頭孢曲松鈉對大鼠液壓腦損傷后TLR4介導的神經炎癥反應的作用*

李　萍，解東興，劉　偉，王丹宜，周洪霞

(唐山工人醫院功能檢驗科，河北唐山 063000)

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頭孢曲松鈉對大鼠液壓腦損傷后TLR4介導的神經炎癥反應的作用*

李萍，解東興，劉偉，王丹宜，周洪霞△

(唐山工人醫院功能檢驗科，河北唐山 063000)

[摘要]目的觀察頭孢曲松鈉(Cef)治療對大鼠液壓沖擊腦損傷后TLR4介導的神經炎癥反應的影響。方法選用雄性SD大鼠72只，隨機分為假手術組、腦損傷組、Cef治療組，每組24只。采用液壓沖擊法制備SD大鼠腦損傷模型，Cef治療組于致傷前5 d注射Cef(200 mg/kg)，連續5 d。通過干濕比重法檢測各組大鼠腦組織含水量，ELISA法檢測大鼠腦皮層TNF-α、IL-1β水平，免疫組織化學及Western blot法檢測腦皮層TLR4的蛋白表達情況。結果與腦損傷組比較，Cef治療組明顯減輕液壓沖擊性腦損傷的腦組織含水量(P<0.05)，降低大鼠腦皮質組織中炎性因子TNF-α、IL-1β水平(P<0.05)，明顯下調TLR4蛋白的表達量(P<0.05)。結論Cef可以通過抑制TLR4介導的神經炎癥反應，下調炎癥因子的表達，改善腦水腫情況。

[關鍵詞]腦損傷；頭孢曲松鈉；腦水腫；神經炎癥反應

β-內酰胺類抗生素頭孢曲松鈉(ceflriaxone，Cef)是一種臨床常用的抗生素[1]。近幾年多數研究發現Cef除有抗菌作用外，還具有一定的神經保護作用，例如在腦缺血缺氧、腦缺血再灌、細菌性腦膜炎及創傷性腦損傷中均顯示積極的療效[2-4]。然而，Cef對大鼠液壓沖擊腦損傷后TLR4介導的神經炎癥反應的影響，目前鮮有文獻報道。作者通過建立液壓沖擊腦損傷大鼠模型，通過ELISA、免疫組織化學及免疫印跡的方法，觀察Cef處理后大鼠腦組織含水量，TLR4蛋白及炎性因子的變化。以期探討Cef對腦損傷大鼠的腦保護作用及可能的分子機制。

1材料與方法

1.1材料健康SD大鼠72只，雄性，普通級，體質量280～300 g，河北醫科大學實驗動物中心提供，標準鼠飼料常規喂養。兔抗大鼠的TLR4多克隆抗體和小鼠抗大鼠的β-action單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司。羊抗兔及羊抗鼠的兔辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗均購自美國Southern Biotech公司。ELISA試劑盒、SABC試劑盒及DAB試劑盒購自武漢博士德生物技術有限公司。枸櫞酸鹽緩沖液及PBS緩沖液均購自北京中杉金橋有限公司。

1.2方法

1.2.1動物模型制備及分組將72只健康雄性的SD大鼠隨機分為假手術組、腦損傷組、Cef治療組，每組24只。各組又分為12、24、48、72 h 4個時間亞組，每個亞組6只。2%戊巴比妥(40 ms/kg)腹腔麻醉大鼠，假手術組動物常規麻醉開顱，但不給予液壓沖擊處理。腦損傷組、Cef治療組大鼠參照文獻[5]制備液壓沖擊性腦損傷動物模型，打擊強度(1.50±0.20)大氣壓(1大氣壓=101.325 kPa)，造成中度腦損傷。液壓沖擊傷后大鼠立即出現豎毛、弓背、前肢屈曲、后肢強直、肌張力明顯增高及心率增快等表現。致傷后將大鼠放回專用鼠籠標準飼料和飲用純凈水，恒溫20～25 ℃飼養。Cef治療組大鼠于致傷前5 d腹腔注射Cef(200 mg/kg)，連續注射5 d。

1.2.2腦組織含水量測定腹腔注射 10%水合氯醛麻醉大鼠，迅速斷頭取腦，采用干濕質量法測定腦組織含水量。去除腦干和小腦，取等量腦組織以濾紙吸去表面液體，置于電子分析天平稱腦組織濕質量，放于110 ℃恒溫干燥箱內，烘烤48 h至恒重，稱得干質量后，按Elliot公式計算腦組織含水量：腦組織含水量(%)=(濕質量-干質量/濕質量)×100 %

1.2.3ELISA法檢測取出血腫周圍腦組織加入生理鹽水制成10%組織勻漿，低溫3 000 r/min離心20 min，留取取上清液，嚴格按照大鼠的ELISA試劑盒說明書進行操作。用全自動酶標分析儀測定其吸光度值，波長設為450 nm，分別計算TNF-α或IL-1β水平。

1.2.4免疫組織化學法檢測10%水合氯醛麻醉大鼠后，灌流固定，斷頭剝離腦組織，置于4%多聚甲醛中固定48 h。腦組織常規石蠟包埋，連續冠狀切片，片厚5 μm。后續步驟嚴格按SABC免疫組織化學試劑盒說明書進行操作。

1.2.5Western blot法檢測大鼠斷頭取腦后立即在冰上分離海馬組織，-80 ℃冰箱保存備用。低溫充分裂解勻漿后離心，留取上清液，紫外分光光度計測定蛋白濃度。等體積上樣進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，干轉發將凝膠上蛋白轉至 PVDF 膜上，BSA封閉2 h。滴加兔抗大鼠的TLR4多克隆抗體(1∶500)，小鼠抗大鼠的β-actin單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃冰箱過夜。次日洗滌后滴加羊抗兔及羊抗小鼠二抗室溫孵育2 h。ECL對條帶進行顯色曝光，以β-actin作為內參進行半定量分析。

2結果

2.13組大鼠術后各時間點腦組織含水量比較假手術組大鼠腦組織有基礎含水量，與假手術組比較，腦損傷組大鼠各時間點腦組織含水量明顯增加，各時間點組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)。與腦損傷組比較，Cef治療組大鼠腦組織含水量顯著減少，各時間點組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見表 1。

2.23組大鼠術后各時間點大腦皮層TNF-α及IL-1β水平比較與假手術組各時間點比較，腦損傷組大鼠大腦皮層組織中TNF-α、IL-1β水平明顯升高(P<0.05)，于12 h開始升高，24 h達高峰，48～72 h降低，且仍高于假手術組水平。與腦損傷組各時間點比較，Cef治療組大鼠皮層TNF-α、IL-1β水平顯著降低(P<0.05)，見表 2、3。

表1　3組大鼠術后各時間點腦組織含水量

a：P<0.05，與假手術組比較；b：P<0.05，與腦損傷組比較。

表2　3組大鼠術后各時間點皮層TNF-α水平

a：P<0.05，與假手術組比較；b：P<0.05，與腦損傷組比較。

表3　3組大鼠術后各時間點皮層IL-1β水平

a：P<0.05，與假手術組比較；b：P<0.05，與腦損傷組比較。

2.3TLR4蛋白的分布及定位選擇各組24 h大鼠的石蠟標本進行免疫組織化學染色，結果提示，假手術組大鼠大腦皮層TLR4蛋白呈現弱陽性表達；腦損傷組大鼠皮層組織胞質及胞核中可見大量的陽性顆粒表達；Cef治療組大鼠大腦皮層組織TLR4的陽性表達顆粒減少，免疫反應性減弱，見圖1。

A：假手術組；B：腦損傷組；C：Cef治療組。

圖1各組大鼠TLR4的免疫組織化學染色結果(×400)

2.4TLR4蛋白的表達量假手術組各時間點大鼠皮層TLR4蛋白僅有微量的表達。與假手術組比較，腦損傷組大鼠TLR4的蛋白表達量在12 h開始升高(P<0.05)，至24 h表達達到峰值(P<0.05)，而后逐漸下降，但傷后72 h仍明顯高于假手術組水平(P<0.05)。與腦損傷組相應各時間點比較，Cef治療組大鼠TLR4的蛋白表達量顯著下降，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4　3組大鼠術后各時間點皮層TLR4蛋白表達量

a：P<0.05：與假手術組比較；b：P<0.05：與腦損傷組比較。

3討論

β-內酰胺類抗生素是第三代頭孢類抗生素，可有效地透過血-腦屏障進入腦和脊髓中發揮藥效。其中Cef經多數研究證實除了具有抗菌作用外還具有新的功能，應用后可發揮一定的神經保護作用[2-4]，然而其他β-內酰胺類抗生素尚未見報道具有此功能。所以本實驗應用液壓沖擊腦損傷大鼠模型，探討Cef的腦保護作用及作用機制。干濕比重法測量腦組織含水量發現：在液壓腦損傷的大鼠模型中，Cef處理能夠明顯減輕腦組織含水量，緩解腦水腫改變。本結果提示，Cef對腦損傷具有一定的治療效果，與先前的文獻報道相一致。肖國民等[6]報道在大鼠致傷后立即一次性給予Cef 200 mg/kg，可以明顯減輕腦水腫并改善大鼠的學習記憶功能。潘向東等[7]發現Cef通過降低創傷性腦損傷大鼠谷氨酸鹽水平，減輕海馬CAl區神經元死亡及腦水腫。但是有關Cef腦保護作用機制的研究較少。有研究報道顯示，Cef可以激活谷氨酸轉運體-1的表達及功能，從而阻斷興奮性氨基酸的神經毒性[8]。本實驗通過ELISA法檢測各組大鼠大腦皮層組織中TNF-α和IL-1β水平改變，結果顯示，Cef能夠明顯降低腦損傷后TNF-α和IL-1β水平，減輕大腦皮層的神經炎癥反應。腦損傷后出現的神經炎癥反應是一個復雜的多因素共同參與的級聯過程，是后續多種繼發性腦損傷的病理生理基礎。本發現揭示Cef降低炎性因子的表達可能是其在腦損傷大鼠模型中發揮腦保護作用的機制之一。同時證實了Cef抗菌之外的另一作用——抗感染作用。

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是生物體中非常重要的固有免疫模式識別受體，廣泛分布于各種免疫細胞及多種組織中，在固有免疫應答過程中具有重要作用[9-11]。在TLRs的受體家族中，TLR4是最早被發現的成員。在腦組織內，TLR4主要分布于星形膠質細胞、小膠質細胞和少突膠質細胞中[12]。值得注意的是腦組織中TLR4的異常表達在中風、多發性硬化和阿爾茲海默病等多種神經系統疾病的免疫病理過程中發揮作用[13]。此外還有研究發現在腦缺血再灌注動物損傷模型中TLR4不僅能夠誘導免疫應答反應，而且還可以觸發炎癥級聯反應[14]。小膠質細胞中TLR4的活化與創傷性疾病神經炎癥反應的啟動和嚴重的神經變性密切相關[15]。本實驗的免疫印跡結果提示，Cef處理可逆轉腦損傷后TLR4的高表達，限制TLR4誘導的神經炎癥反應，促進創傷的修復。

綜上所述，本實驗通過液壓沖擊制備大鼠腦損傷模型，研究證實Cef治療可以減輕腦水腫，對腦損傷發揮一定的腦保護作用。進一步探討其機制發現，Cef通過降低TLR4誘導的神經炎癥反應促進腦損傷的修復。揭示了Cef抗菌作用之外的另一重要臨床應用價值。

參考文獻

[1]李丹,張永信.頭孢曲松鈉的特性及臨床應用[J].上海醫藥,2013,34(13):12-16.

[2]劉心潔,王玉珍,胡瑞梅,等.基質金屬蛋白酶抑制劑GM6001對肺炎鏈球菌性腦膜炎模型大鼠的腦保護作用[J].中國藥理學與毒理學雜志,2011,25(2):156-161.

[3]劉暢,巴曉紅,閔連秋,等.頭孢曲松鈉預處理對局灶性腦缺血大鼠缺血周圍腦組織白介素1β和白介素6表達的影響[J].中國全科醫學,2013,16(36):4293-4295.

[4]顏志婷,熊建忠,林小小,等.頭孢曲松鈉對腦缺血再灌注模型大鼠的腦保護作用[J].中國老年學雜志,2014,5(15):4241-4242.

[5]孫國柱,劉性強,王目綱,等.一種大鼠液壓沖擊腦損傷裝置的研制[J].中華實驗外科雜志,2011,28(5):749-750.

[6]肖國民,危靜,潘向東,等.頭孢曲松對創傷性腦損傷大鼠傷后腦水腫和學習記憶功能的影響[J].中華外科雜志,2013,51(3):272-273.

[7]潘向東,危靜,肖國民,等.β內酰胺抗生素頭孢曲松對創傷性腦損傷大鼠海馬谷氨酸鹽水平的影響[J].浙江大學學報:醫學版,2011,40(5):522-526.

[8]Kim K,Lee SG,Kegelman TP,et al.Role of excitatory amino acid transporter-2(EAAT2) and glutamate inneurodegeneration:opportunities for developing novel therapeutics[J].J Cell Physiol,2011,226(10):2484-2493.

[9]Kaisho T,Akira S.Toll-like receptor function and signaling[J].J Allergy Clin Immunol,2006,117(5):979-987.

[10]常曉彤,輦曉峰,王振輝,等.Toll樣受體信號轉導途徑研究進展[J].生理科學進展,2011,42(5):340-346.

[11]孫冰,韓代書.Toll樣受體信號通路的負調控[J].生物化學與生物物理進展,2009,36(12):1516-1522.

[12]胡曉松,宋海星,劉靜,等.缺血預處理對局灶性缺血大鼠腦梗死區周圍TLR4及GFAP表達的影響[J].重慶醫學,2012,41(29):3076-3078.

[13]Okun E,Griffioen KJ,Mattson MP.Toll-like receptor signaling in neural plasticity and disease[J].Trends Neurosci,2011,34(5):269-281.

[14]高音,王玉,張翠香,等.TLR4與TNF-а在腦缺血再灌注小鼠海馬CA1區神經元中的表達[J].神經解剖學雜志,2010,26(2):175-180.

[15]Fernandez-Lizarbe S,Pascual M,Guerri C.Critical role of TLR4 response inthe activation of microglia induced by ethanol[J].J Immunol,2009,183(7):4733-4744.

Effect of ceftriaxone on TLR4 mediated nerve inflammatory reaction after hydraulic brain injury in rats*

LiPing,XieDongxing,LiuWei,WangDanyi,ZhouHongxia△

(DepartmentofFunctionalLaboratory,TangshanWorker′sHospital,Tangshan,Hebei063000,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of ceftriaxone(Cef) on TLR4 mediated nerve inflammatory reaction after hydraulic brain injury in rats.MethodsSeventy-two male SD rats were randomly divided into the sham operation group,brain injury group and ceftriaxone treatment group(n=24).The rat model of brain injury was prepared by the hydraulic impact method.The Cef treatment group was treated with Cef(200 mg/kg) on 5 d before injury for successive 5 d.The wet-dry weight method was used to detect the water content in the brain tissue in each group.The levels of TNF-α and IL-1β in the cerebral cortex were tested with the ELISA method.The expression of TLR4 protein in the cerebral cortex was measured by immunohistochemical staining and Western blot methods.ResultsCompared with the brain injury group,the brain tissue water content caused by the hydraulic impact in the Cef treatment group was significantly reduced(P<0.05),the levels of TNF-α and IL-1β in the cerebral cortex tissue were decreased(P<0.05),and the expression of TLR4 protein was significantly down-regulated(P<0.05).ConclusionCef could down-regulate the expression of inflammatory factors and improve the cerebral edema by inhibiting TLR4 mediated nerve inflammation reaction.

[Key words]brain injuries;ceftriaxone;brain edema;inflammation

doi:論著·基礎研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.06.006

基金項目：河北省唐山市科學技術研究與發展計劃資助項目(12140209A-31)。

作者簡介：李萍(1969-)，主治醫師，碩士研究生，主要從事腦損傷基礎研究?！魍ㄓ嵶髡?，Tel:15633910346;E-mail:lipinggnjy@yeah.net。

[中圖分類號]R605.97

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)06-0737-03

(收稿日期：2015-06-22修回日期：2015-10-09)