超聲處理抑制鮮切馬鈴薯酶促褐變的機理研究

楊明冠，朱傳合

（山東農業大學食品科學與工程學院，山東泰安　271018）

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超聲處理抑制鮮切馬鈴薯酶促褐變的機理研究

楊明冠，*朱傳合

（山東農業大學食品科學與工程學院，山東泰安271018）

摘要：以鮮切馬鈴薯為試材，通過研究不同超聲處理條件對酶促褐變底物、產物以及多酚氧化酶的影響，揭示了超聲處理抑制鮮切馬鈴薯酶促褐變的機理。結果表明，超聲處理對酶促褐變底物、產物并沒有影響，且能夠顯著抑制多酚氧化酶的酶活力。以超聲功率600 W超聲處理90 min，馬鈴薯多酚氧化酶的酶活力僅為原酶液的54.21%，可見超聲處理抑制鮮切馬鈴薯酶促褐變是通過抑制相關酶的活力來實現。

關鍵詞：鮮切馬鈴薯；酶促褐變；超聲處理；多酚氧化酶

0　引言

鮮切馬鈴薯是指新鮮馬鈴薯經清洗、修整、去皮、切割并包裝成供消費者立即使用的產品[1]。鮮切馬鈴薯作為一種新型的馬鈴薯初加工制品備受消費者青睞，在眾多的微加工果蔬中馬鈴薯的消費量逐漸增大。然而，鮮切果蔬由于切割傷害使得原本區域化分布的酚類物質和酚酶接觸，從而酚類物質被氧化生成鄰苯二醌，繼而轉化為褐色素，導致褐變[2]。酶促褐變是鮮切果蔬最主要的品質問題，導致鮮切產品感官品質下降、營養損失及貨架期縮短，大大限制了鮮切果蔬業的發展。酶促褐變反應的發生，需要同時具備酚類底物、酚酶和氧氣3個條件。因此，可以通過減少酚類物質含量、抑制酶促褐變相關酶的活性以及降低氧氣濃度來控制鮮切馬鈴薯的酶促褐變。例如，抗壞血酸可以通過減少褐變底物抑制酶促褐變[3-4]；熱處理、亞硫酸鹽、靜高壓以及高密度二氧化碳可以通過抑制酶活性來抑制酶促褐變[5-8]；涂膜則可以通過隔絕氧氣抑制酶促褐變[9]。

超聲處理作為一種非熱加工手段已經在食品行業有著廣泛的應用。超聲波是物質介質中的一種彈性機械波，利用其振動能量，可以在介質中產生強大的剪切力和高溫，來改變物質的組織結構、狀態及功能[10]。前期研究已經報道證實了超聲處理可以抑制鮮切馬鈴薯的酶促褐變[11]，但是對超聲處理抑制鮮切果蔬酶促褐變的機理目前尚不清楚。

本試驗以鮮切馬鈴薯為試驗材料，旨在探究超聲處理抑制鮮切馬鈴薯酶促褐變的機理，為了更加系統地闡明超聲抑制鮮切馬鈴薯酶促褐變的機理，采用模擬體系探究了超聲處理對鮮切馬鈴薯酶促褐變底物、產物以及酶促褐變相關酶的影響，從而揭示超聲處理抑制鮮切馬鈴薯酶促褐變的機理，為控制鮮切果蔬酶促褐變提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

馬鈴薯（荷蘭15號），購于泰安市農貿市場，貯藏于4℃的冷庫中備用。馬鈴薯PPO酶粉，購于Sigma公司，L -多巴、L -酪氨酸，均為分析純。

JA2002型電子天平，上海精天電子儀器有限公司產品；KQ- 600DB型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產品；TGL- 18C- C型高速臺式冷凍離心機，上海安亭公司產品；DZKW- C型數顯恒溫水浴鍋，黃驊市卸甲綜合電器廠產品；UV-2102PC型紫外可見分光光度計，上海尤尼柯有限公司產品；Vertex- 70型紅外光譜儀，德國BRUKER公司產品。

1.2分析方法

1.2.1褐變底物結構分析方法

（1）紫外吸收光譜分析法。波長范圍為200～800 nm，光譜帶寬為2 nm。

（2）紅外光譜分析法。采用KBr壓片法，波數掃描范圍4 000～400 cm-1，分辨率2 cm-1。

（3）液質聯用分析法。①色譜分析條件：色譜柱為C18柱（3.5 μm，250 mm×4.6 mm），柱溫30℃，進樣量10 μL，流速1 mL/min，流動相為甲醇-水-冰醋酸。②質譜分析條件：電噴霧離子化源，正離子模式，掃描范圍10～200 m/z，毛細管電壓1.5 kV，霧化氣壓力30 psi，干燥氣溫度300℃。

1.2.2褐變產物量分析方法

由于酶促褐變產物于波長475 nm處有最大吸收峰[12]，故采用△A475表示褐變產物的量。

1.2.3PPO酶活測定方法

采用紫外分光光度法測定PPO酶活。反應體系中依次加入1.8 mL pH值6.6的磷酸緩沖液，1.0 mL 0.5 mmo1/L的L -多巴溶液以及0.2 mL PPO酶液，所加試劑均在30℃溫育15 min，于波長475 nm處進行比色。加酶液后立刻開始計時，每30 s記錄A475值，連續記錄3 min，對照不加酶液，重復測定3次。酶活以1 mL酶液1 min OD值每增加0.001為1個活力單位。

1.3試驗方法

1.3.1超聲處理對酶促褐變底物的影響

超聲處理L -酪氨酸、L -多巴溶液30 min，以不做處理為對照，采用紫外吸收光譜、紅外光譜、質譜對其分析。

模擬酶促褐變體系，在酶的最適反應條件下以超聲功率600 W超聲處理30 min的L -多巴溶液為反應底物，以不做超聲處理的底物溶液為對照，分別加入反應體系測定酶促褐變反應，以△A475表示褐變產物的量。

1.3.2超聲處理對酶促褐變產物的影響

模擬酶促褐變體系，使底物完全反應后加熱滅酶，超聲處理并作對照，以體系中最終酶促褐變產物的量來判斷超聲處理是否對酶促褐變產物有影響。設置2個試驗組，在最適反應條件下加入反應液，加酶液后立刻計時，每1 min記錄A475值，15 min后加熱滅酶，處理組超聲功率600 W超聲處理30 min，對照組在相同溫度下水浴30 min，記錄A475值至20 min，以△A475表示褐變產物的量。

1.3.3超聲處理對酶促褐變反應體系的影響

設置3個試驗組，在最適反應條件下加入反應液，加酶液后立刻計時并記錄A475值。對照組1反應15 min，對照組2和處理組反應3 min后加熱滅酶，處理組超聲功率600 W超聲處理30 min，對照組2在相同溫度下水浴30 min，然后加入等量的酶液記錄A475值至15 min，以△A475表示褐變產物的量。

1.3.4超聲處理對鮮切馬鈴薯PPO酶活力的影響

固定超聲頻率為40 kHz，以鮮切馬鈴薯PPO酶為研究對象，分別研究超聲功率、超聲時間、超聲溫度、pH值對PPO酶活力的影響。

1.3.5數據分析

各項試驗均重復3次，采用DPS 7.05軟件進行方差分析，顯著性水平p＜0.05。

2　結果與分析

2.1超聲處理對酶促褐變底物的影響

2.1.1超聲處理對底物紫外吸收光譜的影響

30℃條件下，采用超聲頻率40 kHz，不同功率超聲處理L -多巴、L -酪氨酸溶液30 min，以不做超聲處理為對照，分別測定其紫外吸收光譜。

超聲處理對酶促褐變底物紫外吸收光譜的影響見圖1。

圖1中（a）、（b）分別是超聲處理對L -酪氨酸、L -多巴紫外吸收光譜的影響。由圖1（a）可知，L -酪氨酸于270～280 nm處有一個明顯的吸收波峰，275 nm處有最大吸收值。由圖1（b）可知，L -多巴于275～285 nm處有一個明顯的吸收波峰，280 nm處有最大吸收值。超聲處理并沒有改變L -酪氨酸和L -多巴的紫外吸收光譜，處理后的紫外吸收光譜與未經超聲處理基本一致。根據圖1顯示，超聲處理對底物紫外吸收光譜基本沒有影響，故后續試驗處理選用超聲功率為600 W。

2.1.2超聲處理對底物紅外光譜的影響

30℃條件下，采用超聲頻率40 kHz，超聲功率600 W的超聲處理L -多巴、L -酪氨酸溶液30 min，以不做超聲處理為對照，分別測定其紅外光譜。

圖1　超聲處理對酶促褐變底物紫外吸收光譜的影響

超聲處理對酶促褐變底物紅外光譜的影響見圖2。

圖2　超聲處理對酶促褐變底物紅外光譜的影響

由圖2（a）可知，超聲處理對L -酪氨酸酚羥基吸收峰（3 205 cm-1）、氨基吸收峰（3 135 cm-1）、苯環上C- H鍵伸縮振動吸收峰（3 000～3 100 cm-1）、羰基吸收峰（1 588 cm-1）、苯環對二取代C- H彎曲振動吸收峰（798 cm-1）、苯環C- H彎曲振動吸收峰（649 cm-1）沒有影響。圖2（b）可知，超聲處理對L -多巴酚羥基吸收峰（3 401 cm-1）、氨基吸收峰（3 210 cm-1）、苯環上C- H鍵伸縮振動吸收峰（3 000～3 100 cm-1）、羰基吸收峰（1 655 cm-1）、苯環1,2,4 -三取代C- H彎曲振動吸收峰（816 cm-1）、苯環C- H彎曲振動吸收峰（676 cm-1）也沒有影響?？梢?，超聲處理對L -酪氨酸、L -多巴的峰形和出峰位置均沒有影響，只是在吸收強度上略有差異。

2.1.3超聲處理對底物質譜的影響

30℃條件下，采用超聲頻率40 kHz，超聲功率600 W的超聲處理L -多巴、L -酪氨酸溶液30 min，以不做超聲處理為對照，分別測定其質譜。

超聲處理對酶促褐變質譜的影響見圖3。

圖3　超聲處理對酶促褐變質譜的影響

圖3中（a）、（b）分別是超聲處理對L -酪氨酸、L -多巴質譜的影響。由圖3（a）可知，L -酪氨酸處理組與對照組的質譜圖基本重合，181 m/z分子離子峰以及主要的峰都沒有差異。圖3（b）中顯示，經過超聲處理的L -多巴溶液質譜圖與對照組也基本重合，197 m/z分子離子峰以及主要的峰都沒有差異。

2.1.4超聲處理底物對酶促褐變反應的影響

30℃條件下，將超聲處理底物（600 W，30 min）及未經超聲處理底物加入酶促褐變反應體系，以A475值為指標表示褐變反應的程度，研究超聲處理底物對酶促褐變反應的影響。

超聲處理底物對酶促褐變反應的影響見圖4。

由圖4可知，處理組與對照組15 min后基本反應完全，反應時間內△A475沒有差異性（p＞0.05），可見超聲處理與未經超聲處理的底物對酶促褐變反應沒有影響。結合處理前后底物的紫外吸收光譜、紅外光譜、質譜推知，超聲處理底物對酶促褐變反應沒有影響。

2.2超聲處理對酶促褐變產物的影響

圖4　超聲處理底物對酶促褐變反應的影響

酶促褐變體系反應15 min后加熱滅酶，作為酶促褐變產物。30℃條件下，超聲處理（600 W，30 min）產物，以未經超聲處理產物為對照，以A475值為指標，研究超聲處理對酶促褐變產物的影響。

超聲處理對酶促褐變產物的影響見圖5。

圖5　超聲處理對酶促褐變產物的影響

由圖5可知，處理組與對照組15 min后基本反應完全，反應時間內酶活曲線基本一致，△A475沒有差異性（p＞0.05），反應15 min后加熱滅酶，A475值有輕微的上升并保持不變。試驗過程中處理組與對照組△A475并沒有差異性，可見超聲處理對酶促褐變產物沒有影響。

2.3超聲處理對酶促褐變反應體系的影響

酶促褐變體系反應3 min后加熱滅酶，以此反應液作為反應中間體系。30℃條件下，將超聲處理的中間體系（600 W，30 min）及未經超聲處理的中間體系加酶液繼續反應，以A475值為指標表示褐變反應的程度，以不做任何處理的反應體系為對照1，未經超聲處理的中間體系為對照2，研究超聲處理對反應體系的影響。

超聲處理對酶促褐變反應體系的影響見圖6。

由圖6可知，對照組1反應時間內與酶促反應進程曲線非常吻合，處理組和對照組2在3.5 min時出現了較大的增幅，這是由于體系中新加酶液使得酶促反應又得以快速進行，3.5 min后反應比較符合酶促反應進程曲線。由圖6可以看出，處理組和對照組2的反應曲線相差不大，△A475并沒有差異性。推知，超聲處理對酶促褐變反應體系沒有影響。

2.4超聲處理對PPO的影響

圖6　超聲處理對酶促褐變反應體系的影響

2.4.1超聲功率對PPO的影響

30℃，pH值6.6條件下，超聲頻率40 kHz以不同超聲功率（240，300，360，420，480，540，600 W）超聲處理60 min，以不做超聲處理為對照，研究超聲功率對PPO酶活力的影響。

超聲功率對PPO酶活力的影響見圖7。

圖7　超聲功率對PPO酶活力的影響

由圖7可知，試驗過程中對照組PPO酶活力很穩定并基本維持不變，以對照組酶活力為100%探究超聲功率對鮮切馬鈴薯PPO酶活力的影響。由圖7可知，超聲處理可以顯著抑制PPO酶活力，并且隨著超聲功率的增大，酶活力迅速降低。在240 W處理條件下PPO酶活力為對照組酶液的93.01%，而以超聲功率600 W超聲處理后PPO酶活力僅為原酶液的66.43%。這與文獻報道的隨著超聲功率增加POD酶、ATP酶活力下降的結論一致[13]。酶活力的高低從根本上取決于酶分子構象的合理程度，高強度超聲處理酶溶液時會產生瞬態空化作用，瞬間產生高溫、高壓、高能量密度沖擊波、微射流等極端物理作用，而酶分子在強大的剪切力和沖擊波的作用下，分子結構被破壞，甚至被剪切成小碎片而表現出酶活力下降甚至失活[14]。

2.4.2超聲時間對PPO的影響

30℃，pH值6.6條件下，超聲頻率40 kHz、超聲功率600 W處理不同超聲時間（15，30，45，60，75，90 min），以不做超聲處理為對照，研究超聲時間對PPO酶活力的影響。

超聲時間對PPO酶活力的影響見圖8。

由圖8可知，試驗過程中對照組的PPO酶活力基本維持不變，隨著超聲時間的延長，馬鈴薯PPO酶活力呈現出下降的趨勢。600 W超聲處理15 min 后PPO酶活力下降幅度較小，酶活力為原酶液的89.70%；而經過超聲處理90 min后PPO酶活力顯著下降，僅為原酶液的54.21%。在一定時間范圍內超聲處理PPO，隨著超聲時間的延長PPO酶活力降幅較大，此后繼續延長超聲時間PPO酶活力的降幅變小，這說明超聲處理一定時間后，繼續延長超聲時間對PPO酶活力的影響較小。這可能是由于高強度超聲場致效應改變了PPO的分子構象，從而導致了酶活力在短時間內迅速降低；由于酶結構具有柔性，繼續延長超聲時間，對PPO結構也不會再有更進一步的影響。

圖8　超聲時間對PPO酶活力的影響

2.4.3超聲溫度對PPO的影響

pH值6.6條件下，超聲頻率40 kHz，超聲功率600 W在不同超聲溫度（20，25，30，35，40，45，50℃）條件下處理15 min，以不做超聲處理為對照，研究超聲溫度對PPO酶活力的影響。

超聲溫度對PPO酶活力的影響見圖9。

圖9　超聲溫度對PPO酶活力的影響

由圖9可知，馬鈴薯PPO最適宜溫度是30℃，超聲溫度過低會抑制PPO酶活力，而超聲溫度過高會破壞PPO的分子構象，從而使酶失活。超聲溫度對超聲處理后PPO酶活力的影響趨勢和未經超聲處理的趨勢相近，并沒有改變PPO的溫度條件，最適溫度仍為30℃。經過超聲處理后PPO的酶活力都較對照組有所下降，在30℃條件下比較明顯，酶活力為原酶液的89.17%。

2.4.4超聲處理下不同pH值對PPO的影響

30℃條件下，超聲頻率40 kHz，超聲功率600 W在不同pH值（5.4，5.8，6.2，6.6，7.0，7.4，7.8，8.2）條件下處理15 min，以不做超聲處理為對照，研究pH值對PPO酶活力的影響。

pH值對PPO酶活力的影響見圖10。

圖10　pH值對PPO酶活力的影響

由圖10可知，馬鈴薯PPO最適宜pH值范圍為6.2～7.0。經過超聲處理后馬鈴薯PPO的最適pH值也是在這一個范圍內，表明超聲處理并沒有改變PPO的穩定pH值條件。試驗中不同pH值條件下超聲處理后PPO的酶活力都較空白有所降低，pH值為6.2，6.6，7.0的條件下，酶活力分別為原酶液的84.37%，88.33%，86.04%。

3　結論

（1）超聲處理對酶促褐變底物、產物沒有影響。

（2）超聲處理并沒有改變PPO的最適溫度、pH值條件，卻可以顯著抑制PPO的酶活力。隨著超聲功率的增大、超聲時間的延長，PPO的酶活力逐漸降低。

（3）超聲處理抑制酶促褐變通過抑制相關酶的活力來實現。

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Study on Mechanism of Ultrasound Inhibiting Enzymatic Browning of Fresh- cut Potato

YANG Mingguan，*ZHU Chuanhe
（College of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Tai'an，Shandong 271018，China）

Abstract：The effects of different ultrasonic treatment conditions on enzymatic browning substrates and products and polyphenol oxidase（PPO）activity of fresh- cut potato are investigated. The results indicat that ultrasonic treatment has no effects on enzymatic browning substrates and products，while potato PPO activity is significantly inhibition treated by different ultrasonic treatment conditions. PPO activity decrease to 54.21% of the original treated by ultrasound at power of 600 W for 90 min. It indicates that the inhibition of ultrasound on enzymatic browning of fresh- cut potato is realized by inhibiting the enzyme activity of related enzymes.

Key words：fresh- cut potato；enzymatic browning；ultrasonic treatment；PPO

*通訊作者：朱傳合（1978—），男，博士，副教授，研究方向為果蔬加工。

作者簡介：楊明冠（1992—），男，碩士，研究方向為果蔬加工。

基金項目：山東省自然科學基金項目（ZR2012CM038）；國家“十二五”科技支撐項目（2012BAK17B05）。

收稿日期：2016- 02- 14

文章編號：1671- 9646（2016）03b- 0001- 05

中圖分類號：TS255.3

文獻標志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.03.027