川木通紅外光譜指紋圖譜的建立及其與相近中藥的鑒別

高姍姍 李建蕊 吳方斌 韋學敏 卞金輝 陳建波 程世瓊 孫素琴 呂光華

[摘要]川木通為常用的利尿通淋藥；因多來源于野生藥材，性狀特征差異大，有效成分及特征性成分不明，難以鑒別。為了建立準確鑒別川木通的方法，該研究收集了24份川木通和7份相近中藥木通和關木通樣品，利用傅里葉變換紅外光譜技術測定4 000～400 cm-1的一維和二維相關紅外光譜。首先隨機選取20份川木通樣品為校正集樣品，發現其紅外光譜的峰形、峰位、峰強相似，相關系數大于0994 3；以其模擬平均紅外光譜為指紋圖譜，其特征峰位于3 412，2 932，1 739，1 639，1 509，1 456，1 426，1 376，1 332，1 261，1 159，1 035，897，609 cm-1等。然后，根據統計學的“3σ規則”，計算用紅外光譜相關系數判別川木通真偽的域值（Mean-3σ=0992 6）。再用另外4份川木通樣品、4份關木通和3份木通樣品檢驗該指紋圖譜鑒別川木通的效果。結果表明，這4份川木通的紅外光譜均與指紋圖譜相似，相關系數也大于域值而判別為川木通；而關木通和木通與川木通的指紋圖譜明顯不同，相關系數均小于域值而判別為非川木通。進一步比較了川木通、木通、關木通的二維相關紅外光譜，發現自動峰和交叉峰數目、位置、強度等特征均不同。由此可見，建立的川木通紅外光譜指紋圖譜可用于川木通的真偽鑒別，為川木通提供了一種簡便、快速鑒別的新方法。

[關鍵詞]川木通；關木通；木通；紅外光譜；指紋圖譜；相關系數；鑒別

[Abstract]Armand clematis stem （Clematidis Armandii Caulis， Chuanmutong） is a widely used Chinese herb to disinhibit urine and relieve stranguria It is difficult to be identified owing to its various macroscopic feature and unknown characteristic compounds Thus， total of 24 Chuanmutong samples and 7 related herbs including four manshurian aristolochia stem （Aristolochiae Manshuriensis Caulis， Guanmutong） and three akebia stem （Akebiae Caulis， Mutong） samples were collected and analyzed in the range of 4 000 400 cm-1 by Fourier Transform Infrared （FTIR） and twodimensional infrared correlation spectroscopy （2DFTIR） techniques The FTIR spectra of 24 Chuanmutong samples are consistent in the spectrum profiles， position and intensity of characteristic peaks 20 of the 24 Chuanmutong samples were randomly selected as calibration samples to calculate and simulate mean spectrum This mean spectrum is named as FTIR fingerprint of Chuanmutong with characteristic peaks at 3 412， 2 932， 1 739， 1 639， 1 509， 1 456， 1 426， 1 376， 1 332， 1 261， 1 159， 1 035， 897 ，609 cm-1 Meanwhile， the limited level （Mean-3σ=0992 6） to identify true or false Chuanmutong by correlation coefficient of FTIR spectra was calculated based on the 20 Chuanmutong calibration samples Then， the rest 4 Chuanmutong， 4 Guanmutong and 3 Mutong samples were used as validation samples to evaluate the identification efficacy The result shows that the FTIR spectra of 4 Chuanmutong validation samples were similar to the fingerprint Their correlation coefficients of FTIR spectra were over the limited level and accepted as Chuanmutong However， the spectra of Guanmutong and Mutong were significantly different from Chuanmutong fingerprint The correlation coefficients of Guanmutong （0902 10940 4， n=4） and Mutong （0954 90978 9， n=3） FTIR spectra were less than the limited level and rejected from Chuanmutong Furthermore， the number， position and intensity of autopeaks on the 2DFTIR were drastically different among the three herbs It is concluded that the developed FTIR fingerprinting can be rapidly and accurately identify Chuanmutong and differentiate from related herbs

[Key words]Clematidis Armandii Caulis； manshurian aristolochia stem； akebia stem； Fourier transform infrared； fingerprint； correlation coefficient； identification

doi：10.4268/cjcmm20160820

川木通為常用中藥，具有利尿通淋，清心除煩，通經下乳之功效；來源于毛茛科植物小木通Clematis armandii Franch或繡球藤C montana Buch Ham的干燥藤莖[12]。由于川木通多為野生藥材，再加上地方習用品等原因，導致商品川木通的品種混淆、混用[34]。尤其是川木通與木通、關木通混淆。這3種相近中藥曾經稱為“木通類”中藥，其功效或臨床應用不同，原植物也不相同。中藥木通來源于木通科植物木通Akebia quinata （Thunb） Decne、三葉木通A trifoliate （Thunb） Koidz和白木通A trifoliate （Thunb） Koidz var australis （Diels） Rehd的干燥藤莖，也是《中國藥典》收載的中藥品種[12]。雖然其有效成分、藥理作用和主治功能與川木通相近，但臨床應用各有側重，區別使用[5]。關木通曾收載于2000年版《中國藥典》中，來源于馬兜鈴科植物東北馬兜鈴Aristolochia manshuriensis Kom 的干燥藤莖；因其產量高，曾經是“木通類”中藥的主要品種[6]。但因關木通含馬兜鈴酸類成分，具有腎臟毒性[78]，于2003年被國家藥品監督管理局禁用[9]。并且，世界上許多國家嚴禁使用含馬兜鈴酸類成分的藥物[10]。因此，川木通與木通、關木通不能混用。然而，在2010年版和2015年版《中國藥典》中，川木通既無真偽鑒別的特征性成分，又無質量評價的指標性成分，難以保證川木通品種的準確性和中醫藥的臨床療效。因此，亟待通過研究，建立準確、快速鑒別川木通的新方法。

紅外光譜是物質中分子的吸收光譜，能反映樣品的化學成分信息。不同中藥的化學成分不同，其紅外光譜也不同，各具指紋特征。并且，紅外光譜具有操作簡便、快速的優點，能有效地鑒定和控制中藥的質量[1112]。同時，二維相關紅外光譜（twodimensional infrared correlation spectroscopy，2DFTIR）展現了外界擾動下產生的光譜特征，與常規紅外光譜（一維紅外光譜）相比，提供了更多的化學成分信息，具有更高的分辨率[1314]。為此，本研究從不同產地和中藥材市場收集了24份川木通樣品及其7份相近中藥（木通和關木通）樣品；運用傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared， FTIR）技術，測定一維紅外光譜（以下稱為“紅外光譜”）和二維相關紅外光譜。通過分析光譜特征，建立川木通紅外光譜指紋圖譜；并運用統計學分析，計算用紅外光譜相關系數判斷川木通真偽的域值。并進一步用木通和關木通檢驗川木通指紋圖譜的鑒別作用；為川木通提供一種準確、快速的紅外光譜鑒別方法。

1材料

11儀器及測定參數

傅里葉變換紅外光譜儀為Spectrum One（美國PerkinElmer公司），DTGS檢測器。YP2壓片機（上海山岳科學儀器有限公司）。壓片模具（美國PerkinElmer 公司），直徑13 mm。變溫附件為Portable Controller可編程溫度控制單元（50886型）（Love Control公司）。

紅外光譜的掃描范圍為4 000～400 cm-1，每張光譜累加掃描16次，分辨率為4 cm-1，掃描過程中實時扣除二氧化碳和水蒸氣干擾。

紅外光譜處理軟件為Spectrum v 632（美國PerkinElmer公司）；二維相關紅外光譜軟件由清華大學設計。

12藥品及藥材樣品

溴化鉀（KBr，光譜純）碎晶購于四川省自貢市化工研究設計院。

24份川木通樣品和7份易混中藥關木通和木通樣品分別從不同產地、中藥材專業市場及醫藥公司等收集（表1），由成都中醫藥大學呂光華教授鑒定。樣品S1～S24為中藥川木通的原植物（毛茛科植物小木通C armandii或繡球藤C montana的干燥藤莖；S25～S28為中藥關木通的原植物（馬兜鈴科植物東北馬兜鈴A manshuriensis的干燥藤莖；S29～S31為中藥木通的原植物（木通科植物木通A quinata，白木通A trifoliata var australis和三葉木通A trifoliata）的干燥藤莖。

2方法

21紅外光譜的測定

每份藥材取代表性的樣品，粉碎，過6號篩（100目）；經KBr壓片法制成樣品片，置于紅外光譜儀中，在室溫下測定紅外光譜圖。

22二維相關紅外光譜的測定

將制備的藥材KBr樣品片置于變溫的樣品架上，溫度由50 ℃升高至120 ℃，每間隔10 ℃收集1張紅外光譜。這些紅外光譜經二維相關紅外光譜軟件處理得到中藥樣品隨溫度變化的二維相關紅外光譜。

23紅外光譜圖的標準化

將收集得到的紅外光譜經坐標轉化（縱坐標為吸光度），基線校正，光譜歸一化，得到標準圖譜。識別紅外光譜峰的強度閾值設為001 A。

24紅外光譜相似度的評價

用相關系數表示中藥紅外光譜的相似度。其相關系數用投影向量夾角余弦法計算，計算公式如下。

rxy=（∑ni=1XiYi）（∑ni=1X2i）1/2（∑ni=1Y2i）1/2（1）

式中Xi和Yi表示光譜X與光譜Y在波數i處的吸光度，n為波數變量的個數[15]。

25紅外光譜相關系數判別川木通真偽的域值

由于在正態曲線下區間（μ-3σ，μ+3σ）內的面積為9973%。根據正態分布的“3σ”規則，服從正態分布的隨機變量和它的數學期望的偏差（絕對值）不超過它的3倍均方差的概率為0997 3。故常以Mean±3σ作為實驗觀測值的上控制限（UCL）和下控制限（LCL）[16]。在本研究中，以20份川木通校正集樣品紅外光譜的相關系數（Mean-3σ）值作為判別川木通真偽的域值。

3結果與討論

31川木通紅外光譜指紋圖譜的建立

中藥紅外光譜可以直觀地反映中藥的整體成分。為了建立特征性強、評價客觀的川木通紅外光譜指紋圖譜，在24份川木通樣品中，隨機抽取的4份樣品（S3，S4，S8和S24）作為檢驗川木通真偽的驗證集樣品；其余20份樣品（S1，S2， S5～S7，S9～S23）作為校正集樣品，建立川木通的指紋圖譜。首先，通過分析20份川木通校正集樣品的紅外光譜，找出特征峰，建立特征性指紋圖譜；再計算、比較這些樣品紅外光譜的相關系數，確定川木通真偽鑒別的域值。

結果表明，20份川木通校正集樣品的紅外光譜相似（圖1a），均在3 419～3 391，2935～2 918，1 741～1 736，1 655～1 636，1 509，1 463～1 453，～1 427，1 376，1 332，1 265～1 259，1 159，1 107，1 035，897，822～813，666，610～606 cm-1等處具有吸收峰。其中，3 419～3 391 cm-1為游離OH形成氫鍵后出現的寬而強的吸收峰；～2 923 cm-1為亞甲基CH反對稱伸縮振動吸收峰；～1 739 cm-1為C=O伸縮振動吸收峰；～1 639 cm-1為OH彎曲振動吸收峰；～1 509 cm-1和～1 456 cm-1為苯環骨架伸縮振動吸收峰；～1 426，～1 376和～1 332 cm-1為CH彎曲振動吸收峰；～1 261 cm-1為COC伸縮振動吸收峰；～1 159，～1 103和～1 035 cm-1為CO伸縮振動吸收峰等。

a 20份校正集樣品的重疊光譜； b 20份校正集樣品產生的指紋圖譜。

這20份川木通樣品的整體峰形也相似。由于在4 000～2 500 cm-1的峰主要是OH和CH伸縮振動吸收峰，這一區域的紅外光譜受水分的影響較大；在2 500～1 800 cm-1未發現吸收峰；在800～400 cm-1的吸收峰容易受多種因素的影響而改變位置[12]。因此，本研究選擇光譜穩定、特征性強的1 800～800 cm-1的紅外光譜，計算相關系數。結果表明，這20份川木通校正集樣品的紅外光譜很相似，與其平均光譜的相關系數為0994 3～0999 3（表1），平均值為0997 3 （n=20）。為此，將這20份川木通樣品紅外光譜的平均光譜作為川木通的指紋圖譜（圖1b），其特征峰位于3 412，2 932，1 739，1 639，1 509，1 456，1 426，1 376，1 332，1 261，1 159，1 035，897，609 cm-1等。

為了確定以紅外光譜相關系數為指標判別川木通真偽的閾值，對相關系數進行了統計分析。相關系數為0～1的任意數值，可以用正態分布進行描述。根據統計學，單樣本的KolmogorovSmirnov檢驗可判斷一組觀測數據的分布是否符合正態分布。為此，本研究中選用KolmogorovSmirnov檢驗這20份川木通樣品紅外光譜的相關系數的分布是否符合正態分布。結果表明，P為0088（大于005）。說明這20份川木通樣本紅外光譜相關系數的概率分布符合正態分布。參照正態分布曲線在數理統計中應用的“3σ”準則（Mean±3σ），以這20份川木通樣品紅外光譜相關系數的下限值（0992 6）為川木通真偽鑒別的指標，即待測樣品與川木通紅外光譜指紋圖譜的相關系數大于0992 6，則判別為川木通；否則，不是川木通。

32川木通紅外光譜指紋圖譜真偽鑒別的檢驗

為了檢驗上述建立的川木通紅外光譜指紋圖譜能否鑒別川木通的真偽，本研究用4份川木通驗證集樣品和7份相近中藥（關木通和木通）樣品進行了檢驗。

321對川木通驗證集樣品的判斷在收集的24份川木通藥材樣品中，隨機抽出4份樣品（S3，S4，S8，S24）作為驗證樣品。結果表明，這4份川木通樣品的紅外光譜相似（圖2），共有峰位于3 412～3 392，2 935～2 925，1 737，～1 642，1 509，1 455，1 426，1 376，1 332～1 322，1 261，1 160，1 107，1 035，897，609 cm-1等。這4份川木通樣品的紅外光譜與上述建立的川木通指紋圖譜也相似，在1 800～800 cm-1的紅外光譜與指紋圖譜的相關系數為0993 2～0998 2（表1），均高于0992 6。由此判斷這4份樣品為川木通。

322與關木通的鑒別關木通與川木通、木通的功效相近，曾稱為“木通類”中藥。在2000年版《中國藥典》中，關木通為法定中藥品種，來源于馬兜鈴科植物東北馬兜鈴的干燥藤莖。由于關木通含馬兜鈴酸類成分，具有致突變、致癌和腎臟毒性[78]，2003年4月被國家藥品監督管理局禁用[9]。為了防止關木通混用、誤用為川木通，本研究從不同產地或中藥材市場收集了4份關木通樣品（S25S28），測定紅外光譜，并與川木通的紅外光譜進行比較。結果表明，這4份關木通樣品的紅外光譜相似（圖3），均在3 425～3 414，2 926，1 730，1 621，1 517～1 513，～1 424，1 383～1 376，1 317，1 262，1 154，1 035，895～891，781，～517 cm-1等處具有等吸收峰。但是，關木通與川木通的紅外光譜不同，在具有特征性的1 800～800 cm-1，兩者僅有2～4個共有峰，分別位于～1 426，1 383～1 376，～1 262，1 035 cm-1處。川木通具有1 456 cm-1峰，而在關木通中未發現；并且，川木通在1 376，1 261 cm-1處的吸收峰強于關木通。相反，關木通在～1 619，1 318，781 cm-1等處出現明顯的草酸鈣特征吸收峰[12]（圖4），提示關木通樣品中草酸鈣的含量較高。光譜相似度的比較結果表明，4份關木通與川木通指紋圖譜的相關系數為0902 1～0940 4（表1），均顯著低于判別為川木通相關系數的域值（0992 6）。由此可見，無論從紅外光譜的特征峰，還是相關系數，本研究建立的川木通紅外光譜指紋圖譜均能區別關木通與川木通。

323與木通的鑒別木通和川木通均為2010年版和2015年版《中國藥典》中收載的2種中藥，其功效相同[12]；但臨床應用不同[5]，原植物的來源也不同。川木通來源于毛茛科植物小木通和繡球藤，而木通則來源于木通科植物木通、三葉木通和白木通[12]。由于這2種中藥的名稱相近，藥材性狀相似，容易混淆。為此，本研究分別收集了中藥木通3種原植物的樣品，測定其紅外光譜，與川木通比較。結果表明，木通（S29）、白木通（S30）和三葉木通（S31）的紅外光譜相似，均在3 428，2 929，1 737～1 731，1 623，1 512，1 424，1 376，1 317，1 260～1 256，1 157，1 047，895，781，663，517 cm-1等處具有吸收峰。但是，這3種植物來源的中藥木通與川木通的紅外光譜明顯不同，在具有特征性的1 800～800 cm-1，這2種中藥僅有6個共有峰，分別位于1 509，～1 456，1 426，1 376，～1 261，897 cm-1（圖5）。中藥川木通在～1 159，～1 107，1 035 cm-1處的3個特征峰，而中藥木通（木通、白木通和三葉木通）僅出現2個峰（～1 157，1 047 cm-1）。此外，中藥木通均在～1 623，1 317，781 cm-1處出現1組草酸鈣的特征吸收峰[12]，而在川木通中未發現。紅外光譜相似度比較的結果表明：木通、白木通和三葉木植物的紅外光譜與川木通指紋圖譜的相關系數為0954 9～0978 9，均小于判別為川木通的相關系數域值（0992 6）。由此可見，本研究所建立的川木通紅外光譜指紋圖譜能鑒別川木通和木通。

33川木通與相近藥材二維相關紅外光譜的比較

二維相關紅外光譜可以觀察樣品對外界擾動的響應，獲得比一維紅外光譜更多的信息。隨溫度變化的二維相關紅外光譜可獲得樣品中的化學成分對熱穩定性及其分子結構信息[1314]。為了進一步比較川木通與相近中藥的整體化學成分，本研究在一維紅外光譜的基礎上，比較了川木通與木通和關木通的二維相關紅外光譜，評價川木通紅外光譜鑒別木通和關木通的可行性。

331在850～1 150 cm-1的二維相關紅外光譜川木通、木通、關木通在850～1 150 cm-1的同步二維相關紅外光譜（圖6），在主對角線上（v1=v2）的峰是由動態紅外光譜信號自身相關而得到的自動峰，其強度反映了吸收峰對一定熱微擾的敏感程度。位于非主對角線上的峰為交叉峰；當2個獨立波數處的動態紅外光譜信號彼此為正相關或者負相關（變化同向或反向）時出現，說明化學成分的官能團之間可能存在分子內或者分子間的作用[13]。結果表明，川木通、木通和關木通的二維相關紅外光譜不同。川木通的主對角線上有4個較強的自動峰，所對應的基團振動峰分別位于887，948（最強），978（次強）和1 008 cm-1，說明這些吸收峰所對應的基團隨著溫度升高的變化較明顯。而木通和關木通在對角線上均出現了5個較強的自動峰；木通的自動峰位于916，940，980，1 000（最強），1 147 cm-1（次強），而關木通的自動峰分別位于937，979（最強），1 068，1 086，1 139 cm-1（次強）。

332在1 150～1 500 cm-1的二維相關紅外光譜川木通與木通、關木通在1 150～1 500 cm-1的同步二維相關紅外光譜也不同（圖7）。在川木通的主對角線上有2個較強的自動峰，分別位于1 201（最強），1 303 cm-1；自動峰之間的交叉峰為正相關。而木通對角線上有6個較強的自動峰，分別位于1 198，1 207，1 310，1 320，1 458（次強），1 472 cm-1（最強）；其中，1 320，1 458，1 472 cm-1的自動峰與其他自動峰之間的交叉峰為負相關，其余交叉峰為正相關。關木通的對角線上有3個明顯的自動峰，分別位于1 192（最強），1 213（次強），1 310 cm-1；各自動峰之間的交叉峰也為正相關。由此可見，川木通與木通、關木通在850～1 500 cm-1的二維相關光譜明顯不同；不僅自動峰的數目和強度不同，而且交叉峰之間的相互關系也不同，說明根據二維相關紅外光譜，川木通與木通、關木通也能鑒別。

34紅外光譜的穩定性

對藥材紅外光譜的穩定性進行了考察。用KBr制備的同一樣品片，在同一儀器上連續測定6次，其相似度達0999 9以上；同一樣品片，在同一儀器上連續6 d，每天測定1次，其相似度達099以上；同一份藥材粉末，在3臺傅里葉變換紅外光譜儀上測定，其相關系數也達到099以上。表明紅外光譜的穩定性強。

4結論

川木通為常用中藥，且多為野生藥材。雖然從不同產地、中藥材市場或公司收集的川木通的大小、顏色等性狀特征有差異；但是，他們的紅外光譜的整體峰形、特征峰的位置及強度相似，說明這些不同來源川木通樣品的化學成分相似。由這此樣品計算產生的平均紅外光譜反映了川木通的整體化學信息和光譜特征，且能與相近中藥木通和有毒中藥關木通相區別，可作為川木通的紅外光譜指紋圖譜。經統

1紅外光譜；2自動峰；a 川木通； b 木通； c 關木通（圖7同）。

計分析產生的紅外光譜相關系數的域值可作為川木通真偽鑒別的量化指標。并且，紅外光譜的操作簡便、快速、重現性好。因此，本研究建立的川木通紅外光譜指紋圖譜適用于川木通的真偽鑒別，有利于保證川木通的真實性和中醫藥的臨床療效。

[致謝]四川大學華西藥學院張浩教授，福建中醫藥大學楊成梓副教授，安徽中醫藥大學歐金梅副教授，成都中醫藥大學標本中心提供部分關木通和木通藥材樣品。

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[責任編輯孔晶晶]