真菌漆酶的性質、生產及應用研究進展

劉家揚焦國寶有小娟廖祥儒孫利鵬

（1. 黃淮學院生物工程系，駐馬店 463000；2. 河南仰韶生化工程有限公司，三門峽 472400；3. 江南大學生物工程學院，無錫 214122）

真菌漆酶的性質、生產及應用研究進展

劉家揚1，2焦國寶2有小娟1廖祥儒3孫利鵬2

（1. 黃淮學院生物工程系，駐馬店 463000；2. 河南仰韶生化工程有限公司，三門峽 472400；3. 江南大學生物工程學院，無錫 214122）

作為一種含銅的多酚氧化酶，真菌漆酶比細菌漆酶、植物漆酶等具有更好的熱穩定性、金屬離子耐受性及更高的底物催化氧化性，在工農業及環境領域的應用中得到了較高的關注。目前普遍認為，限制漆酶廣泛應用的因素在于漆酶的生產規模、成本與性質。真菌漆酶的生產模式包括固態發酵和液體發酵，工業生產基本以液體發酵為主。除了在染料脫色、染織廢水處理、紙漿漂白等過程中的應用，最新的研究不斷拓展了漆酶新的用途，對近年來真菌漆酶的發酵生產、酶學性質及應用研究中的最新結果進行了概述。

白腐真菌；漆酶；發酵；酶學性質；應用

漆酶（EC 1.10.3.2）是一種含銅的多酚氧化酶，以分子氧作為最終電子受體，能催化一大類酚類及芳胺類物質的聚合、降解及轉化。由于具有廣泛的底物作用性，漆酶作為一種綠色生物催化劑在工業、農業、食品、環保和醫藥等領域均有巨大的應用潛力，具有廣闊的市場前景［1］。漆酶的研究可以追溯到1883年，日本學者吉田發現了漆樹汁液中的一種蛋白可以使汁液氧化變硬?，F在研究表明，漆酶在自然界中廣泛存在，在植物、動物、細菌和真菌中等都發現了漆酶或漆酶的類似物，但其主要生產者還是真菌，尤其是白腐真菌。漆酶在不同來源的生物中起著不同的生理作用。漆酶活性中心含有4個銅原子，在底物的催化過程中起著電子轉移的作用。由于具有廣泛的底物作用性，漆酶已經在很多領域得到應用。本文就近年來真菌漆酶的性質、生產及應用研究作一綜述，供研究者參考。

1 白腐真菌及胞外木質素降解酶系

1.1 白腐真菌

真菌界是生物圈中一個重要的分支，在自然界生物進化及物質的循環中有著不可或缺的地位。木腐菌因能生長在木質材料上引起腐爛或腐朽而得名，英文名為wood-rotting fungi、wood-destroying fungi、wood-decay fungi等［2，3］。根據引起木材腐變類型的不同，可以將木腐菌分為白腐菌（white-rot fungi）、褐腐菌（brown-rot fungi）和軟腐菌（soft-rot fungi）3類［4］。白腐菌能選擇性地降解木材中的木質素或同時降解木質素及纖維素，使白色的纖維素暴露出來呈纖維狀連接，因此木質腐變成白色［5］。常見的白腐真菌有栓菌屬（Trametes）、側耳屬（Pleurotus）、木耳屬（Auricularia）、密孔菌屬（Pycnoporus）和傘菌屬（Agaricus）等［6］。在白腐真菌的研究歷史中較為經典的是黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）［7］。

白腐真菌在自然界生態系統的碳循環中起著非常重要的作用。木質纖維類生物質是自然界中最大的有機碳源庫，主要包括木質素、纖維素和半纖維素等成分。植物在光合作用下固定的碳約有20%用來合成木質素，而這些木質素約占木質干重的25%-30%，纖維素被這些木質素包裹著并與之形成復雜的木材基質，用以保護植物免受微生物的侵染［8］。木質素是一類“頑強的”酚類生物大分子，基本結構單元是苯基丙烷，是形成松伯醇、芥子醇和香豆醇的前體物質［9］，木質素的降解在木材的腐爛及降解中起限制性作用。目前唯一能對木質素進行實質性并徹底降解的微生物就是白腐真菌［10］。

1.2 白腐真菌的胞外酶系

白腐真菌對木質纖維素的降解利用主要依靠其菌絲強大的穿透能力及胞外相關酶系的協調作用而實現。真菌的胞外木質素降解酶系主要包括兩大類：過氧化物酶（peroxidases，PODs）類及漆酶（laccase）。PODs又包括4類：即木質素過氧化物酶（LiP）、錳過氧化物酶（MnP）、versatile peroxidase（VP）和generic peroxidase（GP）［10］。研究表明，這些酶類直接或間接參與木質素的降解，黃孢原毛平革菌的LiP借助其表面的色氨酸殘基（Trp171），通過一系列的電子轉移能夠實現對木質素的直接降解；MnP中的殘基Glu35、Glu39和Asp175，可以結合Mn并發生相關的催化作用［10］。漆酶較LiP與MnP而言存在一定的爭議［11］，有的學者認為漆酶不能降解木質素，只有LiP及MnP才是真正能降解木質素的酶；但同時也有研究表明漆酶失活（deactivation）的鮮紅密孔菌（Pycnoporus cinnabarinus）突變株不具備去除木質素的能力，而野生菌則可以有效對紙漿漂白及脫除木質素［12］。白腐真菌中通常含有5-26個這些酶的基因拷貝，因此能有效地降解木質素，褐腐菌卻沒有［10］。某些真菌如扁韌革菌可同時分泌漆酶、LiP和MnP［13］，然而并非所有的白腐菌都能同時分泌這3種酶，如灰隔孢伏革菌僅分泌漆酶［14］。

2 漆酶簡介

2.1 漆酶來源及分泌形式

漆酶（EC 1. 10. 3. 2）是一種多酚氧化酶，可氧化酚類和芳香胺類化合物，同時將分子氧還原成水，是一種綠色催化劑。漆酶最早于1883年在漆樹的汁液中發現，后來研究表明漆酶其實廣泛存在于自然界中，如植物、真菌、細菌、動物及昆蟲中［15］。進一步的研究表明，漆酶屬于銅藍氧化酶家族，其活性中心和抗壞血酸氧化酶、血漿銅藍蛋白及膽紅素氧化酶的活性中心極為相似［16，17］。漆酶在不同的生物體中充當著不同的角色，主要參與木質化、去木質化、真菌形態發生、去毒、植物感染和植物氧化脅迫等過程［15］。自然界中真菌是漆酶的主要產生菌，包括擔子菌、子囊菌及半知菌等，其中又以是擔子菌門的白腐真菌為主［2］。漆酶一般以同工酶的形式被分泌出來，少數真菌僅分泌1種漆酶，多數真菌會分泌2種甚至更多種的同工酶，如灰隔孢伏革菌可分泌8種漆酶同工酶［14］。漆酶同工酶的分子量、活力和等電點等極為相似，其最大的不同在于其表達量及穩定性有差異［18，19］。此外，即使是同一種真菌，當以不同的形式生長時，所產的漆酶也會有差異，如香菇（Lentinula edodes）有分泌型的漆酶lcc1及在子實體中的形式lcc4（非分泌型）［20］。這可能是真菌適應生存環境的一種機制。

2.2 漆酶的活力測定方法

由于漆酶具有廣泛的底物特異性，因此測定漆酶活力的方法較多。目前常用的方法主要有分光光度法［21］及HPLC法等［22］。用分光光度法測定漆酶的活力時常見的底物有ABTS、丁香醛連氮、阿魏酸、DMP及愈創木酚等［23］。不同來源的漆酶對不同底物的親和力及催化能力不同，表現出不同的Km和Vmax；同一種酶用不同的底物測定所得出的酶活力也相差較大。以酚類物質為底物測定漆酶的活力時，容易受到酚類物質自氧化的干擾，尤其在酶活力低到一定范圍時干擾更大［24］。酶活的測定方法不同，酶活力的定義也不同，漆酶的活力一般定義為1 min內催化1 μmol底物或產生1 μmol產物所需要的酶量，但也有人用反應體系在最大吸收波長處的吸光值每增加1為一個酶活單位［25］。目前有關漆酶的文獻中，使用的漆酶測定方法及測定體系差異較大，對酶活、產量之間的比較存在一定的難度［26］。

3 真菌漆酶性質及結構特征

3.1 漆酶的理化特性

3.1.1 漆酶的分子量 真菌漆酶的分子量一般在50-90 kD之間，尤其在擔子菌漆酶中比較普遍［6，27-29］。最近的研究還發現了小分子量的漆酶，如灰隔孢伏革菌所分泌的同工酶中分子量較小的僅有26.2 kD［14］。

3.1.2 漆酶的等電點 真菌漆酶多為酸性蛋白，如灰隔孢伏革菌所分泌的同工酶其等電點為3-6之間［14］，雜色云芝漆酶等電點為4.2［27］，密孔菌L3漆酶等電點為4.7［28］。也有報道發現等電點為堿性的真菌漆酶，如側耳屬真菌POXA1a與POXA1b漆酶的等電點分別為6.7及6.9［6］。

3.1.3 漆酶的糖基化 漆酶一般都有不同程度的糖基化，其含糖量為10%-30%，分子中的糖可能為阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖及葡萄糖的一種或多種［30］。Phanerochaete flavido-alba漆酶分子量為98.7 kD，去掉糖基后變為81.3 kD，即含糖17.7%［31］，然而番茄灰霉菌漆酶的含糖量可高達70%［30］。糖基可能對胞外漆酶的分泌、活性中心的維持、防止蛋白酶的降解、溫度穩定及pH穩定等構像有重要影響［32，33］。漆酶的活力除受菌種來源的影響外，可能還受糖基化及含糖量的影響。

3.1.4 漆酶的氧化還原電勢 真菌漆酶一般低于漆樹漆酶的氧化還原電勢，表現出更高的催化活性。影響漆酶氧化還原電勢的因素很多，如分子量、與銅原子配位的氨基酸的差異等。真菌漆酶的氧化還原電勢一般為0.4-0.8 V，其中又可以分為兩類：0.4-0.6 V為低電勢，如灰蓋鬼傘漆酶；0.6-0.8 V為高電勢，如云芝漆酶，其分子中I銅原子附近獨特的結構使得該漆酶具有較高的電勢，為0.78-0.79 V［15］。某些真菌如擔子菌C30漆酶的電勢非常低，僅有0.17 V［34］。

3.1.5 漆酶的最適反應條件（溫度、pH值） 漆酶的最適反應溫度和pH值具有很強的底物依賴性。最適反應溫度普遍偏高，50-80℃較為常見，如密孔菌L3漆酶催化不同底物的最適溫度在55-75℃之間［28］。Zhang等［35］研究的云芝漆酶，以DMP為底物時最適溫度則高達85℃。有些真菌漆酶則嗜好較低的催化溫度，膠質射脈革菌（Phlebia tremellosa）漆酶的最適溫度僅為20℃［36］。大多數漆酶在酸性的環境下能發揮其最大的催化活性，最適pH值在2-5之間［28］。個別真菌漆酶的最適pH值在中性，只有極少數的真菌漆酶在堿性的條件下有高效的催化能力，如Panaeolus papilionaceus漆酶以DMP為底物時的最適pH值為8.0［6］。

3.1.6 漆酶的穩定性（溫度、pH值） 真菌漆酶普遍具有良好的熱穩定性。云芝栓菌漆酶在65℃和75℃下的半衰期分別為5 h和70 min［35］，朱紅栓菌漆酶在70℃時的半衰期為60 min［37］，密孔菌漆酶在70℃及60℃時的半衰期分別為3 h、5 h［28］。盡管大部分漆酶都在酸性范圍內有最高的催化效率，很多真菌漆酶在中性及偏堿性條件下（pH值為6-10）保存比較穩定［28，38］。通過對漆酶進行固定化可以有效提高漆酶對溫度、pH值及抑制劑等的穩定性，擴大漆酶的應用范圍［39］。

3.1.7 漆酶的激活及抑制 漆酶的活性會受到金屬離子如銅離子、錳離子等的激活，有的則被抑制。鐵離子、銀離子及汞離子通常抑制漆酶的活性［28］。此外，鹵化物、硫化物、碳酸鹽、有機溶劑等也可抑制漆酶活性［15］，如二硫蘇糖醇、巰基乙醇、疊氮化鈉、L-半胱氨酸和碘化鉀等對漆酶抑制效果比較大，有機溶劑中甲醇、乙醇和乙腈等對漆酶影響不大，二甲亞砜則明顯抑制漆酶的活力［19，38，40］。不同的抑制劑對漆酶的抑制機理互不相同，如羥基甘氨酸和脂肪酸通過阻礙底物進入漆酶的結合部位而抑制了漆酶的催化能力，鹵化物則阻礙了電子通往三核銅位點的路徑［15］。

3.2 漆酶的催化特性

漆酶具有廣泛的底物作用性，能催化一系列底物的氧化，諸如單酚、二酚、多酚、二胺、芳香胺、甲基酚、抗壞血酸及非酚類的化合物等［41］，其主要機理為通過單電子的轉移體系并伴隨著分子氧作為電子受體進而被還原為水［42］。漆酶分子中的銅離子在催化過程中起著重要的作用，漆酶介導的催化過程主要有3步：（1）底物將I類銅離子還原；（2）I類銅離子將電子傳遞給含有二類和三類銅原子組成的三核中心；（3）在三核中心氧被還原為水（圖1）。

漆酶催化不同的底物時其機理不盡相同，小分子酚類化合物如α-萘酚、兒茶酚等通常在漆酶的介導下形成二聚體、三聚體等聚合物并進一步發生沉淀［43，44］。當小分子介體（如HBT）存在時，漆酶對酚類化合物的聚合作用常被抑制，而漆酶對這些化合物的降解作用則占主導［45］。但對于某些非酚類大分子，如環境中的污染物、激素和染料等，漆酶則無法直接作用。漆酶的氧化還原電勢比非酚類化合物的氧化還原電勢低，因此漆酶通常不能催化此類底物的氧化或分解，但如果存在電子轉移介體的情況下，漆酶也可以作用于非特異性底物［46］。介體可以起著橋梁的作用，首先被漆酶氧化，然后再介導底物的氧化。常見的介體有：ABTS、1-hydroxybenzotriazole（HBT）、N-hydrox yphthalimide（NHPI）、3-hydroxyanthranilic acid和violuric acid（VIO）等［3，47］。漆酶介體體系（LMS）已被廣泛地用于紙漿的脫木質素、燃料電池、有機污染物的轉化、生物傳感器及染料的降解等。

圖1 漆酶對酚類底物催化的過程

圖2 Trametes versicolor漆酶的空間結構（二級結構）

3.3 漆酶的結構特征

到目前為止，已經有很多真菌漆酶被結晶出來用以結構分析。下面以Trametes versicolor為例對漆酶的空間結構做一說明：如圖2［48］，漆酶分子成球形（大小為7 × 5 × 5 nm），主要由折疊結構組成，其次有少量的無規則卷曲和極少量的螺旋結構；漆酶分子中有3個結構域，T1銅離子（Cu 1）位點位于第3個結構域，T2/T3銅離子（Cu2、Cu3a和Cu3b）位于另外兩個結構域的交界處，為三核中心；漆酶為糖基化蛋白，糖結合位點分別位于N54、N217、N333及N436；催化疏水口袋位于左側中間位置，在Cu1附近，該處的電子云密度比較稀疏，有較大的空間來容納底物，如底物2，5-二甲基苯胺（左側中間的棍棒結構）；漆酶催化底物時，從底物獲得電子（His 458起著重要的作用），然后將電子從Cu1位點傳遞到Cu2/Cu3位點的三核中心，氧配位結合在Cu2/Cu3位點處，在此處氧被還原成水。也有研究發現雜色云芝（Coriolus versicolor）漆酶二級結構中含有更多的α-螺旋（68%），并非β-折疊［27］。

4 漆酶的生產

研究表明，真菌既可以固態培養也可以液態培養，但二者在漆酶產量及生產成本等方面具有差異，目前漆酶的生產多采用液態發酵方法。

4.1 真菌漆酶的生產周期

大部分真菌在培養的初始階段僅有菌體的生長而幾乎沒有漆酶的分泌，漆酶的大量合成主要集中在培養的第二階段，即漆酶為次生代謝產物［13］，因此真菌漆酶的生產周期普遍較長，幾天甚至幾十天。扁韌革菌在第4 d時到達產酶高峰（約25 U/mL）［13］，密孔菌L3液體培養6 d后產酶72 U/mL［49］，栓菌在第6 d時最高酶活為18 U/mL［50］，虎皮香菇菌在優化后的培養基中培養11 d時產酶2.2 U/mL［51］，Lentinus sp.在培養16 d時酶活達到58 U/mL的最高活力［38］，木硬孔菌則需要24 d的培養時間達到產酶高峰［52］。與液體發酵相比，固態培養真菌產漆酶所需要的周期更長，如側耳需要50 d［53］，密孔菌L3以柳枝稷（switchgrass）為培養基質時分泌漆酶的高峰在36 d［54］。

4.2 培養基組成的影響

培養基的組成對真菌分泌漆酶的影響較大，尤其是碳源和氮源，其中碳氮比對漆酶分泌的影響尤其顯著，一般在“氮饑餓”時漆酶的分泌會增強［55］。真菌用于自身生長及合成漆酶所需要的碳源有：甘油、葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、纖維二糖、蔗糖、纖維素及一些木質纖維類生物質等。常用的氮源包括：酒石酸銨、磷酸氫二銨、氯化銨、尿素、酵母膏、豆粕和玉米漿等［14］，其中有些不僅可充當氮源，同時具有漆酶誘導劑的作用，如玉米漿等［56］。

4.3 培養條件的影響

影響微生物發酵產漆酶的培養條件主要有溫度、pH值、轉速和接種量等。大部分漆酶產生菌嗜好的培養條件為：轉速150-250 r/min，溫度25-35℃，培養基pH值2-6［57，58］，如Lentinus sp.相對喜歡較低的溫度（25℃）和轉速（150 r/min）［38］。真菌產漆酶的最適初始pH值多為酸性?；⑵は愎降呐囵B基初始pH值為5.0，培養溫度28℃，搖瓶轉速140 r/min［51］。在機械攪拌式發酵罐上，轉速對大部分真菌生物量及漆酶的產量影響較大，但有的真菌則不受影響［2］，如Fenice等［59］發現虎皮香菇在3 L攪拌式發酵罐中培養時最佳的轉速是500 r/min。培養基中的溶氧水平受轉速及通氣量的影響（在搖瓶中主要受轉速的影響），攪拌式發酵罐上通氣量為1.0 VVm（即每分鐘的通氣量等同于培養基的體積）時似乎對很多真菌的產酶都有利。

4.4 提高漆酶產量的策略

對漆酶進行誘導是提高漆酶產量常用的方法，其中銅離子［51］、醇類［60］、芳香族化合物等常被用作漆酶的誘導劑［56，61］。誘導劑的添加時期也是影響漆酶分泌的因素之一，如Lentinus sp.是在培養3 d后添加終濃度2 mmol/L的二甲基苯胺來對漆酶進行分泌誘導［38］。反轉錄PCR分析表明，二甲基苯胺等通過提高漆酶基因的轉錄水平而使漆酶的分泌水平提高，而芳香化合物則可能是激發了漆酶啟動子上的外源化合物響應原件（XRE），進而促使漆酶大量的分泌［51］。

4.5 漆酶的生產規模

目前關于漆酶的生產研究大部分集中在搖瓶水平上，僅有少部分菌株在發酵罐水平上得到嘗試，整體發酵規模偏小。在發酵罐水平上比較有潛力的真菌菌株主要是栓菌屬（Trametes）和密孔菌屬（Pycnoporus）［2］。單色云芝在20 L攪拌式發酵罐中生長14 d后達到最高的漆酶產量142 000 nkat/L［62］，絨毛栓菌在20 L攪拌式發酵罐中產酶高達333 U/mL，流加后產生更高的酶活力740 U/mL［63，64］。Liu等［49］在65 L氣升式發酵罐中培養Pycnoporus sp. SYBC-L3菌株，在第6 d達到漆酶最高活72 U/mL。

4.6 漆酶的異源表達

由于漆酶的后加工過程比較復雜，其中涉及引導肽的切除等過程，因此真菌漆酶一般需要在真核生物中異源表達［2］。真菌漆酶由1 500-2 500 bp左右的核苷酸編碼520左右的氨基酸所組成，如Lentinus sp.漆酶lcc3的cDNA包括1 563 bp的堿基，編碼含有521個氨基酸殘基的多肽［38］。真菌漆酶基因一般包含數量不等的外顯子，如虎皮香菇漆酶lac1和lac2的基因分別有9個和4個外顯子［51］?，F在已經有很多真菌漆酶的基因被克隆并在黑曲霉及李氏木霉等菌株中異源表達［2］。此外，漆酶基因的表達具有一定的宿主選擇性，如香菇漆酶基因在Escherichia coli、Saccharomyces cerevisiae和Pichia pastoris中表達出的蛋白雖具備了和漆酶相似的大小，卻沒有漆酶的活性，在Aspergillus oryzae中卻能成功表達并分泌至胞外［20］。

相對液態發酵，固態發酵成本較低，因此也常被采用，尤其是在農業廢棄物的資源化利用方面。Sharma等［65］用麥糠為固態培養基質，在添加礦物質鹽溶液后于搪瓷盒中培養靈芝真菌，5 d后得到漆酶活力高達11 589 U/g基質，發酵規模達到10 kg基質。

5 漆酶的應用

漆酶在工農業生產及環境保護中具有潛在的應用價值，近年來的研究在漆酶的應用方面有了新的進展。

5.1 造紙工業

在漂白過程中去除木質素可提高紙張的質量及色澤，傳統的紙漿漂白過程采用氯化物對木質素選擇性的降解，但副產物如二噁英等則對環境形成一定的負面影響。漆酶及漆酶介體系統（LMS）可以作為傳統試劑的替代劑對紙漿處理達到較好的漂白效果［66］。Sharma等［65］研究發現在紙漿漂白過程中依次使用木聚糖酶及漆酶比單獨使用二者更有效，能減少過程中35%的二氧化氯使用量，提高紙漿性能（撕裂指數增加15.7%，褪色值降低50%），并使最終廢液的可吸附有機鹵化物含量減少34%。

5.2 食品工業

漆酶還能有效地降解黃曲霉毒素（AFB1），這對于控制食品中的生物毒素水平具有重要的價值［67］。聯合使用漆酶和納米顆粒（如氧化鋱Tb4O7）可以作為酒中多酚物質檢測的一種新方法［68］。此外，由于漆酶具有催化酚類化合物及同時消耗氧的特點，其在凈化水質及防止食品變質等方面也有應用。

5.3 染料脫色

合成類染料種類繁多、結構復雜且難降解，具有生物毒性及致畸作用，利用漆酶能有效地對染料進行降解，且多數在10 min內即可達到80%以上的脫色率［38，69］。在廢水處理過程中，可利用酶的固定化技術提高效率、降低成本。如將漆酶分子上的氨基與聚苯醚砜分子上的環氧樹脂基共價結合獲得固定化漆酶可降解酸性紅染料，降解率可達88%以上［70］。在小分子介體如丁香醛連氮或草酸鹽等的參與下，漆酶對染料的降解速率可明顯提高［14］，也有報道發現介體如ABTS等對脫色過程沒有明顯的促進作用［71］。某些真菌可以利用染織廢水作為培養基，在添加農業廢棄物刺激后生產胞外漆酶，實現同步脫色的效果［72］。菌株對染料的脫色過程中，生物降解與菌體吸附同時起作用，提高了脫色效果［73］。

5.4 生物修復

漆酶在去除環境水體及市政污水中的固醇類激素方面表現出了潛力，這些激素包括雌酮（E1）、雌二醇（E2）、雌三醇（E3）［74］。在橄欖油生產過程中排放的廢水中含有多種酚類化合物、漆酶及介體系統可以將大部分此類化合物轉化、降解［75］?？股氐人幬镌谡婢崦傅拇呋乱部捎行コ?6］。

5.5 化學合成

漆酶能將底物3-氨基-4-羥基苯磺酸（AHBS）聚合，形成新的產物吩惡嗪酮染料（phenoxazinone dye）［77］。4-氟-2-甲氧基酚（4-fluoroguaiacol）在漆酶的介導下通過去氟、聚合反應生成具有熒光性的物質，在膠片生成方面表現出了巨大潛力［78］。乳清蛋白和甜菜果膠在漆酶的參與下發生共價偶聯、聚合和乳化等可形成大小為109 nm的納米顆粒［79］。

5.6 醫藥方面

Zhang等［80］用大傘杯漆酶對腫瘤及HIV反轉錄酶活性進行抑制能力研究發現，隨著漆酶用量的增加（2.5-20 mmol/L），Hep G2和MCF-7細胞都受到了不同程度的抑制，抑制率分別為9.1%-80.5%及40.2%-95.4%，對這兩種細胞的IC50分別為12.3和3.0 mmol/L；在漆酶濃度為20 mmol/L時對HIVRT的抑制達到70.4%，IC50值為14.4 mmol/L。漆酶能轉化某些酚類底物生產抗菌素，如將4-甲基-3-羥基鄰氨基苯甲酸轉化成放線菌素（actinocin），該產物通過阻斷腫瘤細胞DNA的轉錄而起到對抗癌癥的功效［81］。

5.7 園藝

沙質土壤出現斥水性（SWR）是高爾夫球場草坪維護管理中的難題之一，斥水土壤將導致草皮的大面積死亡進而導致草坪質量下降及管理成本增加。最近的研究發現，漆酶處理斥水性較強的高爾夫球場淺層土壤可以有效去除其斥水性，有望結合或替代傳統保水劑的使用來提高草坪的管理水平、降低管理成立成本［82，83］。同時漆酶的噴灑可以減少草坪淺層土壤中的有機層厚度及有機質含量（thatch），利于草坪的生長及維護［84，85］。

6 結語

高效率、規?；a是實現漆酶廣泛應用的前提。在自然界中產漆酶的菌株雖多，但能進行大規模工業化生產的菌株卻較少，通過篩選自然菌株乃至對原始菌株改造有望滿足不同領域的需求。此外，從實驗室的搖瓶水平到小型發酵罐上的中試水平、再到工業化的生產水平還有一道很大的鴻溝，過程優化控制及工藝放大是規?；a的必要環節。在未來的研究中，漆酶應用領域的不斷拓展必然推動新型漆酶的開發與研制，通過代謝工程學、分子生物學、結構生物學等研究進一步深入了解漆酶，利用定點突變技術對漆酶分子在蛋白質水 平上進行改造等獲得具有特殊性質、功能的漆酶是新的趨勢。

［1］司靜, 李偉, 崔寶凱, 等. 真菌漆酶性質、分子生物學及其應用研究進展［J］. 生物技術通報, 2011（2）：48-55.

［2］Couto SR, Toca-Herrera JL. Laccase production at reactor scale by filamentous fungi［J］. Biotechn ol Adv 2007, 25：558-569.

［3］Eggert C, Temp U, Er iksson KE. Laccase is essential for lignin degradation by the white-rot fungus Pycnoporus cinnabarinus［J］. FEBS Lett, 1997, 407：89-92.

［4］魏玉蓮, 戴玉成. 木材腐朽菌在森林生態系統中的功能［J］.應用生態學報, 2004, 15：1935-1938.

［5］Rodríguez Couto S, Rodríguez A, Paterson RRM, et a l. Laccase activity from the fungus Trametes hirsuta using an air-lift bioreactor［J］. Lett Appl Microbial, 2006, 42：612-616.

［6］Baldrian P. Fungal laccases-occurrence and properties［J］. FEMS Microbiol Rev, 2006, 30：215-242.

［7］Tien M, Kirk TK. Lignin-Degrading Enzyme from the Hymenomycete Phanerochaete chrysosporium Bur ds［J］. Science, 1983, 221：661-663.

［8］Martínez áT, Ruiz-Due?as FJ, Martínez MJ, et al. Enzymatic delignification of plant ce ll wall：from nature to mill［J］. Curr Opin Biotech, 2009, 20：348-357.

［9］Vivekanand V, Dwivedi P, Sharma A, et al. Enhanced delignification of mixed wood pulp by Aspergillus fumigatus laccase mediator system［J］. World J Microbiol Biotechnol, 2008, 24：2799-2804.

［10］Floudas D, Binder M, Riley R, et al. The paleozoic origin of enzymatic lignin decomposition reconstructed from 31 fungal genomes［J］. Science, 2012, 336：1715-1719.

［11］Arora DS, Gill PK. Laccase production by some white rot fungi under different nutritional conditions［J］. Bioresour Technol, 2000, 73：283-285.

［12］Bermek H, Li K, Eriksson L. Laccase-less mutants of the white-rot fungus Pycnoporus cinnabarinus cannot delignify kraft pulp［J］. J Biotechnol, 1998, 66：117-124.

［13］Praveen K, Viswanath B, Usha KY, et al. Lignolytic enzymes of a mushroom Stereum ostrea isolated from wood logs［J］. Enzyme Res, 2011, 2011：ID:749518.

［14］Moreira S, Milagres AMF, Mussatto SI. Reactive dyes and textile effluent decolorization by a mediator system of salt-tolerant laccase from Peniophora cinerea［J］. Sep Purif Technol, 2014, 135：183-189.

［15］Rodgers CJ, Blanford CF, Giddens SR, et al. Designer laccases：a vogue for high-potential fungal enzymes?［J］Trends Biotechnol, 2009, 28：63-72.

［16］Briving C, Gandvik EK, Nyman PO. Structural studies around cysteine and cystine residues in the “blue” oxidase funga l laccase B. Similarity in amino acid sequence with ceruloplasmin［J］. Biochem Bioph Res Commun, 1980, 93：454-461.

［17］Hoegger PJ, Kilaru S, James T Y, et al. Phylogenetic comparison and classification of laccase and related multicopper oxidase protein sequences［J］. FEBS J, 2006, 273：2308-2326.

［18］Chernykh A, Myaso edova N, Kolomytseva M, et al. Laccase isoformswith unusual properties from the basidiomycete Steccherinum ochraceum strain 1833［j］. J Appl Microbi ol, 2008, 105：2065-2075.

［19］Wang ZX, Cai YJ, Liao XR, et al. Purification and characterization of two thermostable laccases with high cold adapted characteristics from Pycnoporus sp. SYBC-L1［J］. Proc Bio chem, 2010, 45：1720-1729.

［20］Yano A, Kikuchi S, Nakagawa Y, et al. Secretory expression of the non-secretory-type Lentinula edodes laccase by Asper gillus oryzae［J］. Microbiol Res, 2009, 164：642-649.

［21］Cantarella G, d’Acunzo F, Galli C. Determination of laccase activity in mixed solvents：comparison between two chromogens in a spectrophotometric assay［J］. Biotech Bioeng, 2003, 8 2：395-398.

［22］Carunchio F, Crescenzi C, Girelli AM, et al. Oxidation of ferulic acid by laccase：identification of the products and inhibitory effects of some dipeptides［J］. Talan ta, 2001, 55：189-200.

［23］Bose S, Mazumder S, Mukherjee M. Laccase production by the white-rot fungus Termitomyces clypeatus［J］. J Basic Microb, 2007, 47：127-131.

［24］Badiani M, Felici M, Luna M, et al. Laccase assay by means of high-performance liquid chromatography［J］. Anal Biochem, 1983, 133：275-276.

［25］Kahraman S, Yesilada O. Industrial and agricultural wastes as substrates for laccase produ ction by white-rot fungi［J］. Folia Microbiol, 2001, 46：133-136.

［26］Elisashvili V, Kachlishvili E. Physiological regulation of laccase and manganese peroxidase production by white-rot Basidiomycetes［J］. J Biotechnol, 2009, 144：37-42.

［27］Que Y, Sun S, Xu L, et al. High-level coproduction, purification and characterisation of laccase and exopolysaccharides by Corio lus versicolor［J］. Food Chem, 2014, 159：208-213.

［28］Liu J, Cai Y, Liao X, et al. Purification and Characterization of a novel thermal stable laccase from Pycnoporus sp. SYBC-L3 and its use in dye decolorization［J］. Biol Environ, 2012, 113：1-13.

［29］Yan J, Chen D, Yang E, et al. Purification and characterization of a thermotolera nt laccase isoform in Trametes trogii strain and its potential in dye decolorization［J］. Int Biodeter Biodegr, 2014, 93：186-194.

［30］Marbach I, Harel E, Mayer AM. Molecular properties of extracellular Botrytis cinerea laccase［J］. Phytochemistry, 1984, 23：2713-2717.

［31］de la Rubia T, Ruiz E, Perez J, et al. Properties of a laccase produced by Phanerochaete flavido-alba induced by vanillin［J］. Arch Microbiol, 2002, 179：70-73.

［32］Hatakka A. Lignin-modifying enzymes from selected white-rot fungi：production and role from in lignin degradation［J］. FEMS Microbiol Rev, 1994, 13：125-135.

［33］Kurtz MB, Champe SP. Purification and characterization of the conidial laccase of Aspergillus nidulans［J］. J Bacteriol, 1982, 151：1338-1345.

［34］Klonowska A, Gaudin C, Fournel A, et al. Characterization of a low redox potential laccase from the basidiomycete C30［J］. Eur J Biochem, 2002, 269：6119-6125.

［35］ Haibo Z, Yinglong Z, Feng H, et al. Purification and characterization of a thermostable laccase with unique oxidative characteristics from Trametes hirsuta［J］. Biotechnol Lett, 2009, 31：837-843.

［36］Kim Y, Yeo S, Kim MK, et al. Removal of estrogenic activity from endocrine-disrupting chemicals by purified laccase of Phlebia tremellosa［J］. FEMS Microbiol Lett, 2008, 284：172-175.

［37］Eggert C, Temp U, Eriksson K. T he ligninolytic system of the white rot fungus Pycnoporus cinnabarinus：purification and characterization of the laccase［J］. Appl Environ Microbiol, 1996, 62：1151-1158.

［38］Hsu CA, Wen TN, Su YC, et al. Biological degradation of anthroquinone and azo dyes by a novel laccase from Lentinus sp.［J］. Environ Sci Technol, 2012, 46：5109-5117.

［39］Abadulla E, Tzanov T, Costa S, et al. Decolorization and detoxification of textile dyes with a laccase from Trametes hirsuta［J］. Appl Environ Microbiol, 2000, 66：3357-3362.

［40］Lu L, Zhao M, Zhang BB, et al. Purification and characterization of laccase from Pycnoporus sanguineus and decolorization of an anthraquinone dye by the enzyme［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 74：1232-1239.

［41］Kurniawati S, Nicell JA. Characterization of Trametes versicolor laccase for the transformation of a queous phenol［J］. Bioresour Technol, 2008, 99：7825-7834.

［42］Couto SR, Sanromán Má. The effect of violuric acid on the decolourization of recalcitrant dyes by laccase from Trametes hirsuta［J］. Dyes Pigments, 2007, 74：123-126.

［43］Aktas N, Cicek H, U nal AT, et al. Reaction kinetics for laccasecatalyzed polymerization of 1-naphthol［J］. Bioresour Technol, 2001, 80：29-36.

［44］Aktas N, Sahiner N, Kantoglu O, et al. Biosynthesis and characte rization of laccase catalyzed poly（catechol）［J］. J Polym Environ, 2003, 11：123-128.

［45］Alcantara T, Gomez J, Pazos M, et al. Enhanced production of laccase in Coriolopsis rigida grown on barley bran in flask or expanded-bed bioreactor［J］. World J Microbiol Biotechnol, 2007, 23：1189-1194.

［46］Call HP, Mücke I. History, overview and applications of mediated lignolytic systems, especially laccase-mediator-systems（Lignozym?-process）［J］. J Biotechnol, 1997, 53：163-202.

［47］Brogioni B, Biglino D, Sinicropi A, et al. Characterization of radical intermediates in laccase-mediator systems. A multifrequency EPR, ENDOR and DFT/PCM investigation［J］. Physical Chemistry Chemical Physics, 2008, 10：7284-7292.

［48］Bertrand T, Jolivalt C, Briozzo P, et al. Crystal structure of a four-copper laccase complexed with an arylamine：insights into substrate recognition and correlation with kinetics［J］. Biochemistry, 2002, 41：7325-7333.

［49］Liu J, Cai Y, Liao X, et al. Efficiency of laccase production in a 65-liter air-lift reactor for potential green industrial and environmental application［J］. J Clean Prod, 2013, 39：154-160.

［50］司靜, 崔寶凱, 戴玉成. 栓孔菌屬漆酶高產菌株的初步篩選及其產酶條件的優化［J］. 微生物學通報, 2011, 38：405-416.

［51］Quaratino D, Ciaffi M, Federici E, et al. Response surface methodology study of laccase production in Panus tigrinus liquid cultures［J］. Biochem Eng J, 2008, 39：236-245.

［52］Cambria M, Ragusa S, Ca labrese V, et al. Enhanced laccase production in white-rot fungus Rigidoporus lignosus by the addition of selected phenolic and aromatic compounds［J］. Appl Biochem Biotechn ol, 2010, 163（3）：415-422.

［53］Liu L, Lin Z, Zheng T, et al. Fermentation optimization and characterization of the laccase from Pleurotus ostreatus strain 10969［J］. Enzyme Microb Technol, 2009, 44：426-4 33.

［54］Liu J, Wang ML, Tonnis B, et al. Fungal pretreatment of switchgrass for improved saccharification and simultaneous enzyme production［J］. Bioresour Technol, 2013, 135：39-45.

［55］D’Souza- Ticlo D, Sharma D, Raghukumar C. A thermostable metal-tolerant laccase with bioremediation potential from a marinederived fungus［J］. Mar Biotechnol, 2009, 11：725-737.

［56］Wang F, Hu JH, Guo C, et al. Enhanced laccase production by Trametes versi color using corn steep liquor as both nitrogen source and inducer［J］. Bioresour Technol, 2014, 166：602-605.

［57］Thurston CF. The structure and function of fungal laccases［J］. Microbiology, 1994, 140：19-26.

［58］Pointing SB, Jones EBG, Vrijmoed LLP. Opti mization of laccase production by Pycnoporus sanguineus in submerged liquid culture［J］. Mycologia, 2000, 92：139-144.

［59］Fenice M, Giovannozzi Sermanni G, Federici F, et al. Submerged an d solid-state production of laccase and Mn-peroxidase by Panus tigrinus on olive mill wastewater-ba sed media［J］. J Biotechnol, 2003, 100：77-85.

［60］Meza JC, Auria R, Lomascolo A, et al. Role of ethanol on growth, laccase production and protease activity in Pycno porus cinnabarinus ss3［J］. Enzyme Microb Technol, 2007, 41：162-168.

［61］Kuhar F, Papinutti L. Optimization of laccase production by two strains of Ganoderma lucidum using phenolic and metallic inducers［J］. Revista Argentina de Microbiología, 2014, 46：144-149.

［62］Jamroz T, Sencio B, Ledakowicz S. Efficiency of laccase biosynthesis in various types of fermenters［J］. J Biotechnol, 2007, 131S：S161.

［63］Galhaup C, Haltrich D. Enhanced formation of laccase activity by the white-rot fungus Trametes pubescens in the presence of copper［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2001, 56：225-232.

［64］Galhaup C, Wagner H, Hinterstoisser B, et al. Increased production of laccase by the wood-degrading basidiomycete Trametes pubescens［J］. Enzyme Microb Technol, 2002, 30：529-536.

［65］Sharma A, Thakur VV, Shrivastava A, et al. Xylanase and laccase based enzymatic kraft pulp bleaching reduces adsorbable organic halogen（AOX）in bleach effluents：A pilot scale stud y［J］. Bioresour Technol, 2014, 169：96-102.

［66］Eugenio ME, Santos SM, Carbajo JM, et al. Kraft pulp biobleaching using an extracellular enzymatic fluid produced by Pycnoporus sangui neus［J］. Bioresour Technol, 2010, 101：1866-1870.

［67］Alberts JF, Gelderblom WCA, Botha A, et al. Degradation of aflatoxin B1 by fungal laccase enzymes［］J［. Int J FoodMicrobiol, 2009, 135：47-52.

［68］Godoy-Navajas J, Aguilar-Caba llos MP, Gómez-Hens A. Automatic determination of polyphenols in wines using laccase and terbium oxide nanoparticles［J］. Food Chem, 2015, 166：29-34.

［69］袁海生, 戴玉成, 曹云, 等. 白腐真菌染料脫色菌株篩選及一色齒 毛菌脫色條件的研究［J］. 菌物學報, 2010, 29：429-436.

［70］Misra N, Kumar V, Goel NK, et al. Laccase immobilization on radiation synthesized epoxy functionalized polyethersulfone beads and their application for degradation of acid dye［J］. Polymer, 2014, 55：6017-6024.

［71］司靜, 崔寶凱, 戴玉成. 東方栓孔菌在染料脫色中的應用及其脫色條件的優化［J］. 基因組學與應用生物學, 2011, 30：364-371.

［72］Liu J, Cai Y, Liao X, et al. Simultaneous laccase production and color removal by culturing fungus Pycnoporus sp. SYBC-L3 in a textile wastewater effluent supplemented with a lignocellulosic waste Phragmites australis［J］. Bull Environ Contam Toxicol, 20 12, 89：269-273.

［73］司靜, 崔寶凱, 賀帥, 等. 微酸多年臥孔菌產漆酶條件優化及其在染料脫色中的應用［J］. 應用與環境生物學報, 2011, 26：130-137.

［74］Auriol M, Filali-Meknassi Y, Adams CD, et al. Removal of estrogenic activity of natural and synthetic hormones from a municipal wastewater：efficiency of horseradish peroxidase and laccase from Trametes versicolor［J］. Chem osphere, 2008, 70：445-452.

［75］Canfora L, Iamarino G, Rao MA, et al. Oxidative transformation of natural and synthetic phenolic mixtures by Trametes versicolor laccase［J］. J Agric Food Chem, 2008, 56：1398-1407.

［76］Shi L, Ma F, Han Y, et al. Removal of sulfonamide antibiotics by oriented immobilized laccase on Fe3O4nanoparticles with natural mediators［J］. J Hazard Mater, 2014, 279：2 03-211.

［77］Polak J, Jarosz-Wilkolazka A. Whole-cell fungal transformation of precursors into dyes［J］. Microb Cell Fact, 2010, 9：51.

［78］López J, Alonso-Omlin EM, Hernández-Alcántara JM, et al. Novel photoluminescent material by laccase-mediated polyme rization of 4-fluoroguaiacol throughout defluorination［J］. J Mol Catal B Enzym, 2014, 109：70-75.

［79］Gazme B, Madadlou A. Fabrication of whey protein-pectin conjugate particles through laccase-induced gelation of microemulsified nanodroplets［J］. Food Hydrocolloids, 2014, 40：189-195.

［80］Zhang GQ, Wang YF, Zhang XQ, et al. Purification and characterization of a novel l accase from the edible mushroom Clitocybe maxima［J］. Proc Biochem, 2010, 45：627-633.

［81］Kunamneni A, Camarero S, Garcia-Burgos C, et al. Engineering and applications of fungal laccases for organic synthesis［J］. Microb Cell Fact, 2008, 7：32.

［82］Liu J, Zeng L, Carrow RN, et al. Novel approach for alleviation of soil water repellency using a crude enzyme extract from fungal pretreatment of switchgrass［J］. Soil Res, 2013, 51：322-329.

［83］Zeng L, Liu J, Carrow RN, et al. Evaluation of direct application of enzymes to remediate soil water repellency［J］. HortScience, 2014, 49：662-666.

［84］Sidhu SS, Huang Q, Carrow RN, et al. Use of fungal laccases to facilitate biodethatching：a new approach［J］. HortScience, 2012, 47：1536-1542.

［85］Sidhu SS, Huang Q, Carrow RN, et al. Efficacy of fungal laccase to facilitate biodethatching in Bermud agrass and Zoysiagrass［J］. Agronomy Journal, 2013, 105：1247-1252.

（責任編輯 狄艷紅）

A Review on Properties，Production，and Application of Fungal Laccases

LIU Jia-yang1，2JIAO Guo-bao2YOU Xiao-juan1LIAO Xiang-ru3SUN Li-peng2
（1. Department of Bioengineering，Huanghuai University，Zhumadian 463000；2. Henan Yangshao Biochemical Engineering Co. Ltd.，Sanmenxia 472400；3. School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122）

As one of copper-containing oxidoreductases，fungal laccase shows better thermal stability，higher metal tolerance and catalytic oxidative to substrates than bacterial or plant ones，and thereby draws great attentions on applications in industry，agriculture and environmental protection. It is widely considered that the factors limiting the extensive application of laccase are production scale，process cost as well as its properties. Laccase can be produced via solid or liquid state fermentation，and the latter is usually adopted for industrial purposes. Recent progress has expanded the novel applications of laccase in addition to its conventional uses such as dye decolorization，treating wastewater of dyeing and paper pulp bleaching. This paper reviews the published literatures in recent years while focusing on the production，properties，and application of fungal laccase.

white-rot fungi；laccase；fermentation；enzymatic properties；application

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.003

2015-06-14

黃淮學院引進人才科研項目（1000.12.10.1342）

劉家揚，男，博士，副教授，研究方向：酶的生產及應用；Email：liujiayang5@sohu.com