光動力學療法對皮膚鱗狀細胞癌A431細胞增殖及細胞周期的影響

喬　麗, 楊志勇, 許成山， 劉　瑋(中國人民解放軍空軍總醫院皮膚科，北京　004； 中國人民解放軍空軍總醫院中心實驗室)

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光動力學療法對皮膚鱗狀細胞癌A431細胞增殖及細胞周期的影響

喬麗1, 楊志勇1, 許成山2， 劉瑋1(1中國人民解放軍空軍總醫院皮膚科，北京100142；2中國人民解放軍空軍總醫院中心實驗室)

摘要：目的探討5-氨基乙酰丙酸-光動力學療法(ALA-PDT)對體外培養的人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞增殖及其細胞周期的影響。方法以體外培養的人皮膚鱗狀細胞癌A43l細胞株為研究對象，一組為對照組(不處理)，另一組為ALA-PDT組(0.4 mg/ml的ALA避光孵育3 h后行激光照射)，銀染細胞后鏡下觀察，并計算核仁組成區的相對面積；采用流式細胞術分析光動力學治療后各細胞周期中細胞分布比例，并計算增殖指數。結果光動力學治療后A43l細胞株細胞內核仁組成區的相對面積顯著降低。流式細胞儀檢測結果表明光動力學治療組S期峰低于對照組，S期細胞比例顯著降低為(9.2±2.1)%。對照組和光動力學治療組的增殖指數分別為(47.0±3.4)%和(31.1±3.1)%，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)。結論5-氨基乙酰丙酸-光動力學療法能夠抑制A43l細胞株的過度增殖，改變其細胞周期分布。

關鍵詞：光動力學療法；皮膚鱗狀細胞癌；增殖指數；嗜銀蛋白；細胞周期

鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma)簡稱鱗癌，是常見的皮膚惡性腫瘤之一，目前其發病機制尚不十分清楚[1]，其危害性大，激光照射、冷凍、電灼等傳統療法不能完全殺死癌細胞，并且可刺激腫物迅速增生。手術治療雖可完全清除腫瘤，但會在顏面等要求美觀的暴露部位留有瘢痕，給接受美容者造成極大痛苦。光動力治療是一種微創療法，應用ALA-PDT治療癌前病變及皮膚腫瘤的方法在歐美已有較深入的研究與應用，但由于人種等原因國內該方面的臨床應用和研究甚少。細胞增殖與細胞周期及核仁組成區相關嗜銀蛋白(argyrophilic protein in nucleolar organizer regions，AgNORs)的表達關系密切[2]。本研究采用5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，5-ALA)對A431細胞進行光動力學療法(photodynamic therapy，PDT)，通過銀染法檢測A431細胞中AgNORs的表達，并通過流式細胞術分析細胞周期的變化，以了解PDT對A431細胞的影響。

1材料和方法

1.1主要試劑和儀器

試劑5-ALA購于Sigma公司；熒光染料碘化丙啶購于北京德廣興生物科技有限公司；630 nm半導體紅光激光器(桂林興達光電醫療器械有限公司)；LM-93Ⅱ型激光功率計(中國計量院)；Olympus-BH2型生物顯微鏡(日本Olympus公司)；流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2細胞培養

A431細胞(本實驗室保藏)于含10%胎牛血清的DMEM培養基、37 ℃、5%CO2條件下培養，每3 d傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。用0.25%胰酶消化，制成單細胞懸液。按1∶2比例傳代，建立病理性A431細胞的傳代細胞系，實驗用第4-6代細胞，待細胞70%-80%融合時用于流式細胞儀檢測和細胞爬片染色。

1.3PDT處理和實驗分組

將培養的A431分為對照組和PDT組，PDT組的A431細胞與0.4 mg/ml的ALA避光孵育3 h后行激光照射(波長630 nm，功率密度10 mW/cm2，能量密度2.5 J/cm2)，照射前后均監測輸出功率，輸出功率波動范圍<±5%；PDT后繼續將細胞放回孵箱中孵育20 h，再進行下一步實驗檢測。對照組不給予光敏劑和激光照射處理。每組實驗重復5次。

1.4AgNORs檢測方法

AgNORs染色將細胞爬片低滲處理后，加入固定液室溫固定20 min；按要求分別滴加A、B染液，混勻，加蓋玻片，4 min后待染液變為深黃色，取出凈水沖洗，自然晾干；染色的細胞爬片置于圖像分析系統的高倍顯微鏡下，S形移動玻片，計數60個A431細胞核仁銀染面積與細胞核銀染面積灰度比值。

1.5細胞增殖周期檢測

采用熒光染料碘化丙啶一步法染色。細胞處理后消化，PBS洗2次，70%乙醇固定，制成單細胞懸液106/ml，存4 ℃冰箱。上機前0.5 h加碘化丙啶(Sigma)DNA染色。用流式細胞儀進行DNA分析，經熒光光通量積分后得到DNA含量分布曲線，后通過Modfit 3.0軟件進行細胞周期時相分析，統計增殖指數(proliferation index，PI)，表示對A431細胞增殖的影響，其計算公式如下：PI=[(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)]×100%。

1.6統計學方法

2結果

2.15-ALA-PDT對A431細胞中AgNORs的影響

在所有A431細胞核內都可明顯見到AgNORs顆粒，呈棕褐色至深黑色，圓形或形狀不規則，有的周圍有空暈，界限清楚，散在分布，常位于細胞核中央或偏位。對照組A431細胞核內核仁濃染、染色質增多增粗、分布不均勻，可明顯見到銀染顆粒，真皮層A431細胞中核仁與細胞核銀染面積灰度比值為8.264±2.04；治療組A431細胞內AgNORs顆粒較對照組明顯減少(見圖1)，為5.234±1.74，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

A.對照組　　　　　　　　　　　　　　　　　　B.ALA-PDT組圖1　ALA-PDT對A431中AgNORs的影響 (熒光顯微鏡，×200)Figure 1　Effect of ALA-PDT on AgNORs in A431 cells (×200)

2.25-ALA-PDT對A431細胞周期的影響

流式細胞儀檢測結果表明：兩組細胞均以G0/G1期細胞為主峰，對照組A431中S期細胞峰高，為21.2%。PDT組S期、G2+M期細胞峰光滑平坦，S期比例顯著降低，PI含量顯著降低(見圖2)。兩組PI值差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

組別G1期S期G2期PI對照組63.0±5.321.2±2.915.8±2.147.0±3.4ALA-PDT71.7±5.79.2±2.119.1±2.331.1±3.1*

與對照組比較,*P<0.05

A.對照組　　　　　　　　　　　　　　　　　　B.ALA-PDT組圖2　ALA-PDT治療后A431各期細胞比例分布Figure 2　The cell percentage distribution of A431 cells at each stage after treated with ALA-PDT

3討論

PDT殺傷腫瘤細胞可能的機制有以下幾種：PDT光能轉化過程中產生的單線態氧和ROS可以對很多大分子物質，包括蛋白質、核酸等產生損害，引起細胞凋亡或壞死[3,4]；PDT損傷腫瘤血管的內皮細胞，引起腫瘤血管栓塞，導致腫痛組織微循環障礙，腫瘤細胞缺血壞死[5]；PDT能夠刺激機體免疫系統產生免疫反應，對抗腫瘤細胞，比如，T淋巴細胞的功能對于維持PDT抗腫瘤的長期療效是必需的。這幾種機制在PDT引起靶組織的破壞過程中都有一定的作用[7,8]。其作用因光敏劑的不同而不盡相同[9]。但是，至今對這些機制中PDT發揮的確切作用尚無明確的研究能夠表明。

目前研究發現由5-ALA引起的皮膚等正常組織的光敏作用只需要1-2 d就能被消除[10,11]。目前，5-ALA在皮膚癌、食道癌、胃腸道癌及肺癌等領域已經研究相當廣泛，并且已經有相當程度的臨床應用。與目前的手術、化療或放療相比，其具有一定的對腫瘤細胞的選擇性，具有對正常細胞損傷??；無蓄積毒性，可以多次使用，不產生耐藥性；副作用小，可安全應用于老年人和體弱無法手術者等優點。

A431細胞具有腫瘤細胞的特性，處于高增殖、高代謝和高分泌狀態。國外學者認為A431細胞中AgNORs較正常細胞增多，表明A431細胞內DNA轉錄活躍，細胞處于高度增殖和蛋白合成分泌旺盛的狀態[12,13]。為了給細胞的快速生長創造條件，A431細胞對某些糖類、氨基酸等的運送能力比正常細胞要大，細胞膜在細胞與外環境物質交換過程中起著重要作用[14,15]。A431細胞膜的通透性亦高于正常細胞，使ALA易于進入A431細胞。

AgNORs可以早而精確地反映細胞的增殖能力和蛋白質合成狀態，及核仁的結構和功能變化。我們的研究將A431細胞與5-ALA避光孵育后行PDT治療，通過計算AgNORs的相對含量來評估治療效果。細胞銀染后在鏡下觀察到，對照組A431細胞中核仁濃染、染色質增多增粗、分布不均，說明A431細胞核酸代謝強，細胞DNA合成速度快，含量高。而PDT組細胞AgNORs減少，細胞核仁與細胞核銀染面積比值較對照組明顯降低，表明5-ALA-PDT治療后，A431細胞中AgNORs的表達減少，亦即PDT能在一定程度上抑制體外培養A431細胞的增殖能力和代謝功能。細胞周期反映單個細胞的生長過程，正常皮膚細胞主要分布在靜止期(G0、G1期)。從實驗結果可以看到，對照組A431處于增殖狀態(G2、S和M期)，其中S期細胞百分比達到(21.2 ±2.9)%。由于S期是細胞增長的重要時期，其主要特征是DNA合成旺盛，因此高比例的S期細胞，反映細胞的增殖活躍。經ALA-PDT治療后，A431細胞的DNA合成前期持續時間延長，處于G0/G1期的細胞比例升高，而處于DNA合成期的細胞比例降低，表明ALA-PDT可以延緩A431細胞由G1期向S期的過渡，使大多數細胞停滯于DNA合成前期，導致DNA合成障礙，最終致使細胞的數量增長減慢，A431細胞的倍增時間延長，這與鏡下觀察到的AgNORs表達變化相一致。同時，兩組A431細胞的PI值亦相應下降，且差異有統計學意義。這些結果皆表明ALA-PDT改變了各期細胞的分布比例，抑制A431細胞增殖。

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Effect of photodynamic therapy on the proliferation and cell cycle of human squamous carcinoma A431 cells

QIAO Li1, YANG Zhiyong1, XU Chengshan2, LIU Wei1

(1DepartmentofDermatology,AirForceGeneralHospitalPLA,Beijing100142,China；2CentralLaboratory,AirForceGeneralHospitalPLA)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of ALA-PDT on the proliferation and cell cycle of A431 cells. MethodsA431 cells were cultured and divided into two groups. The cultured cells were treated with ALA-PDT in one group(ALA-PDT group), and not treated in the other group(control group). The relative surface of argyrophilic protein in nucleolar organizer regions(AgNORs) was calculated after argyrophilic staining．Flow cytometry was applied to analyze the cell cycle and proliferation index(PI)．ResultsThe relative surface of AgNORs in A431 cells was reduced markedly after ALA-PDT treatment. The cell percentage in S stage was decreased to(9.2±2.1)% in ALA-PDT group, significantly lower than in control group. PI in ALA-PDT group was less than that in control group[(47.0±3.4)% vs (31.1±3.1)%,P<0.05].ConclusionALA-PDT can inhibit the proliferation of A431 cells and change cell cycle of A431 cells.

Key words:photodynamic therapy;epidermal squamous cell carcinoma;proliferation index;argyrophilic protein;cell cycle

[收稿日期：2015-07-10]

作者簡介：喬麗，女，1979-01生，博士，主治醫師，E-mail：winhp2006@163.com.

中圖分類號：R730.261

文獻標志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)01-0051-04

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.01.012