葛根總黃酮的提取及其降糖功效研究

方洪帥，王艷蕊，肖茜文，何　苗，王佳男，陳　萍

（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春　130118；2.吉林省安信食品技術服務有限責任公司，吉林長春　130012）

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葛根總黃酮的提取及其降糖功效研究

方洪帥1，王艷蕊1，肖茜文1，何苗2，王佳男1，*陳萍1

（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春130118；2.吉林省安信食品技術服務有限責任公司，吉林長春130012）

摘要：采用乙醇回流法提取葛根總黃酮，通過正交試驗優化提取工藝，確定最佳提取工藝為提取溫度70℃，提取時間2.5 h，乙醇體積分數80％，料液比1∶20。通過α-葡萄糖苷酶活性的抑制試驗測定體外降糖性能，葛根總黃酮對α-葡萄糖苷酶活性抑制率為66.7％。采用四氧嘧啶糖尿病小鼠模型，經不同劑量組葛根總黃酮連續灌胃4周測定空腹血糖值和糖耐量，結果表明葛根總黃酮低、中、高劑量都可顯著（p＜0.05）降低糖尿病小鼠空腹血糖含量，降糖率分別為16.1％，25.6％，23.9％；各給藥組小鼠血糖值在0，0.5，1，2 h時均低于模型對照組小鼠，與模型對照組相比均能顯著（p＜0.05）抑制糖尿病小鼠餐后血糖的升高，改善糖耐量。

關鍵詞：葛根；黃酮；提??；α-葡萄糖苷酶抑制率；血糖

糖尿病是一種常見的代謝性疾病，是目前世界上威脅人類健康的幾大疾病之一。隨著人們生活質量的提高和社會的發展，人類糖尿病發病率呈現出逐年上升的態勢[1-2]。研究表明，許多中草藥對調節血糖和防治糖尿病及其并發癥都有特殊的療效，從藥食同源植物中提取有效成分，研制具有降糖功效的食品有助于預防糖尿病的發生，也在解決人類糖尿病的問題上提供有效途徑。

葛根（Pueraria lobata）是一種藥食同源植物，具有很高的藥用價值，其中葛根總黃酮（Pueraria total flavoniods）是葛根最重要的活性物質，多數研究側重其抗氧化活性。近年來，有關葛根總黃酮降血糖的研究也有一些報道。杜先鋒等人[3]分析得出，葛根中黃酮類含量高并且以葛根總黃酮為原料，配以南瓜、大豆蛋白，經混合調配制成葛根降糖食品。本試驗采用乙醇回流提取法從葛根中提取葛根總黃酮，利用單因素試驗和正交試驗優化提取工藝，開展葛根總黃酮、α-葡萄糖苷酶活性抑制試驗，研究四氧嘧啶誘導的糖尿病小鼠空腹血糖及糖耐量的影響，探索其降糖規律，為葛根有效成分的利用以及促進葛根降血糖產品提供科學依據。

1材料和方法

1.1材料與試劑

葛根（Puerariae lobata），批號20150520，由吉林龍生科技公司生產；還原型谷胱苷肽，北京鼎國生物技術有限責任公司生產；對硝基苯基-α- D -吡喃葡萄苷，上海藍季生物公司生產；蘆丁標準品，天津一方科技有限公司生產；四氧嘧啶，上海瑞永生物科技有限公司生產；阿卡波糖，拜耳醫藥保健有限公司生產；葡萄糖測定試劑盒（批號20150603147），上海榮盛生物藥業有限公司生產。

1.2主要儀器

WD- 2102型自動酶標儀，北京市六一儀器廠產品；N- 1001D- WA型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠產品；H- 2050R型離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司產品；LGJ- 12型冷凍干燥機，北京松源華興科技發展有限公司產品。

1.3試驗方法

1.3.1葛根總黃酮的提取及制備

精確稱取10 g葛根干粉，包成濾紙包，用體積比為1∶30的石油醚溫度于80℃下進行脫脂回流，至虹吸管中溶液的顏色變為無色即為回流終點。取出濾紙包烘干，用乙醇溶液進行提取、過濾、濃縮，用體積比為1∶1的正丁醇溶液萃取2次，分離出上層的有機相溶液進行濃縮，加入100 mL的60％乙醇溶解，置于4℃冰箱內冷藏過夜，醇沉去多糖雜質，過濾后濃縮至浸膏，冷凍干燥得葛根總黃酮[4-5]。

1.3.2葛根總黃酮提取量測定

（1）標準曲線的制定。精密稱取蘆丁標準品5 mg，用60％乙醇溶解并定容至50 mL，得0.1 mg/mL的蘆丁標準液。吸取0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL上述蘆丁標準液至10 mL容量瓶內；加入5％ 的NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，靜置5 min；加入10％ 的Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，靜置5 min；加入4％的NaOH溶液4 mL，搖勻；加入60％乙醇溶液定容至刻度線，搖勻。在508 nm的波長下，測定吸光度。以質量（mg）為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得出線性方程為A=1.454 3X+0.006 7，R2=0.998 0.

（2）葛根總黃酮提取量的計算。將葛根總黃酮提取液用60％乙醇定容至100 mL，精密吸取1 mL，參照標準曲線制定中的操作方法進行反應并測定OD 值A，葛根總黃酮提取量Y（mg/g）計算公式為：

式中：Y——葛根總黃酮提取量，mg/g；

x——反應樣品質量，mg；

N——定容的體積與反應樣液體積之比；

m——稱取的葛根質量，g。

1.3.3葛根總黃酮提取的優化

（1）單因素試驗。在其他條件相同的條件下，分別考察提取溫度50，60，70，80，90℃，提取時間1，1.5，2，2.5，3 h，乙醇體積分數50％，60％，70％，80％，90％，料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，4個單因素對葛根總黃酮提取量的影響。

（2）正交試驗。以葛根總黃酮提取量作為試驗的衡量指標，在單因素試驗的基礎上，采用L9（34）正交試驗設計研究提取溫度、提取時間、乙醇體積分數、料液比4個因素對葛根總黃酮提取量的影響，確定最佳提取工藝條件。

正交因素與水平設計見表1。

表1　正交因素與水平設計

1.4葛根總黃酮體外降糖功效測定

（1）設計反應體系。67 mmol/L PBS緩沖液870 μL（pH值6.8），1 mg/mL谷胱甘肽溶液25 μL，1 mg/mL α-葡萄糖苷酶溶液35 μL，樣品100 μL，37℃水浴反應10 min加入1 mmol/L PNPG 70 μL，37℃水溶反應15 min，然后加入4 mL 0.1 mol/L Na2CO3終止反應，于400 nm處測吸光度[6-7]。

（2）樣品對照組用等量的PBS緩沖液替代酶液。酶組用等量的PBS緩沖液替代樣品液；空白組用等量的PBS緩沖液替代酶液和樣品液；以上4組的其他操作均與樣品組相同。α-葡萄糖苷酶抑制率（％）計算公式為：

式中：A1——樣品組吸光度；

A2——樣品對照組吸光度；

A3——酶組吸光度；

A4——空白組吸光度。

1.5葛根總黃酮對四氧嘧啶型糖尿病小鼠降糖功效測定

1.5.1四氧嘧啶型糖尿病小鼠的建立

選取18～22 g健康的昆明種小鼠100只，雌雄各半，適應性喂養3 d后，禁食（不禁水）12 h，給予腹腔注射四氧嘧啶生理鹽水溶液（200 mg/kg）。正常飼養3 d后再禁食12 h，自由飲水。眼眶靜脈取血，采用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法，測定小鼠的空腹血糖值。選用空腹血糖值在11.1～26.1 mmol/L并有多飲、多食、多尿的小鼠作為建模成功小鼠[8-9]。

1.5.2動物分組及給藥

選取空腹血糖值在11.1～26.1 mmol/L的小鼠60只，每組12只（雌雄各半），隨機分為模型對照組、陽性對照組和葛根總黃酮高、中、低劑量組。陽性對照組給予阿卡波糖80 mg/kg，葛根總黃酮組320，160，80 mg/kg，灌胃體積均為10 mL/kg。另取12只健康小鼠（雌雄各半）為正常對照組，正常對照組及模型對照組灌服同體積的生理鹽水。每天給藥1次，連續4周。分別于第0周、第1周、第2周、第3周、第4周灌胃2 h后（禁食12 h），對各組小鼠眼眶取血測血糖值。

第15天禁食5 h，給藥，15 min后灌胃20％葡萄糖溶液（10 mL/kg體質量），眼眶靜脈取血，分別測定給予葡萄糖后0，0.5，1，2 h的血糖值，進行糖耐量試驗，計算血糖曲線下面積。血糖曲線下面積= 0.25×（0 h血糖值+ 4×0.5 h血糖值+ 3×2 h血糖值）。

1.5.3指標測定

空腹血糖值、糖耐量的測定均參照文獻[10]，按試劑盒說明操作。

1.6統計分析

所有試驗數據均采用PASW Statistics18軟件進行統計分析，各組數據均采用單因素Anova方差分析，結果用平均值±標準差（±s，n=12）表示。

2結果與分析

2.1葛根總黃酮提取單因素試驗結果

2.1.1提取溫度對葛根總黃酮提取量的影響

提取溫度對提取量的影響見圖1。

圖1　提取溫度對提取量的影響

由圖1可以看出，提取溫度為50～70℃時，隨著提取溫度的上升，提取量增加；而提取溫度超過80℃后，提取量有所下降，并且提取液顏色加深明顯?？赡苡捎谔崛囟冗^高，使葛根總黃酮分解，或者提取溫度過高使葛根粉中淀粉、糖類糊化焦糖化，使體系黏度增加，不利于葛根總黃酮的提取。因此，所選提取溫度為70℃。

2.1.2提取時間對葛根總黃酮提取量的影響

提取時間對提取量的影響見圖2。

圖2　提取時間對提取量的影響

由圖2可以看出，提取時間為1～2 h時，隨著提取時間的增加提取量逐漸增加；但超過2 h后，提取量增加緩慢?？紤]節約能源和費用，縮短提取周期和提高設備利用率，選取的提取時間為2 h。

2.1.3乙醇體積分數對葛根總黃酮提取量的影響乙醇體積分數對提取量的影響見圖3。

圖3　乙醇體積分數對提取量的影響

由圖3可以看出，乙醇體積分數為50％～80％時，提取量隨乙醇體積分數的增加而增加；而超過80％后，提取量隨乙醇體積分數的增加而下降；在乙醇體積分數為80％時，提取量達到最大值。因此，選定的乙醇體積分數為80％。

2.1.4料液比對葛根總黃酮提取量的影響

料液比對提取量的影響見圖4。

圖4　料液比對提取量的影響

由圖4可以看出，隨料液比的增加，葛根總黃酮的提取量呈上升趨勢。綜合考慮提取成本，采用料液比1∶20進行后續試驗。

2.2正交試驗結果與最佳組合的確定

正交試驗結果與極差分析見表2。

由表2可以看出，A，B，C，D這4個因素中，極差從大到小依次為C，A，B，D，極差越大則該因素對試驗結果的影響越大，表明4個因素對葛根總黃酮提取量的影響依次為乙醇體積分數＞提取溫度＞提取時間＞料液比。而最適的提取條件為A2B3C2D2，即提取溫度70℃，提取時間2.5 h，乙醇體積分數80％，料液比1∶20。在此組合條件下進行驗證試驗3次，取平均值得出葛根總黃酮提取量為18.2 mg/g。

表2　正交試驗結果與極差分析

2.3葛根總黃酮體外降糖功效測定

葛根總黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制率見圖5。

圖5　葛根總黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制率

按照1.4方法測定葛根總黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制率。由圖5可以看出，隨著葛根總黃酮質量濃度的增大，葛根總黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制率也增大；質量濃度達到8 mg/mL時抑制率增長緩慢，達到了最大值66.7％，表明在8 mg/mL時葛根總黃酮與α-葡萄糖苷酶活性位點的結合達到飽和，因此則葛根總黃酮抑制α-葡萄糖苷酶活性的最適質量濃度為8 mg/mL。葛根總黃酮具有較強的抑制α-葡萄糖苷酶活性，是良好的α-葡萄糖苷酶抑制劑。

2.4葛根總黃酮對四氧嘧啶型糖尿病小鼠的降血糖研究

2.4.1葛根總黃酮對四氧嘧啶型糖尿病模型小鼠空腹血糖值的影響

表3　葛根總黃酮對糖尿病模型小鼠空腹血糖值的影響（±s，n=12）

表3　葛根總黃酮對糖尿病模型小鼠空腹血糖值的影響（±s，n=12）

組別空腹血糖值/ mmol·L-1第0周　　第1周　　第2周　　第3周　　第4周正常對照組模型對照組陽性對照組葛根總黃酮低劑量組葛根總黃酮中劑量組葛根總黃酮高劑量組6.19±0.23 21.79±0.49 14.21±0.45ab15.74±0.49abc14.62±0.40ab14.70±0.31ab注：a與正常對照組相比，p＜0.05；b與模型對照組相比，p＜0.05；c與陽性對照組相比，p＜0.05 5.80±0.21 20.27±0.90 20.66±0.60a18.75±1.15a19.65±1.14a19.31±0.46a6.26±0.51 21.95±0.49 18.31±0.64ab18.92±0.60ab18.39±0.40ab18.74±0.62ab5.99±0.66 21.82±1.40 17.14±0.28ab17.80±0.11abc17.08±0.34ab17.56±0.29ab6.12±0.32 21.39±1.06 16.13±0.34ab17.12±0.78abc15.52±0.56ab16.08±0.98ab

由表3可以看出，陽性對照組和葛根總黃酮組小鼠與模型對照組相比，血糖從第1周開始顯著下降（p＜0.05），之后持續降低，說明葛根總黃酮和阿卡波糖不僅具有降低血糖的作用，這種降血糖作用還具有一定的持續性。至第4周葛根總黃酮高、中、低劑量組小鼠和陽性對照組小鼠的降糖率分別為16.1％，25.6％，23.9％，31.2％，葛根總黃酮高、中劑量組的降血糖效果與陽性對照組相比差異不顯著。

2.2.2葛根總黃酮對糖尿病模型小鼠糖耐量的影響

表4　葛根總黃酮對糖尿病模型糖耐量的影響（±s，n=12）

表4　葛根總黃酮對糖尿病模型糖耐量的影響（±s，n=12）

組別　0 h　7 h　14 h　21 h正常對照組模型對照組陽性對照組葛根總黃酮低劑量組葛根總黃酮中劑量組葛根總黃酮高劑量組血糖值　/ mmol·L-1血糖曲線下面積/ mm215.48±1.26 50.37±1.82a37.63±2.02ab42.07±1.23ab39.50±2.41ab40.54±1.08ab注：a與正常對照組相比，p＜0.05；b與模型對照組相比，p＜0.05 6.12±0.32 21.30±0.91a17.04±0.11a17.69±0.36a17.02±0.24a17.42±0.19a8.65±1.58 27.19±1.71a20.35±1.06ab22.19±1.60ab20.81±2.52ab21.42±1.73ab7.65±1.28 25.19±1.71a19.35±0.96ab21.49±1.20ab19.61±2.12ab20.38±1.33ab7.05±0.58 23.81±0.64a17.36±0.21ab20.61±0.67ab19.25±0.56ab19.69±0.30ab

由表4可以看出，給予不同葛根總黃酮劑量及阿卡波糖的小鼠血糖值在0，0.5，1，2 h時均低于模型對照組小鼠，各給藥小鼠的血糖曲線下面積均明顯低于模型對照組，經統計學檢驗表現為差異顯著（p＜0.05）。這表明葛根總黃酮能抑制糖尿病小鼠餐后血糖的升高，其中尤以葛根總黃酮中劑量組對糖尿病小鼠糖耐量的改善最為明顯。

3　結論

采用乙醇回流法提取得到葛根總黃酮，利用單因素試驗和正交試驗優選出的提取工藝穩定，此法可行，較鉛沉淀提取法、滲濾法、酶解法，不需要特殊設備、操作簡單、安全環保，更適合工業化生產。

現階段發現的降血糖機理主要為2個方面，一個是對降糖代謝過程中α-葡萄糖苷酶活性的調節作用，另一個是對激素水平的調節作用[11]。研究發現，糖尿病小鼠α-葡萄糖苷酶活性增加，這些改變可能是糖尿病小鼠多飲多食、攝入過量的碳水化合物、誘導小腸黏膜消化吸收適應性改變造成。已有研究發現，糖尿病小鼠小腸葡萄糖糖轉運適應性增強[12]。優選出更好的α-葡萄糖苷酶抑制劑，已成為治療糖尿病的有效途徑。通過α-葡萄糖苷酶活性抑制試驗，并且測定糖尿病小鼠空腹血糖值和糖耐量，評價葛根總黃酮不同劑量組的降糖效果，從而分析其降糖規律[13]。研究表明，葛根總黃酮質量濃度為8 mg/mL時能有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性，不同劑量組均能有效降低糖尿病小鼠的空腹血糖值，中劑量組效果接近陽性藥物阿卡波糖，與苗明三等人[8]研究結果基本一致。葛根總黃酮能抑制糖尿病小鼠餐后血糖的升高，明顯降低糖尿病小鼠血糖曲線下面積，顯著增強糖尿病小鼠葡萄糖的負荷糖耐量，可以通過抑制小腸中α-葡萄糖苷酶的活性，降低葡萄糖的吸收，從而降低血糖含量。但有關葛根總黃酮其他降血糖機理還需進一步研究探討。

葛根總黃酮能有效持續地降低糖尿病小鼠的空腹血糖值、增強機體的糖耐量、改善糖尿病的發展，因此研究葛根降血糖以及治療人類糖尿病功能性食品的開發具有良好的理論參考和應用價值。

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Extraction Technology of Puerariae Total Flavonoids and Hypoglycemic Effect

FANG Hongshuai1，WANG Yanrui1，XIAO Qianwen1，HE Miao2，WANG Jia'nan1，*CHEN Ping1
（1. College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun，Jilin 130118，China；2. Anxin Food Technology Services of Limited Liability Company in Jinlin Province，Changchun，Jilin 130012，China）

Abstract：Ethanol reflux method，orthogonal test are used to optimize the extraction technology of total flavonoids from Pueraria. The optimum extraction of Pueraria total flavonoids：extraction temperature 70℃，extraction time 2.5 h，80％ ethanol concentration，material liquid than 1∶20. Hypoglycemic lowering effect is measured in vitro by the inhibitory to the activity of α- Glucosidase. The inhibition rate of Pueraria total flavonoids on the activity of α- Glucosidase is 66.7％，alloxan diabetic mice as model treated with different dose Pueraria total flavonoids for 4 weeks，then determining the blood glucose values and tolerance. The results of the low，medium and high doses total flavonoids of Pueraria all can be significantly（p＜0.05）reduced fasting blood glucose levels in diabetic mice，hypoglycemic rate respectively 16.1％，25.6％，23.9％，each treatment group blood glucose level of diabetic mice in 0，0.5，1，2 h are lower than the model group，they can inhibit the increase of postprandial hyperglycemia in diabetic mice compared to the model group，improveing glucose tolerance，the difference is significant（p＜0.05）.

Key words：Puerariae lobata；flavone；extraction；α- Glucosidase inhibitory rate；blood glucose

*通訊作者：陳萍（1968—），女，博士，教授，研究方向為食品質量與安全。

作者簡介：方洪帥（1988—），男，碩士，研究方向為食品質量與安全。

收稿日期：2016- 01- 12

文章編號：1671- 9646（2016）03a- 0006- 05

中圖分類號：Q503

文獻標志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.03.002