大鼠腦缺血損傷后髓過氧化物酶的活性變化以及蒙藥嘎日迪-13的干預作用

曹麗霞 何靜波 鄭延澤 張浩楠 田彩云 武海軍 楊玉梅

(包頭醫學院心血管研究室， 內蒙古 包頭 014040)

實驗研究

大鼠腦缺血損傷后髓過氧化物酶的活性變化以及蒙藥嘎日迪-13的干預作用

曹麗霞 何靜波 鄭延澤 張浩楠 田彩云 武海軍 楊玉梅*

(包頭醫學院心血管研究室， 內蒙古 包頭 014040)

目的：探討腦缺血損傷后不同時相腦組織和血清中髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的活性變化以及蒙藥嘎日迪-13對其的影響。方法:取雄性SD大鼠360只，將大鼠隨機分為假手術組、腦缺血模型組、嘎日迪-13大劑量組、嘎日迪-13中劑量組、嘎日迪-13小劑量5個組，每組又隨機分為缺血1 h組、6 h組、12 h組、24 h組、72 h組與120 h組6個時相組，嘎日迪-13 大、中、小給藥組分別以1.2 g/100mL、0.6 g/100mL和0.3 g/100mL濃度2mL/100g灌胃，1次/d，連續27d后，采用改良Zea Longa線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型，進行神經功能評分，在各時相規定時間點麻醉大鼠后從腹主動脈采血并取腦組織，采用分光光度法檢測MPO活性。結果:與假手術組比較，腦缺血模型組各時相腦組織和血清中MPO活性都明顯升高(P< 0. 05)，具有顯著性差異；與腦缺血模型組比較，嘎日迪-13大、中、小劑量組各時相腦組織和血清中MPO活性都明顯降低，與模型組比較具有顯著性差異(P<0. 05)，且24h時作用尤為明顯(P<0. 01)。結論:嘎日迪-13可能是通過減少腦缺血損傷后各時相MPO活性，調節各時相炎癥因子相互之間的作用，減輕腦組織損傷，從而發揮對腦缺血損傷的保護作用。

嘎日迪-13；腦缺血；MPO

近年來，腦缺血損傷的研究中主要集中在缺血后的炎癥反應過程。炎癥反應在腦缺血損傷后的病程的發生、發展及預后扮演了非常重要的角色。大量的實驗研究表明，炎癥反應介導了腦組織缺血缺氧損傷，其中白細胞特別是中性粒細胞的聚集、浸潤是炎癥反應發生和發展的關鍵環節。髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO) 活性作為評價中性粒細胞組織浸潤程度的重要指標之一，在近些年來的研究中頗受關注。利用其可以使過氧化氫還原這一特性不僅可以評價酶的活力，而且可定量測定中性粒細胞的數目，從而反映中性粒細胞的浸潤和炎癥損傷程度。本研究室前期已從宏觀、功能、生理、生化等多方面證明[1-2]蒙藥嘎日迪-13對缺血性腦損傷具有明顯的保護作用。本文采用分光光度法觀察了嘎日迪-13對大鼠腦缺血損傷后不同時相腦組織和血清中髓過氧化物酶的活性變化，來進一步探討嘎日迪-13對缺血性腦損傷保護的作用機制。

1 材料

1.1 動物：清潔級SD大鼠(體重150～250 g)，雄性，由北京大學醫學部實驗動物科學部提供，許可證編號SCXK(京)2011-0012。

1.2 藥物與試劑：嘎日迪-13，內蒙古奧特奇蒙藥股份有限公司(金山)蒙藥廠，批號：080905； MPO試劑盒，南京建成生物科技有限公司，批號：A044。

1.3 主要儀器: UV765紫外分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；TGL-16G高速離心機，上海安亭科學技術儀器廠；IYZKM電子恒溫水浴鍋，北京市光明醫療儀器廠。

2 方法

2.1 動物分組及給藥：SD大鼠，雄性，360只。隨機分為5個大組，即假手術組(Sham)、模型組(Model)、嘎日迪-13大劑量組(Garidi L)、嘎日迪-13中劑量組(Garidi M)和嘎日迪-13小劑量組(Garidi S)；每個大組又分為6個小組，分別為1 h、6 h、12 h、24 h、72 h和120 h組，每組12只大鼠。嘎日迪-13大、中、小劑量組分別以2 mL/100g灌胃給藥，給藥劑量分別是0.24 g/kg、0.12 g/kg和0.06 g/kg；假手術組和模型組分別給予等容量生理鹽水。各組連續灌胃27 d，1次/d，末次給藥1h后制備模型，造模后不再進行給藥干預。

2.2 局灶性腦缺血模型的建立：采用線栓法大腦中動脈閉塞方法制備局灶性永久型大鼠腦缺血模型。大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉0.1 mL/100 g麻醉后，取仰臥位固定并用碘伏消毒，在頸正中做切口，分離暴露左側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)。結扎CCA、ECA近心端，于靠近ICA與ECA分叉處剪一V形小口，從CCA向ICA緩慢插入栓線，結扎ICA固定栓線，逐層關閉肌肉縫合皮膚。假手術組僅分離和結扎左側CCA、ECA和ICA，不插入栓線。各組大鼠造模2h后采用Zea Longa[3]評分標準進行神經功能的評分，以出現Homer征(即同側眼球下陷，瞼裂變小，瞳孔縮小)以及1<評分<4分者為模型成功，其他剔除。

2.3 腦組織及血清中MPO活性的測定：在規定時間點，麻醉大鼠后腹主動脈取血，室溫放置2小時，離心取上層血清；斷頭取缺血側腦組織，制備腦勻漿。采用MPO試劑盒測定腦組織和血清中MPO的活性水平。

3 結果

3.1 嘎日迪-13對神經功能評分的影響：神經功能評分結果顯示，假手術組大鼠未出現神經功能障礙，而腦缺血模型組各時相神經功能評分較假手術組顯著升高(P<0.01)，表明大鼠腦缺血模型制作成功；嘎日迪-13各劑量組神經功能評分較同時相模型組比較顯著降低(P<0.01)。見表1。

表1 嘎日迪-13對腦缺血大鼠神經功能評分的影響

與假手術組比較**P<0.01，與模型組比較##P<0.01

3.2 嘎日迪-13對不同時相腦組織和血清中MPO活性的影響

3.2.1 嘎日迪-13對不同時相腦組織中MPO活性的影響：與假手術組比較，各時相腦缺血模型組大鼠腦組織中MPO活性明顯升高，24 h達到高峰，72 h后有所下降，但仍高于假手術組(P< 0. 05)；與腦缺血模型組比較，各時相嘎日迪-13大、中、小劑量組大鼠腦組織中MPO活性明顯降低(P<0. 05)，但增長趨勢和模型組相同，在24 h達到高峰，72 h后有所下降。見表2。

表2 嘎日迪-13在不同時相對局灶性腦缺血大鼠腦組織中MPO活性的影響

與假手術組比較*P<0.05，與模型組比較#P<0.05

3.2.2 嘎日迪-13對不同時相血清中MPO活性的影響：各時相腦缺血模型組與假手術組比較，大鼠血清中MPO活性明顯升高，于24 h達到高峰，72 h后有所下降，但仍高于假手術組(P< 0. 05)；嘎日迪-13大、中、小劑量組大鼠血清中MPO活性較同時相模型組比較顯著降低(P<0. 05)，但增長趨勢和模型組相同，在24 h達到高峰，72 h后有所下降。見表3。

表3 嘎日迪-13在不同時相對局灶性腦缺血大鼠血清中MPO活性的影響

與假手術組比較*P<0.05，與模型組比較#P<0.05

4 討論

腦組織缺血缺氧后會引發一系列的病理改變，其中有關中性粒細胞所引發的炎癥反應過程在近些年來的研究中備受關注。研究表明，炎癥反應是造成缺血后腦損傷的主要原因之一。腦組織缺血早期的炎癥反應會加重神經細胞的損害作用，而晚期炎癥反應對神經細胞的再生和恢復有益[4-5]。中性粒細胞浸潤和活化又是介導腦缺血炎癥級聯反應的重要環節。當中性粒細胞在缺血腦組織中黏附、積聚、浸潤，從而釋放大量的炎癥介質，是導致繼發性腦損傷的主要原因[6]；通過抑制中性粒細胞的黏附和浸潤或使用藥物來減少中性粒細胞的總數能夠減輕缺血性腦損傷[7-8]。MPO是由中性粒細胞、單核細胞和某些組織的巨噬細胞嗜天青顆粒分泌的一種重要的過氧化物酶，它可以特異性標記和激活中性粒細胞[9]。因此，MPO水平及活性變化是評價中性粒細胞在組織中浸潤程度的重要觀測指標[10]。

本實驗結果顯示，模型組大鼠腦組織和血清中MPO活性較假手術組明顯升高，提示MPO參與了腦缺血后神經病理損傷，并且在腦缺血后1h開始表達，24h達到高峰，隨后表達開始降低，這與文獻報道基本一致[11]。本實驗結果還顯示，嘎日迪-13給藥組可顯著降低大鼠腦組織和血清中MPO活性，在腦缺血后24h作用最明顯，提示嘎日迪-13對腦缺血損傷具有保護作用，且大劑量嘎日迪-13的保護效果更為顯著。實驗結果提示，嘎日迪-13可顯著降低模型組大鼠腦組織和血清中MPO活性，改善腦缺血后腦組織和血清中中性粒細胞在缺血區的聚集、黏附和浸潤，從而減輕腦缺血后的炎癥反應發揮對腦缺血損傷的治療作用。

腦缺血后中性粒細胞在體內存在著復雜的相互關系，它們之間通過合成和分泌的相互調節。由此可推測，嘎日迪-13可能是通過調節MPO活性的表達、合成和分泌以及相互之間的誘導或抑制作用，從而起到抑制中性粒細胞在缺血區的聚集、黏附和浸潤，從而減少缺血區域神經細胞的進一步壞死和凋亡，降低腦梗死體積。

[1]武海軍,楊玉梅,何靜波，等.扎沖十三味及其有效組分揮發油對大鼠腦缺血的保護作用[J].中藥藥理與臨床,2012,28(5):190-192.

[2]田彩云,張浩楠,武海軍,等.嘎日迪-13對局灶性腦缺血大鼠 NSE、TNF-α、IL-6 表達的影響[J].中草藥,2015,46(5):716-720.

[3]Zea Longa EL, Weinstein RP, Carlon S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[4]Williams AJ, Dave JR, Tortella FC. Neuroprotection with the proteasome inhibitor MLN519 in focal ischemic brain injury: relation to nuclear factor kappaB (NF-kappaB), inflammatory gene expression, and leukocyte infiltration[J].Neurochem Int, 2006, 49(2):106-112．

[5]Stanimirovic D, Satoh K. Inflammatory of cerebral endothelium: a role in ischemic brain inflammation[J].Brain Pathol,2000,10(1):113-126.

[6]Emerich DF, Dean RL, Bartus RT. The role of leukocytes following cerebral ischemia: pathogenic variable of bystander reaction to emerging infarct[J]. Exp Neurol, 2002, 173(1):168-181.

[7]王知秋,陳銜城,楊國源.小鼠局灶性腦缺血后ICAM-1、Mac-1和MPO活性的變化[J].復旦學報, 2003, 30(4):304-307.

[8]Barone FC, Hillegass LM, Price WJ.?Polymorphonuclear leukocyte infiltration into cerebral focal ischemic tissue: myeloperoxidase activity assay and histologic verification[J].Journal of Neuroscience Research, 1991, 29(3):336-345.

[9]Del GJ, Garcia JH.?Polymorphonuclear leukocyte adhension in cerebrovascular ischemia: Pathophysiologic implications of leukocyte-4 adhension[M].Oxford:Oxford University Press,1995,408-425.

[10]羅武生,郭兆貴.用髓過氧化物酶法定量測定心肌組織中的中性白細胞[J].中國藥理學通報,1990, 6(4):264-266.

[11]張國紅,王春霖,呂平. 大鼠局灶性腦缺血再灌注后不同時間E-選擇素、P-選擇素和細胞間粘附分子-1的表達[J].中國藥理學通報, 2005, 21(10):1218-1223.

2016年9月27日收稿

Changes of myeloperoxidase after Cerebral Ischemia in Rats and Intervention of Mongolian Medicine Garidi-13

CAO Li-xia, HE Jing-bo, ZHENG Yan-ze, ZHANG Hao-nan, TIAN Cai-yun, WU Hai-jun, YANG Yu-mei

Institute of Cardiovascular, Bao Tou Medical Collage, Bao Tou 014040,China

Objective: To investigate the activity of myeloperoxidase (MPO) in brain tissue and serum at different phase after cerebral ischemic in rats as well as the effect of Mongolian Medicine Gridi-13 on them. Methods: A total of 360 male SD rats were selected. They were randomLy divided into sham-operated group, model group, Gridi-13 large dose group, Gridi-13 middle dose group and Gridi-13 small dose group. Each group was randomLy divided into 1 h, 6 h, 12 h, 24 h, 72 h and 120 h time phase group. The middle cerebral artery occlusion (MCAO) model was established by modified Zea Longa thread-occlusion method and the activity of MPO in brain tissue and serum were analyzed by spectrophotometry. Results: Compared with the sham group, model group the activity of MPO in brain tissue and serum at different phase was significantly increased (P<0. 05), has significant differences. Garidi-13 in each dose group could predominantly reduce the activity of MPO in brain tissue and serum at different phase, compared with model group has significant difference (P<0. 05). And the role of 24h is particularly evident (P<0.01). Conclusion: Gridi-13 could predominantly reduce the activity of MPO protect cerebral ischemia injury in rats, which may be related with alleviating neuronal damage, regulating inflammatory factors and relieving the injury of brain tissue to play a role of therapeutic action in cerebral ischemic injury.

Gridi-13; cerebral ischemic; MPO

國家自然科學基金項目，編號81160560

曹麗霞(1990-)，女，碩士在讀，研究方向為中蒙藥藥理與心血管藥理。Tel:18747274656 E-mail: 1550074087@qq.com

*通訊作者： 楊玉梅，女，教授，碩士生導師。E-mail: yym457@yahoo.com.cn

R291.2

A

1006-6810(2016)12-0029-04