微膠囊技術對乳酸菌冷凍保存的研究

何智強

本實驗通過向微膠囊制備過程中添加保護劑脫脂乳粉和海藻糖，以乳酸菌的存活率為考察指標，研究保護劑對乳酸菌微膠囊冷凍干燥情況下的影響情況。首先考察了不同濃度的單一保護劑對微膠囊冷凍干燥后乳酸菌存活率的影響，然后通過正交試驗找出了最佳的保護劑配比，以及能提高乳酸菌在冷凍干燥下的存活率。

實驗方法

乳酸菌的活化。將實驗室保藏的乳酸菌凍干粉接人到11%脫脂乳中的水溶液中，經37℃厭氧恒溫培養24h，脫脂乳凝固。用無菌水稀釋0.1mL凝乳，制得含乳酸菌菌懸液。對菌懸液進行平板劃線分離，37℃厭氧培養24h，這樣連續傳代2-3次，使其充分活化。

復凝聚法制備乳酸菌微膠囊方法。（1）原膠液的制備：取明膠，用蒸餾水適量浸泡溶脹后，加熱溶解；取阿拉伯膠水中加熱至80℃左右，輕輕攪拌使溶解；兩溶液均40℃保溫備用。（2）微囊的制備：在40℃水浴條件下，明膠溶液、乳酸菌菌懸液和適量的乳化劑（吐溫-80）混合，輕輕攪拌均勻。5min后向混合液加入阿拉伯膠溶液，繼續攪拌使明膠和阿拉伯膠溶液充分混合均勻，此時溶液形成穩定的水包油乳液。不斷攪拌下，滴加1%醋酸溶液于混合液中，調節pH至3.8～4.0。（3）微囊的固化：在不斷攪拌下，溶液自然冷卻至30℃左右時，將其置于冰浴中，繼續攪拌至溫度為10℃以下，加入固化劑，繼續攪拌15min，再用10%NaOH溶液調其pH8～9，繼續攪拌20min，觀察至析出為止，靜置待微囊沉降。（4）微膠囊的收集：將固化后的微膠囊用蒸餾水進行洗滌，過篩（320目），收集。

復凝聚法制備乳酸菌微膠囊的最佳工藝條件。菌膠比例1：6，復合膠體濃度15%，凝聚pH值3.8，攪拌速度600rpm，反應時間15min，反應溫度30℃。在此工藝條件下所制備微膠囊對乳酸菌的包埋率為92.5%以上，且制備得到微膠囊呈球形好，粘連性低，粒徑分布均勻。

乳酸菌菌落總數的測定。（1）以無菌操作將經過充分搖勻的菌液25mL放入含有225mL滅菌生理鹽水的滅菌廣口瓶內作成1：10的均勻稀釋液。（2）用1mL滅菌吸管吸取1：10稀釋液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內（注意吸管尖端不要觸及管內稀釋液）。（3）另取1mL滅菌吸管，按上述操作順序，作10倍遞增稀釋液，如此每遞增一次，即換用1支1mL滅菌吸管。（4）選擇2～3個以上適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的吸管移1mL稀釋液于事先滅菌裝有MRS固體培養基的平皿內。（5）同時將1mL滅菌生理鹽水于事先滅菌裝有MRS固體培養基的平皿內作空白對照，以上整個操作自培養物加入培養皿開始至接種結束須在20min內完成。（6）翻轉平板，置37±1℃恒溫培養箱內培養48±3h取出，選取菌落數在30～300之間的平板進行計數。根據該皿內的乳酸菌數，然后乘其稀釋倍數即得每毫升樣品中乳酸菌數。涂布均勻，每個稀釋度作三個平皿。

乳酸菌的存活率。存活率=凍干后微膠囊里活菌數/凍干前微膠囊里的總活菌數×100%。凍干前后微膠囊里活菌數測定：精確稱取凍干前后的微囊各50mg，置于100mL滅過菌的PBS緩沖液中破碎，于37℃恒溫振蕩24小時后，冷卻至室溫，過濾，取清液進行菌落計數

結果與分析

保護劑對乳酸菌微膠囊冷凍干燥的影響研究。

實驗分兩部分：單因素實驗和正交試驗。

脫脂乳粉濃度對微膠囊冷凍干燥的影響。將脫脂乳粉（0g/L，20g/L，40g/L，60g/L，80g/L）分別加入混合乳液中，制備乳酸菌微膠囊凍干品，以冷凍干燥后的乳酸菌的存活率作為考察指標，研究不同濃度的脫脂乳粉對微膠囊乳酸菌存活率的影響。

對脫脂乳粉的實驗組實驗數據進行單因素方差分析可知，乳酸菌微膠囊在冷凍干燥后的活菌數遠高于對照組（加入脫脂乳粉為0的實驗組）（P<0.05），這說明，加入脫脂乳粉對乳酸菌微膠囊凍干保護效果明顯。當脫脂乳粉濃度≤80g/L時，隨著脫脂乳粉濃度的不斷增加，冷凍干燥后的乳酸菌的存活率也隨之增加。其原因可能是：隨著脫脂乳粉濃度的增加，脫脂乳粉對細胞膜的穩定性也斷增加，從而減少了冷凍干燥對乳酸菌的損傷；脫脂乳份濃度增加使得冷凍干燥過程中的多孔結構增加，使脫水更快；其提供的蛋白質和乳糖成分不斷增加，也提高了乳酸菌的存活率。當脫脂乳粉的濃度≥80g/L時，乳酸菌微膠囊在冷凍干燥后的活菌存活率卻略微下降。其可能原因是：當脫脂乳粉的濃度增加時，其粘性也相對的增加，從而影響了乳酸菌的計數。

海藻糖濃度對微膠囊冷凍干燥的影響。將海藻糖（0g/L，10g/L，20g/L，30g/L，40g/L，50g/L）分別加入混合乳液中，制備乳酸菌微膠囊凍干品，以冷凍干燥后的乳酸菌的存活率作為考察指標，研究不同濃度的海藻糖對微膠囊乳酸菌存活率的影響。

正交試驗。在以上單因素實驗的基礎上，選擇各個因素的合適水平進行正交試驗，以冷凍干燥后微膠囊中乳酸菌的存活率為考察指標，篩選出保護劑對乳酸菌微膠囊冷凍干燥影響的最佳濃度配比。

數據通過SPSS12.0軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVE），并通過LSD法檢驗做兩兩比較。以P<0.05為顯著差異。正交實驗通過正交設計助手Ⅱ3.1進行設計。每次實驗均設置3個平行對照。

由上表分析可知：影響乳酸菌微膠囊冷凍干燥菌存活的因素的主次順序是海藻糖含量B>脫脂乳粉含量。單因素方差分析顯示，與對照組相比，所有添加保護劑的試驗中的存活率都提高顯著（P<0.05）。由表可以看出，保護劑最佳含量配比為A₂B₂即脫脂乳粉60g/L，海藻糖20g/L，其A2B，所測得的乳酸菌微膠囊冷凍干燥后的活菌數為9.93×10¹⁰cfu/g，菌存活率為96.7%，比未添加保護劑的對照組提高了近3個數量級，因此通過正交試驗優化出的冷凍干燥保護劑組合能顯著提高凍干膠囊的活菌數。

乳酸菌微膠囊儲存穩定性實驗。將未微膠囊化乳酸菌（A）、未添加保護劑乳酸菌微膠囊（B）、添加保護劑乳酸菌微膠囊（C）、未添加保護劑凍干乳酸菌微膠囊（D）以及添加保護劑凍干乳酸菌微膠囊（E）一起置于冰箱中4℃冷藏條件下，測定微膠囊的存儲穩定性。

隨著儲存時間的延長，乳酸菌的存活率均成不斷下降趨勢。單因素方差分析顯示：所有微囊化乳酸菌實驗組在低溫4℃下存儲60天后存活率與未微膠囊化的乳酸菌相比有顯著差異（P<0.05）。未微囊化的乳酸菌隨著儲存天數的增加，其活菌數急劇下降，60天后其存活率只有9.7%左右；而其他四組微囊化的乳酸菌的活菌數卻下降緩慢，60天后其存活率都保持在80%以上，活菌數仍然維持在10¹⁰cfu/g。微膠囊化能使乳酸菌隔絕外部的氧環境，使其更好的存活，從而顯著提高了乳酸菌在低溫4℃下儲存活性將微膠囊化的四組實驗數據進行對比并單因素方差分析可以看出，添加保護劑凍干微膠囊和添加保護劑微膠囊在低溫4℃條件下存儲60天后的活菌數與未添加保護劑凍干微囊和未添加保護劑的微囊存儲60天后的活菌數比較有顯著差異（P<0.05）。添加保護劑凍干微膠囊在在低溫4℃條件下存儲60天后的活菌數下降最慢，其存活率高達96.1%，活菌數為9.58×10¹⁰cfu/g。添加保護劑微膠囊次之，其乳酸菌的存活率仍然高達93.5%，要比未添加保護劑凍干微囊和未添加保護劑的微囊存儲60天后的菌存活率高出10%左右。因此，添加冷凍干燥保護劑不僅提高了微膠囊冷凍干燥過程中乳酸菌的存活率，而且顯著提高了微膠囊在低溫4℃條件下的存儲穩定性。主要原因可能是：乳酸菌在低溫下處于休眠狀態，其代謝是相對靜止的：保護劑的添加有助于提高乳酸菌微囊惡劣環境的抵抗能力

結論

以微膠囊冷凍干燥后乳酸菌的存活率為考察指標，研究了脫脂乳粉濃度、海藻糖濃度等因素對微膠囊冷凍干燥的影響，并對其影響機理進行了分析。然后，在單因素的基礎上，選取兩因素的合適水平進行正交試驗，篩選出冷凍干燥后提高乳酸菌存活率的保護劑最佳濃度配比。

確定了最佳的冷凍干燥保護劑含量配比：脫脂乳粉60g/L，海藻糖20g/L。在此最佳保護劑含量配比下，所制備的微膠囊冷凍干燥后乳酸菌存活率為96.7%，活菌數為9.93×10¹⁰cfu/g，比未添加保護劑的對照組提高了近3個數量級。

無論是單一的保護劑還是復合保護劑都能夠顯著提高乳酸菌微膠囊冷凍干燥后的活菌數，與未添加保護劑的對照組有顯著差異（P<0.05）。

復合保護劑與單一保護劑相比，能提高乳酸菌微膠囊冷凍干燥后的活菌數。在最佳保護劑含量配比下，所制備的微膠囊冷凍干燥后活菌數9.93×10¹⁰cfu/g比添加單一保護劑海藻糖的微膠囊冷凍干燥后最高乳酸菌活菌數7.81×10¹⁰cfu/g還要高出1倍多。

不同的保護劑各有優缺點，單一保護劑不能滿足菌體抵抗外界惡劣的條件。冷凍干燥過程中添加海藻糖和脫脂乳粉兩種不同的保護劑相互補充，脫脂乳粉可以在細胞的表面形成一個穩定的保護層；而海藻糖形成玻璃態，具有高黏度、較小的自由體積、受限制的分子流動性和在貯存中抵抗相分離和結晶的能力等優點，可以使細胞比通透性降低，從而起到保護作用。

微膠囊在4℃存儲實驗顯示，所有實驗組隨著時間的延長，乳酸菌的存活率均成不斷下降趨勢。而微膠囊化乳酸菌與原菌液相比能顯著提高乳酸菌的存活率（P<0.05）。隨著存儲時間的延長，原菌液細胞存活率急劇下降，60天后只有9.3%，而微膠囊化實驗組存儲60天后存活率均在80%以上?？梢娢⒛z囊化能顯著提高乳酸菌在4℃下的存儲活性。

在4 oc存儲下，添加保護劑冷凍干燥后的微膠囊細胞存活率下降最慢，60天后仍然高達96.1%，活菌數為9.58×10¹⁰cfu/g。而未添加保護劑的微囊細胞存活率下降最快，只有82.6%?？梢?，添加保護劑能顯著提高微膠囊化乳酸菌在4℃存儲活性。