紅棗重點實驗室， 延安 716000)

摘要以細菌污染的晉南1號單倍體組培棗苗為材料，以乙醇、氯化汞和超聲波為主要試驗因素，采用隨機區組試驗設計，探討超聲波輔助氯化汞消毒拯救污染組培苗及外植體消毒的優化方法。結果表明，拯救污染組培苗的優化組合消毒方法是70%乙醇浸泡30 s+0.1%氯化汞浸泡4 min+超聲(28 Hz, 25℃)15 min。該方法較之常規乙醇-氯化汞化學消毒方法，接種的外植體污染率降低了68.41%，其成活率提高了75.72%，增殖程度提高了4.41倍。該超聲波輔助氯化汞消毒的理化新方法，降低了外植體消毒中氯化汞的使用濃度和消毒時間，減少了消毒對環境的污染，能極大地提高消毒效果，可擴展推廣到所有植物組織培養中外植體的消毒。

關鍵詞超聲波；氯化汞；組培棗苗；污染；消毒

Study on the ultrasonic assisted disinfection method to save pollution tissue culture seedling

CHEN Zong-li, ZHANG Zhi-chan, HAN Ai-qin, BAI Yong, YANG Yang, ZHANG Le-yuan

(Shaanxi Key Laboratory of Chinese Jujube, College of Life Science, Yanan University, Yanan 716000, China)

AbstractTo obtainZizyphusjujubemill, Jinnan 1, tissue culture seedling contaminated with bacteria, methods were studied by using the ethanol, mercuric chloride and ultrasonic as primarily test factors together with the random block design of experiment. The results showed that optimal combined disinfection method for saving pollution tissue culture seedling was as follows samples soaked in 70% ethanol for 30 s, then in 0.1% mercuric chloride for 4 min and treated with ultrasonic(28 Hz, 25℃) for 15 min. Compared with the conventional ethanol-mercury chloride chemical disinfection method, pollution rate of inoculation explants with this method was reduced by 68.41%, the survival rate increased by 75.72%, the proliferation degree increased by 4.41 times. This new method of physical and chemical disinfection showed good feasibility.

Keywordsultrasonic; mercuric chloride; tissue culture jujube seedling; pollution; disinfection

植物組織培養中，篩選應用適宜的消毒方法，降低消毒劑對外植體的損傷及對環境的污染，搶救被污染的珍稀組培材料，提高無菌系的成活率一直是受到關注和值得研究的一個重要問題，也是一項關系到組培效率的關鍵技術。目前，大多數研究集中在關于應用化學消毒劑如乙醇、氯化汞、次氯酸鹽等的不同組合消毒方法的研究[1-6]；也有少數關于輔助應用抗生素控制污染的研究[7]。眾所周知，化學消毒劑的使用只有達到一定濃度和作用時間時才可殺滅細菌消除或降低污染，但這同時也會對外植體細胞造成一定損傷，從而影響外植體的存活和萌發概率；輔助應用抗生素雖可除去內部組織所帶菌類，但其抑菌單一、藥效時間短、穩定性差、容易使菌類產生抗藥性等缺點而受到限制[7]；同時，較大濃度的化學消毒劑的殘留物也會對環境造成一定的影響。因此，非化學殺菌劑得到了越來越多的重視，其中之一就是超聲殺菌。近來，有關學者在不同植物組培[8-15]、微生物[16-18]和食品加工領域[19-21]進行了超聲波輔助殺菌的消毒方法研究。植物組織培養中，新建的無菌系苗尤其是一些珍稀組培苗在實驗室常被二次污染，致使試驗受到嚴重影響甚或終止。關于拯救污染組培苗的方法的研究還未見報道。本文以晉南1號棗花藥培養獲得的單倍體試管二次污染苗為材料，進行了超聲波輔助消毒的研究，旨在拯救二次污染的珍稀組培苗，同時探討組培外植體消毒的優化方法。

1材料與方法

1.1材料

接種材料為繼代培養到第4代二次污染的晉南1號棗(Zizyphejujubemill jinnan 1zao)單倍體試管苗，培養基為CyI[22]。由陜西省紅棗重點實驗室提供。晉南1號棗是陜西省紅棗重點實驗室于1999年由楊陵農博會引進的優良鮮熟棗品種(現種植于延安大學生物園內)，齊向英等2010年開展了晉南1號棗花藥培養并于2012年獲得單倍體株系試管苗，現存于陜西省紅棗重點實驗室。

主要試劑：無水乙醇(廣東廣華科技股份有限公司)，氯化汞(天津環通精細化工廠)，均為分析純，使用時用重蒸水配制成所需濃度。

主要儀器：立式壓力蒸汽滅菌鍋(LDZX-75KBS, 上海申安醫療器械廠)，凈化工作臺(SW-CJ-1F, 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司)，超聲波清洗機(SB-5200DT, 寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2方法

1.2.1試驗設計

在參閱文獻和預試驗的基礎上，篩選乙醇、氯化汞、附加超聲波處理3個主要影響消毒效果的因素，以不同濃度與時間組合形成11種消毒處理(A、B 、... K)，以文獻上較多使用的消毒處理為對照(CK)，共計12種處理組合(表1)，每個處理重復3次，按隨機區組設計安排試驗。各處理均以CyI[22]為培養基。

表1 污染組培棗苗的組合消毒處理

1.2.2接種與培養

選擇生理狀況基本一致并被細菌污染的晉南1號棗單倍體試管苗，在無菌條件下，于凈化工作臺中剪取培養瓶中培養基以上污染組培苗的莖段，放入裝有少量無菌水的無菌瓶中，先于無菌水清洗3次后按設計的污染苗不同消毒處理分別進行消毒處理。將消毒過的材料在無菌條件下用無菌水沖洗4次，修剪成約1cm長莖段接入培養瓶中[15]，每瓶接3個莖段，每個處理至少接入30個莖段，放入培養室進行培養。前3 d進行室內自然光培養，之后進行光照培養，培養室溫度(25～28)℃, 相對濕度為50%～70%，光強為(1500～2000)lx，光照時數為12 h/d。

1.2.3觀察與統計

試管苗培養中，定期進行觀察統計。接種7 d后，觀察統計各處理組培苗的成活數，污染數，褐化數；30 d時測量各處理的分枝數和苗高。最后計算污染率(污染數/接種總數×100%)，死亡率(死亡數/接種總數×100%)，褐化率(褐化數/接種總數×100%)，增殖程度(苗高系數×增值系數)；其中，苗高系數=平均苗高/接種苗高，增殖系數=分枝數/成活苗數。所有測量數據均用Microsoft Excel進行統計分析；以污染率、成活率、褐化率、增殖程度作為評價各污染苗消毒處理的效果。

2結果與分析

2.1不同消毒處理對晉南1號棗單倍體污染率的影響

試驗結果見表2。表2結果經F檢驗，F處理=36.46>F0.01(20, 10)=4.41，處理間差異極顯著。進一步進行SSR檢驗， 以CK的污染率最高[(18.33±2.36)%]，極顯著地高于其它11種處理；E、I、G、J、K和F 污染率顯著地高于H，極顯著地高于C、A、B、D；H極顯著地高于C；C極顯著地高于A、B、D；而E、I、G、J、K和F相互間無顯著差異；A、B、D相互間亦無顯著差異；以A、B、D的污染率最低(均為0)。分析表明，以A、B、D 3種處理的消毒效果最優(可達0污染)，其次是C處理(比CK降低污染17.17%)，再次是H處理(比CK降低污染15.26%)，第4是E、I、G、J、K和F (比CK降低污染11.44%～14.32%)。說明氯化汞濃度為0.5%、作用時間為8 min時殺菌效果最好。

表2 不同消毒處理對單倍體試管棗苗污染率(%)的影響

小寫字母表示0.05水平上差異顯著；大寫字母表示在0.01水平上差異顯著。相同字母表示差異不顯著；不同字母表示差異顯著或差異極顯著(下同)。

2.2不同消毒處理對晉南1號棗單倍體成活率的影響

試驗結果見表3。表3結果經F檢驗，F處理=46.71>F0.01(20, 10)=4.41，處理間差異極顯著。進一步進行SSR檢驗，以K處理的成活率最高，達(89.66%±3.67)%，極顯著地高于E、D、A、F、H、CK、B和C，顯著地高于G；K、I和J處理相互間無顯著差異。G處理顯著地高于E、D、A、F、H、CK、B和C，而E、D、A、F、H、CK、B和C 相互間亦無顯著差異。分析表明，以K、I兩種處理的成活率最優，達(86.14±4.58)%～(89.66±3.67)%，分別是CK的1.83和1.76倍，其次是J和G處理，成活率分別是CK的1.57倍和1.53倍，再次是A、B、C、D、E、F和H，它們的成活率與CK無顯著差異。說明在超聲波輔助下，氯化汞濃度為0.1%，作用時間4～6 min的消毒組合，其消毒材料的成活率相對最高，而氯化汞濃度相對高的或作用時間相對長的消毒組合，其消毒材料的成活率都在極顯著地降低。

表3 不同消毒處理對單倍體試管棗苗成活率的影響

表4 不同消毒處理對單倍體試管棗苗褐化率(%)的影響

2.3不同消毒處理對晉南1號棗單倍體褐化率的影響

試驗結果見表4。表4結果經F檢驗，F處理=54.60>F0.01(20, 10)=4.41，處理間差異極顯著。進一步進行SSR檢驗，C處理的褐化率極顯著地高于其它11個處理；B、H、A、D和F的褐化率極顯著高于CK、G、E、J、I和K；CK顯著高于G，極顯著高于E、J、I和K；G和E顯著地高于J和I，極顯著高于K；而B、H、A、D和F處理相互間無顯著差異；G、E和J處理相互間也無顯著差異；I和K相互間亦無顯著差異。分析結果表明，以K和I兩種消毒處理的褐化率最低為(6.28±3.47)%～(8.07±3.88)%，比CK分別降低了80.77% 和75.28%；其次是G、E和J，比CK分別降低了41.41%、48.61%和69.04%；再次是B、H、A、D和F，比CK分別降低了70.71%、46.74%、37.67%、31.30%和30.90%。說明氯化汞濃度相對高的或作用時間相對長的消毒組合，其消毒材料的褐化率提高均極顯著；而在相同氯化汞濃度下，輔助超聲波消毒處理的褐化率提高極顯著(如處理C> B，F> CK)；比較A、B 2種處理，在相同氯化汞濃度下，增加70%乙醇進行30 s的消毒處理(B)其褐化率比A有增加趨勢，但增加不顯著。

表5 不同消毒處理對單倍體試管棗苗增殖程度的影響

表6 各組合消毒處理結果的相關分析*

*：計算相關系數時不考慮A、B、C、D 4種處理，因其增殖程度均為零。

2.4不同消毒處理對晉南1號棗單倍體增殖程度的影響

試驗結果見表5。表5結果經F檢驗，F處理=56.50>F0.01(20, 10)=4.41，處理間差異極顯著。進一步進行SSR檢驗， I處理的增殖程度極顯著地高于其它11種處理；J、E、K的增殖程度極顯著地高于H、G、F，CK、A、B、C、D；H、G、F顯著地高于CK，極顯著地高于A、B、C、D；而J、E和K相互間無顯著差異；H、G和F相互間也無顯著差異；A、B、C、D和CK相互間亦無顯著差異。分析表明，以I處理的增殖程度最高(9.98±0.96)，是CK的10.40倍；其次是J、E和K處理，增殖程度分別是CK的4.41、3.91和3.90倍；再次是H、G和F，增殖程度分別是CK的2.39、2.22和1.71倍；而A、B、C、D 4種處理的增殖程度比CK有所減少，但減少均不顯著。說明相對較低濃度的氯化汞(0.1%)和較短的作用時間(4～5 min)輔助超聲波(28 Hz，25℃，15 min)和70%乙醇30 s處理的消毒組合其增殖程度相對最好(如處理I、J)。

2.5優化消毒方案的選擇

對試驗結果的污染率、成活率、褐化率和增殖程度4項參數作兩兩相關分析(表6)顯示：污染率與褐化率成弱正相關(Rc-b=0.09), 成活率與增殖程度成較強正相關(Rs-p=0.65), 污染率與成活率、污染率與增殖程度分別成弱負相關(Rc-s=-0.37,Rc-p=-0.27), 成活率與褐化率成強負相關(Rs-b=-0.96)，褐化率與增殖程度呈較強負相關(Rb-p=-0.62)。以上總體分析反映出，接種的外植體污染率高在一定程度上會促使其褐化，其成活率與增殖程度則相應降低(如處理CK)；接種的成活率高，其增殖程度將極顯著地提高(如處理I、J、K)；接種的褐化率高或低則其成活率與增殖程度將極顯著地降低或提高(如處理C、B、I、J、K、E)。

故評價不同消毒處理對外植體的消毒效果，既要考慮降低其污染率，即提高對有害微生物的滅菌效果，又要盡量減少消毒劑對外植體細胞的傷害，即要降低外植體的褐化率，提高外植體的接種成活率和增殖程度。據此，結合2.1至2.4的分析，A、B和D處理雖達零污染，但褐化率達(42.87±3.64)%～(55.74±2.89)%，成活率分別只有(55.05±5.93)%、(44.26±2.89)%和(11.28±7.47)%，增殖程度均為零；說明這幾種處理對外植體的傷害均很大，主要是較高濃度的氯化汞和較長的消毒時間對外植體造成了毒害。而I處理的污染率[(5.8±2.37)%]極顯著地低于CK(比CK降低了68.41%)；其褐化率[(8.07±3.88)%]雖與K相當，但卻極顯著地低于其它10種處理；其成活率[(86.14±4.58)%]雖與K相當，但卻極顯著地高于其它10種處理；其增殖程度(9.98±0.96)均極顯著地高于其它11種處理。綜合分析顯示，以I組合消毒處理的消毒效果最優。

3討論與結論

消毒技術是組培過程中的關鍵技術，關系到整個實驗是否能夠成功。本研究通過隨機區組試驗，篩選出拯救污染組培棗苗的優化消毒方法，即將外植體用70%乙醇浸泡30 s+0.1%氯化汞浸泡4 min+超聲波28 Hz，25℃，15 min。用該方法，可比常用的消毒方法降低外植體污染率68.41%，提高其成活率75.72%。該方法可擴展到所有植物組織培養中外植體的消毒以及組培中被二次污染的珍稀組培材料的消毒拯救。

消毒技術中乙醇的常用濃度為70%，主要進行表面消毒，它能吸收細菌蛋白的水分使其脫水變性凝固，從而殺滅細菌，同時具有濕潤作用，能排除外植體表層組織的空氣，有利于其他滅菌劑的滲入；但其穿透力強，滅菌時間應控制在30 s以內[16]，延長時間會造成外植體脫水，促進褐化，影響其成活率和將來的生長狀況。

氯化汞常用濃度為0.1%和0.5%，其殺菌原理是Hg2+可與帶負電荷的蛋白質結合，使細菌蛋白變性、酶失活[14]，從而殺滅細菌；但其殘毒較大，應用無菌水充分沖洗消毒過的外植體以最大限度地清除其殘毒，否則會使外植體受到毒害而褐化。

采用超聲波消毒的機理是空化效應，空化的基本效應有高溫效應、放電效應、發光效應、壓力效應等。其中起殺菌作用的主要是高溫效應和壓力效應，在空化所產生的高溫高壓條件下, 水能夠分解成具有強氧化殺菌作用的OH-，H2O2而殺菌[8]；另外，“空化效應”會釋放巨大能量, 產生局部瞬間高壓, 形成沖擊波, 使物體表面及液體介質受到極大的沖擊力, 能量足以使細胞破裂，從而能使其中的菌體細胞壁、細胞質膜破裂，細胞內含物膠體發生絮凝沉淀，凝膠發生液化或乳化而失去生物活性，達到殺菌的目的[8, 17-19]。

超聲與氯化汞聯合處理與傳統消毒方式相比可以降低氯化汞的用量及消毒時間，極大地降低了組培外植體的褐化率而提高了其成活率。

試驗發現，在相同氯化汞濃度下，輔助超聲波消毒處理的褐化率有極顯著提高(如處理C> B，F> CK)，可能有以下原因：一方面，在液體中附著在外植體壁上的Hg2+在超聲場的作用下會發生變化使之分散、松散、松脫而不易附著于外植體壁上[22]；但同時Hg2+會在超聲波作用下獲得巨大加速度，因此產生劇烈運動，在超聲波的空化效應及伴隨效應引起的促進溶液滲透作用[23]下又易于侵入外植體細胞內造成一定毒害；另一方面，在液體介質中超聲作用下獲得巨大加速度的分子因此產生的劇烈運動，還會引起組織細胞容積和內溶物移動、變化及細胞原漿環流，這種作用可引起細胞某些功能的改變而易引起一定程度傷害[24]；或許是這兩方面的共同作用導致了超聲波輔助消毒中棗外植體褐化率一定程度的提高。因此，在消毒過程中，研究設置合適的超聲波處理功率和時間對于提高總體消毒效果也是非常必要的。

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中圖分類號Q943.1,Q322;S665.1

文獻標識碼A

文章編號2095-1736(2016)02-0059-05

作者簡介:陳宗禮，教授，研究方向為植物生物技術，E-mal: yadxczl@126.com。

基金項目：陜西省科技統籌創新工程計劃項目(2013KTZB02-03-01)；陜西省高水平大學建設專項資金項目(2012SXTS06)；延安市科技計劃項目(2009KN-25)

收稿日期：2015-07-20；修回日期：2015-08-31

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.02.059