低胰蛋白酶抑制劑活力的白蕓豆α-淀粉酶抑制劑的工業化制備方法探究

讓一峰，趙偉，楊瑞金

1(江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

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低胰蛋白酶抑制劑活力的白蕓豆α-淀粉酶抑制劑的工業化制備方法探究

讓一峰1，趙偉2*，楊瑞金2

1(江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

摘要研究了酸堿處理、熱處理、超高壓、酸沉和超濾對白蕓豆中α-淀粉酶抑制劑(α-amylase inhibitor，α-AI)和胰蛋白酶抑制劑(trypsin inhibitor,TI)活力的影響，旨在為工業化制備低TI活力的白蕓豆α-AI提供指導。α-AI和TI在25 ℃時具有良好的酸堿穩定性(pH 3.00～10.00)。60 ℃時的酸處理對TI活力無顯著影響(P>0.05)，而α-AI活力則會顯著降低(P<0.05)，堿處理對α-AI活力造成的損失大于對TI活力造成的損失。超高壓(200～500 MPa)處理不影響α-AI活力，200 MPa的壓力對TI無顯著影響(P>0.05)，高于200 MPa的壓力顯著增強TI活力(P<0.05)。在酸沉(pH 5.2、4.4和3.6)中，α-AI基本不沉降, TI的沉降率不超過23.77%。截留分子質量為30 000 u的Millipore超濾系統和膜分離中試裝置對白蕓豆水提液中α-AI的截留率分別為98.32%和84.63%，對TI 的截留率分別為27.20%和20.77%。因此，超濾有助于實現白蕓豆α-AI和TI的工業化分離。

關鍵詞α-淀粉酶抑制劑；胰蛋白酶抑制劑；超高壓；超濾

α-淀粉酶抑制劑(α-amylase inhibitor, α-AI)是一類能與α-淀粉酶結合并改變其構象，從而降低α-淀粉酶活力的含氮碳水化合物或大分子蛋白質，普遍存在于各種豆類和谷物之中[1]。其中白蕓豆(White kidney bean)α-淀粉酶抑制劑是一種蛋白類抑制劑，能夠專一性抑制人類唾液及腸道α-淀粉酶，延緩淀粉分解，降低餐后血糖，加之其較強的生理活性和較高的生物安全性，因而被廣泛應用于商業抗肥胖和抗糖尿病等產品中，這些產品在國外被稱為“淀粉阻斷者(starch blocker)”[2]。隨著人們生活水平的提高，肥胖癥和糖尿病的形勢日趨嚴峻[3]，白蕓豆α-淀粉酶抑制劑的應用前景將更為廣闊。

盡管白蕓豆α-淀粉酶抑制劑在控制血糖、降低食欲和減輕體重等方面的作用已被大量動物實驗和人體實驗所證實，但許多“淀粉阻斷者”并不能發揮其應有的生理作用,其主要原因是這些產品中存在著較多的胰蛋白酶抑制劑(trypsin inhibitor, TI)。胰蛋白酶抑制劑是白蕓豆中存在的一種蛋白類抗營養因子，能夠刺激胰臟產生過多的淀粉酶而導致α-淀粉酶抑制劑在體內的生理作用降低或消失[2]。離子交換色譜法和凝膠柱色譜法可以從白蕓豆中制備得到不含有胰蛋白酶抑制劑的活力的高純度α-淀粉酶抑制劑，但色譜法生產周期長，生產成本高，環境污染大，因而難以用于工業化生產，無法滿足市場需求[4]。

本文研究了酸堿處理、熱處理、超高壓、酸沉以及超濾等工業化處理方法對白蕓豆中α-淀粉酶抑制劑和胰蛋白酶抑制劑活力的影響，旨在闡明白蕓豆中α-淀粉酶抑制劑和胰蛋白酶抑制劑在理化性質方面的一些差異，為實現工業化制備少含或不含胰蛋白酶抑制劑活力的白蕓豆α-淀粉酶抑制劑提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料與設備

白蕓豆，購于云南麗江，真空包裝，顆粒飽滿，大小均一；豬胰α-淀粉酶(PPA)、胰蛋白酶、BApNA，美國Sigma-Aldrich；其他試劑均為分析純。

高靜水壓處理系統，內蒙古包頭科發高科技食品有限公司；Millipore超濾系統，美國Millipore公司；膜分離中試裝置，無錫海思瑞科技有限公司；UV-1100型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；PK-820電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；MP-501A超級恒溫循環槽，上海一恒科學儀器有限公司；冷凍離心機，美國Beckman公司；精密pH計, METTLER TOLEDO。高速冷凍離心機，美國Thermo Scientific公司；WK-1000A型高速藥物粉碎機，青州市精誠機械有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1白蕓豆水提液的制備

參照WANG[4]的方法。用高速中藥粉碎機將白蕓豆粉碎，收集過60目篩的豆粉。將豆粉與去離子水按1∶10(g∶mL)的比例于室溫下攪拌提取2 h后，在8 000 r/min，4 ℃下離心30 min，將上清液過120目篩以去除漂浮顆粒后收集清液，即為白蕓豆水提液。白蕓豆水提液的pH為6.39±0.04，α-AI活力和TI活力分別為8.32±0.02 U/mL、822.98±10.03 U/mL。

1.2.2白蕓豆水提液的酸堿處理及熱處理

將白蕓豆水提液用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH 分別調pH至3.00、4.00、5.00、6.39、8.00、9.00和10.00，在25和60 ℃下恒溫攪拌處理30 min后，于冰浴中迅速冷卻至室溫(25 ℃)。用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH將pH調回至6.39，于5 000 r/min，4 ℃下離心15 min后收集上清液，測定其相對α-AI活力和相對TI活力。

1.2.3白蕓豆水提液的超高壓處理

將白蕓豆水提液裝入聚丙烯真空袋中，趕出氣泡，真空熱封包裝后分別在室溫下于200、300、400和500 MPa下保壓10 min，以未經超高壓處理的白蕓豆水提液作為空白對照。將超高壓處理后的水提液于5 000 r/min，4 ℃下離心15 min后收集上清液，測定其相對α-AI活力和相對TI活力。

1.2.4白蕓豆水提液的酸沉

將白蕓豆水提液用1 mol/L HCl分別調至pH 5.20、4.40和3.60后于室溫下靜置1 h，在8 000 r/min，4 ℃下離心15 min后，收集上清液，用1 mol/L NaOH調節pH至6.39后測定α-AI活力和TI活力在上清液中分配比例。

1.2.5白蕓豆水提液的超濾

采用Millipore超濾系統將1 L白蕓豆水提液按以下工藝條件超濾：板式纖維膜；截留分子質量為30 000 u；膜面積為88 cm2；入口壓力為0.12～0.14 MPa；出口壓力為0 MPa；操作溫度為25～35 ℃。測定Millipore超濾系統對α-AI活力和TI活力的截留率。

采用膜分離中試裝置將15 L白蕓豆水提液按以下工藝條件超濾：卷式纖維膜；截留分子質量為30 000 u；膜面積為1.80 m2；入口壓力為0.30 MPa；出口壓力為0.25 MPa；操作溫度為25～35 ℃。測定膜分離中試裝置對α-AI活力和TI活力的截留率。

1.3測定方法

1.3.1α-AI活力測定

參照YANG[5]的方法測定α-AI活力。將0.25 mL α-淀粉酶液與0.25 mL白蕓豆提取液加入到0.5 mL磷酸鹽緩沖液(pH 6.90)中，于37 ℃下預熱10 min后加入0.5 mL 10 g/L淀粉溶液，精確反應5 min后加入1 mL 3,5-二硝基水楊酸，沸水浴10 min后置冰水浴中迅速冷卻，加入5 mL去離子水，在540 nm波長下測定吸光值?？瞻滓粤姿猁}緩沖液代替α-淀粉酶液，對照以磷酸鹽緩沖液代替白蕓豆提取液。1個α-AI活力(1 U)定義為：1 min內抑制1μmol葡萄糖生成所需α-AI的量。相對α-AI活力(%)定義為白蕓豆提取液處理后與處理前α-AI活力的百分比。

1.3.2TI活力測定

采用10 mL體系的BApNA法測定TI活力[6]。將0.4 mL胰蛋白酶液與0.4 mL白蕓豆提取液于37 ℃水浴15 min后，加入2.8 mL BApNA 溶液(用pH 8.2的Tris-HCl緩沖液配制)，精確反應15 min后加入1 mL 30%(v/v)冰醋酸終止反應，定容至10 mL，在410 nm 波長下測定吸光值?？瞻紫燃颖姿?，后加BApNA，對照以Tris-HCl緩沖液代替白蕓豆提取液。1個TI活力(1 U)定義為該10 mL測定體系中抑制0.01個吸光度的增加所需TI的量。相對TI活力(%)定義為白蕓豆提取液處理后與處理前α-AI活力的百分比。

1.4數據分析方法

采用SPSS16.0對數據進行ANOVA單因素方差分析及Ducan’s多重檢驗(P<0.05)。實驗樣本數n=3，在同一組單因素分析中出現大小寫字母時，不同的字母小寫表示α-AI活力有顯著性差異(P<0.05)，大寫表示TI活力有顯著性差異(P<0.05)。

2結果與討論

2.1酸堿處理和熱處理對α-AI和TI活力的影響

圖1為25 ℃時不同pH處理30 min對白蕓豆水提液中α-AI和TI活力的影響。在25 ℃時，pH 3.00～10.00處理對白蕓豆水提液中TI活力無顯著影響(P>0.05)，表明TI在常溫下具有良好的酸堿穩定性。pH 4.00～9.00處理對α-AI活力無顯著影響(P>0.05)，盡管α-AI在pH 3.00、9.00和10.00處理后活力會顯著降低(P<0.05)，但其活力損失率不超過10%，表明α-AI在常溫下也具有良好的酸堿穩定性，但差于TI。

圖1　25 ℃時pH對α-AI和TIA的影響Fig.1　Effects of pH on the activities of α-AI and TI at 25 ℃

圖2為60 ℃時不同pH處理30 min對白蕓豆水提液中α-AI和TI活力的影響。在60 ℃時，酸處理對TI活力無顯著影響(P>0.05)，而堿處理會顯著降低TI活力(P<0.05)，隨著堿性的增強，TI活力損失增大。在60 ℃處理時，pH 6.39的白蕓豆水提液中α-AI活力基本無損失(1.94%)，酸堿處理中其α-AI活力顯著下降(P<0.05)，隨著酸性或堿性的增強，α-AI活力損失增大。相比于酸處理，堿處理對α-AI活力造成的損失更大。在60 ℃時，TI的酸堿穩定性高于α-AI。在相同pH下，TI的熱穩定性高于α-AI。結合圖1和圖2可以看出，升高溫度可以降低α-AI和TI的酸堿穩定性，但是在同樣的處理條件下，α-AI活力損失不小于TI活力損失。

圖2　60 ℃時pH對α-AI和TIA的影響Fig.2　Effects of pH on the activities of α-AI and TI at 60℃

2.2超高壓對α-AI和TI活力的影響

圖3為不同壓力(200～500 MPa)對白蕓豆水提液中α-AI和TI活力的影響。除了400 MPa壓力處理后α-AI活力顯著上升(P<0.05)外，其他壓力處理對α-AI活力無顯著影響(P>0.05)，而且400 MPa壓力處理僅使α-AI活力增加了4.35%，因此可以認為低于500 MPa的壓力不會影響白蕓豆α-AI活力。白蕓豆α-AI主要依靠疏水作用和氫鍵維持其高級結構[2]，而不高于600 MPa的壓力會降低疏水作用而穩定氫鍵[7-8]，白蕓豆α-AI在此壓力下的穩定性可能是其分子內部疏水作用減弱和氫鍵增多相互平衡的結果。200 MPa壓力不會對TI活力產生顯著影響(P>0.05)，當壓力高于200 MPa時TI活力顯著上升(P<0.05)，300 MPa壓力處理對TI活力的增強效果最大，TI活力增加12.64%。超高壓可以促使巰基形成二硫鍵[9]，而白蕓豆TI的二硫鍵是其與胰蛋白酶相互作用的重要部位[10]，這可能是超高壓處理增強白蕓豆TI活力的原因之一。

圖3　不同壓力對α-AI和TI活力的影響Fig.3　Effects of various pressures on the activities of α-AI and TI

2.3酸沉后α-AI和TIA活力在上清液中的分配

圖4為白蕓豆水提液在不同pH(5.20、4.40和3.60)下酸沉后α-AI和TI活力在上清液中的分配情況。

圖4　酸沉pH對α-AI和TI活力在上清液中分配比例的影響Fig.4　Effects of pH on the rates of α-AI and TI activities distributed in supernatants during isoelectric precipitation

盡管白蕓豆α-AI的等電點在4.0～5.2之間[1]，但白蕓豆水提液酸沉后，不低于90%的α-AI活力分配在上清液中，并且酸沉pH對α-AI活力的分配無顯著影響(P>0.05)，表明白蕓豆α-AI在等電點附近幾乎不會沉降。白蕓豆α-AI的這一性質可能是因為其較高的碳水化合物含量(11.8%)使其具備了良好的親水性[5]。隨著酸沉pH的降低，TI活力在上清液中的分配比例顯著減少(P<0.05)，表明酸沉能夠使TI沉淀，但是在酸沉pH為3.6時，TI活力在上清液中的分配比例依然很大(71.62%)，因而酸沉不能有效地分離白蕓豆α-AI和TI。

2.4超濾對α-AI和TIA活力的截留效果

由于白蕓豆α-AI的分子質量為56 000 u，TI的分子質量為8 000 u[2,10]，因此嘗試截留分子質量為30 000 u的超濾膜對白蕓豆水提液進行超濾。Millipore超濾系統對α-AI和TI活力的截留率分別為98.32%和27.20%，說明截留分子質量為30 000 u的超濾膜對α-AI和TI的分離效果良好。Millipore超濾系統是一種小型的超濾裝置，為了驗證超濾在規?；蛛x白蕓豆水提液中α-AI和TI的可行性，采用膜分離中試裝置對白蕓豆水提液進行超濾，其超濾膜的截留分子質量為30 000 u。該中試裝置對α-AI和TI活力的截留率分別為84.63%和20.77%，表明膜分離中試裝置對α-AI和TI的分離效果與Millipore接近。膜分離中試裝置對α-AI和TI活力的截留率均顯著低于Millipore超濾系統(P<0.05)，可能是因為膜分離中試裝置的死體積較大。因此，截留分子量為30 000 u的超濾膜的超濾系統有助于實現白蕓豆α-AI和TI的工業化分離。

圖5　兩種超濾系統對α-AI和TI活力的截留率Fig.5　Retention rates of α-AI and TI activities in two ultra-filtration systems

3結論

以白蕓豆為原料制備得到含有α-AI和TI活力的水提液，研究了酸堿處理、熱處理、超高壓、酸沉和超濾對α-AI和TI活力的影響，得出以下結論：

(1)α-AI和TI在25 ℃時具有良好的酸堿穩定性(pH 3.00～10.00)。60 ℃時TI的酸堿穩定性高于α-AI。

(2)超高壓(200～500 MPa)不影響α-AI活力。200 MPa的壓力對TI活力無顯著影響(P>0.05)，當壓力高于200 MPa時，TI活力顯著增強(P<0.05)。

(3)在酸沉(pH 5.20，4.40 和3.60)中，α-AI基本不沉降，TI的沉降率不超過23.77%。

(4)截留分子量為30 000 u的Millipore超濾系統和膜分離中試裝置對白蕓豆水提液中α-AI的截留率分別為98.32%和84.63%，對TI 的截留率分別為27.20%和20.77%。兩種超濾系統對α-AI和TI的分離效果良好，表明超濾有助于實現白蕓豆α-AI和TI的工業化分離。

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Industrial preparation of white kidney bean α-amylase inhibitor with low trypsin inhibitor activity

RANG Yi-feng1, ZHAO Wei2*, YANG Rui-jin2

1(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Wuxi 214122, China) 2(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

ABSTRACTEffects of acid and alkali treatment, heat treatment, ultra high pressure, isoelectric precipitation and ultra-filtration on the activities of α-amylase inhibitor (α-AI) and trypsin inhibitor (TI) from white kidney bean (Phaseolus vulgaris L.) were investigated to provide directions for the industrial preparation of white kidney bean α-AI with low TI activities. At 25 ℃, both α-AI and TI owned a good pH stability (pH 3.00～10.00). At 60 ℃, acid treatment didn’t significantly affect TI activity(P>0.05)while significantly reduced α-AI activity (P<0.05). The activity losses of α-AI caused by alkali treatment were much larger than those of TI. α-AI activity wasn’t affected by ultra high pressure (200～500 MPa). Pressure at 200 MPa had no significant impact on TI activity (P>0.05)while the activity of TI was significantly enhanced at pressure above 200 MPa (P<0.05). During isoelectric precipitation (pH 5.2, 4.4 and 3.6), little α-AI and less than 23.77% of TI precipitated. When white kidney bean extract was treated by Millipore ultra-filtration system and a pilot-plant membrane separation device with retentive molecular 30 000 u, the retentive rates of α-AI activities were 98.32% and 84.63%, respectively, and the ones of TI activities were 27.20% and 20.77%, respectively. Consequently, ultra-filtration was helpful to realize the industrial separation of α-AI and TI from white kidney bean.

Key wordsα-amylase inhibitor; trypsin inhibitor; ultra high pressure; ultra-filtration

收稿日期：2015-11-20，改回日期：2015-12-04

基金項目：國家自然科學基金(31271977)；中央高?；究蒲袠I務費專項資金(JUSRP 51501)資助

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201604001

第一作者：碩士研究生(趙偉教授為通訊作者，E-mail：zhaow@jiangnan.edu.cn)。