基因槍轉化法對抗旱基因導入玉米的研究

李志亮吳忠義楊清張希太葉嘉邢浩春陳建中黃叢林

（1.邯鄲學院 生命科學與工程學院，邯鄲 056005；2.北京農業生物技術研究中心，北京 100097；3.南京農業大學生命科學學院，南京210095；4.河北省邯鄲市農業科學院，邯鄲 056001；5.河北省高校冀南太行山區野生資源植物應用技術研發中心，邯鄲 056005）

基因槍轉化法對抗旱基因導入玉米的研究

李志亮1，2，5吳忠義2楊清3張希太4葉嘉1，5邢浩春1，5陳建中1，5黃叢林2

（1.邯鄲學院 生命科學與工程學院，邯鄲 056005；2.北京農業生物技術研究中心，北京 100097；3.南京農業大學生命科學學院，南京210095；4.河北省邯鄲市農業科學院，邯鄲 056001；5.河北省高校冀南太行山區野生資源植物應用技術研發中心，邯鄲 056005）

全球水資源短缺，干旱已是玉米生產發展的主要限制因素。通過培育抗旱能力提高的轉P5CS基因玉米株系，為玉米抗旱遺傳育種提供新材料。利用基因工程策略構建植物表達載體pBPC-P5CS-F129A，用基因槍法對玉米自交系京501幼胚愈傷組織進行遺傳轉化，在選擇培養基中加入10 mg/L 的草丁膦進行篩選，對草丁膦抗性再生植株進行了PCR 檢測和 Northern blot鑒定，對轉P5CS基因玉米植株進行了抗旱性分析。結果表明，與對照相比，轉基因植株的抗旱能力得到提高。干旱脅迫下，轉P5CS基因玉米植株的脯氨酸含量比對照高，而丙二醛含量比對照低。

玉米；愈傷組織；基因槍法；草丁膦；遺傳轉化；抗旱性

水分缺乏是世界范圍內限制作物產量的一個主要因素，提高農作物產量需要培育耐旱種質［1］。為了減輕干旱對農業生產造成的損失，人們一方面采用改良土壤、合理灌溉等農業措施；另一方面通過培育作物抗旱品種來提高作物的抗旱能力。植物體內存在許多與干旱相關的信號轉導通路，植物通過激活許多信號通路響應干旱脅迫，使植物抵御或適應脅迫［2］。

干旱脅迫誘導所表達的基因主要包括起單一功能作用的基因和調控基因。第一類單一功能作用的基因主要是指編碼產物可在逆境下直接起保護作用的相關基因。（1）抗氧化基因。編碼產物如超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶。（2）合成滲透調節物質的基因。該類基因的過表達增加了細胞滲透保護物質，如脯氨酸、甜菜堿、海藻糖、果聚糖的合成能力，使其在細胞中積累，以維持細胞較高的滲透壓，從而增強植株的抗旱性。（3）其他脅迫相關基因，其編碼產物參與保護生物大分子及膜結構。第二類是具有調控功能的基因，主要是參與信號轉導或轉錄調控相關的基因，其編碼產物可在逆境脅迫下起調節作用。如轉錄因子和參與植物細胞信號轉導的基因［3］。

目前，用于玉米的抗旱基因工程育種也主要是這兩類基因。在抗旱功能基因轉化玉米方面，主要有甜菜堿合成酶基因betA［4］，蛋白激酶基因NPK1［5］，玉米磷脂酶C基因（ZmPLC1）［6］，小鹽芥（Thellungiella halophila）液泡H+焦磷酸酶（vacuolar H+-pyrophosphatase，TsVP）［7］，AtGPX3基因［8］，隣脂酰肌醇合成酶ZmPIS基因［9］，枯草桿菌cspB基因［3］，編碼膽堿脫氫酶的BADH 基因［10］。

高等植物中，Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）是由谷氨酸生物合成脯氨酸的限速酶。在干旱脅迫下許多植物體會積累大量的脯氨酸，脯氨酸在細胞內可作為滲透調節劑降低細胞質的水勢，維持胞質的水分狀況，使植物適應干旱脅迫［11，12］。脯氨酸累積與植物對干旱和鹽脅迫的適應性呈正相關性關系［7］。脯氨酸的生物合成途徑首先在大腸桿菌中被發現［13］。在植物體內，脯氨酸的合成是通過谷氨酸途徑和鳥氨酸途徑進行的，其中谷氨酸途徑在滲透脅迫條件下占主要地位［14］。Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）由P5CS基因編碼。在高等植物中，第一個P5CS基因是從豇豆（Vigna aconitifolia）中克隆的［15］?；虮磉_分析表明，P5CS 基因能夠在豇豆葉片中高水平表達，且在根中的表達受鹽脅迫誘導，暗示其在脯氨酸生物合成中發揮重要作用，在植物中表達可引起滲透調節［15］。研究證明，轉P5CS基因的高羊茅［16］和白三葉［17］的抗旱性有一定程度的增強。

1987年，Klein等［18］利用基因槍轉化洋蔥（Allium cepa）表皮細胞獲得成功，使這一技術在單子葉植物的遺傳轉化中得到應用。而利用基因槍法對玉米開展基于P5CS基因的遺傳轉化還未見報道。本研究利用基因槍法將豇豆P5CS基因的突變型P5CS-F129A基因導入玉米自交系京501中，經草丁膦篩選獲得轉化體，對草丁膦抗性植株進行PCR檢測和Northern blot鑒定，同時，對轉基因植株進行脯氨酸和丙二醛（MDA）含量的測定。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的玉米（Zea mays L.）為自交系京501，由北京市農林科學院玉米中心提供。

1.2 方法

1.2.1 植物表達載體 質粒pBPC-P5CS-F129A由北京農業生物技術研究中心提供，該基因上游為Ubi（玉米泛醌素）啟動子，下游為 nos終止子，選擇標記基因是bar基因（圖1）。

圖1 pBPC-P5CS-F129A質粒圖譜

1.2.2 玉米幼胚的接種 取授粉后 10-13 d、幼胚大小為 1-2 mm的玉米果穗，去苞葉后在70%的酒精中浸泡5-10 min，取出后用解剖刀削去種皮及部分胚乳，挑出幼胚，接種于誘導培養基上。

1.2.3 培養基 基本培養基：N6大量、B5微量、N6有機、Fe鹽、脯氨酸690 mg/L、水解酪蛋白200 mg/L、肌醇100 mg/L、蔗糖30 mg/L、植物凝膠2.6mg/L或瓊脂粉6 mg/L；愈傷組織誘導及繼代培養基：基本培養基附加 2，4-D 2 mg/L和10 mg/L AgNO3；選擇培養基：愈傷組織誘導或繼代培養基附加不同濃度草丁膦和10 mg/L AgNO3；胚狀體誘導培養基：基本培養基附加1.5 mg/L KT；分化培養基：同基本培養基；生根壯苗培養基：基本培養基附加0.5 mg/L NAA。

1.2.4 基因槍轟擊方法與參數 參見文獻［16］的方法進行。

1.2.5 胚性愈傷組織的篩選

1.2.5.1 胚性愈傷組織的恢復培養 將用基因槍轟擊后的胚性愈傷組織，在原培養皿中、暗處恢復培養3-5 d以便修復由微彈復合體對受體細胞造成的損傷。

1.2.5.2 胚性愈傷組織的繼代篩選 將恢復培養后的胚性愈傷組織接種在附加草丁膦6 mg/L篩選繼代培養基篩選15 d。然后，將存活的抗性愈傷轉接到草丁膦10 mg/L的篩選繼代培養基上進行第2次篩選15 d。

1.2.6 植株的再生及移栽 抗性愈傷組織在附加1.5 mg/L KT的胚狀體誘導培養基上培養一周后，轉移至分化培養基進行綠苗分化。分化的綠苗長出主莖后，將其移至生根壯苗培養基上生根壯苗。待幼苗長出 2片新葉、3-4條主根后，移至裝有營養土（2/3蛭石+1/3腐殖質）的小花盆中。當幼苗在小花盆中長出 1-2片新葉，帶土移栽到大田。

1.2.7 再生植株的分子檢測

1.2.7.1 選取草丁膦抗性的植株，用CTAB法提取葉片總DNA，利用PCR對P5CS基因進行檢測。根據P5CS基因的序列設計引物為：上游引物：22 bp 5'-CTCTCTACGATACGCTGTTCAC-3'；下游引物：20 bp 5'-CTTCTTTGCCACCTTTCAAG-3'；陽性轉基因植株可擴增出1 008 bp的片段。PCR采用由東盛公司生產的擴增儀。

1.2.7.2 PCR陽性植株的Northern blot 鑒定 取經PCR檢測呈陽性的植株進行Northern blot 分析，以未轉基因的野生型植株的RNA為陰性對照。探針標記和雜交檢測按照Roche公司的地高辛試劑盒的方法進行，雜交溫度為41℃。具體參見文獻［19］的方法進行。

1.2.8 脯氨酸含量測定 對部分轉基因玉米植株和對照植株進行干旱處理，測定幼苗葉片脯氨酸含量。葉片脯氨酸含量的測定按Bates和張殿忠等［20，21］的方法進行。數據為3次獨立實驗的平均值。

1.2.9 葉片丙二醛（MDA）含量測定 丙二醛（MDA）含量通過與硫代巴比妥酸的顏色反應來測定［22，23］。

2 結果

2.1 胚性愈傷組織的篩選和植株再生

用不同濃度的草丁膦對幼胚愈傷組織進行兩次篩選。第1次是在附加草丁膦6 mg/L篩選繼代培養基篩選15 d，愈傷組織的成活率在30%左右。然后，將存活的抗性愈傷轉接到草丁膦10 mg/L的篩選繼代培養基上進行第2次篩選15 d。在愈傷組織篩選過程中，非抗性愈傷組織塊會逐漸褐化變黑而死亡，25-35 d后，大部分（90%-95%）愈傷組織被殺死，只有少部分（5%-10%）愈傷組織能夠存活下來（抗性愈傷組織）并逐漸長出綠色的小芽點，再經過10-20 d后，發育成具有莖和葉的小植株，最后在生根培養基上發育成完整的植株（圖2）。

圖2 玉米植株再生體系的建立

2.2 轉基因玉米植株的分子檢測

用設計好的引物對草丁膦抗性植株進行P5CS基因的PCR檢測，轉基因植株的P5CS基因擴增帶位置與質粒陽性對照擴增帶位置相同，而陰性對照及其他植株無擴增帶（圖3-A）。經檢測，共得到11株PCR陽性植株，陽性率70%。

為了檢測目的基因在轉基因植株中是否表達，從野生型和3個轉基因植株葉片中提取總RNA，進行Northern blot分析。每個泳道RNA上樣量為15 μg，探針為地高辛標記的P5CS cDNA特異探針，溴化乙錠染色的rRNA作內參，Northern雜交檢測結果如圖3-B所示。在未轉基因的對照植株中未出現擴增產物，而在各轉基因植株株系中目的基因均有不同程度的表達。根據目的基因表達強度，選擇株系L2、L9進行抗旱性實驗。

2.3 轉基因植株的脯氨酸含量增加

為了解在干旱脅迫處理條件下轉基因植株脯氨酸積累的變化，測定了轉基因植株和對照植株葉片脯氨酸的含量。在干旱脅迫處理之前，葉片脯氨酸含量在轉基因植株和對照植株之間沒有顯著差異，含量都較低。干旱脅迫引起轉基因植株葉片脯氨酸含量有不同程度的上升。在干旱脅迫處理過程中，轉基因植株葉片脯氨酸的含量都顯著高于其對照植株。如在正常條件下，WT、L2和L9植株的脯氨酸含量分別為23.4、24.1和26.5 μg/g·FW，沒有顯著差異。干旱脅迫處理3 d后，L2和L9植株脯氨酸含量分別上升為63.7和66.1 μg/g·FW，顯著高于WT植株的51.3 μg/g·FW，轉基因植株葉片脯氨酸含量比對照株高24.2%-28.8%（圖4，表1）。這些結果表明轉基因植株細胞可以積累更多的脯氨酸，使細胞能夠維持較低的溶質勢，從而能夠更好地保持水分，減少或免受干旱脅迫的傷害。與對照相比，轉基因植株對干旱脅迫具有較強的耐性。

圖4 干旱脅迫引起的玉米幼苗脯氨酸含量的變化

表1 不同株系在不同處理時間條件下脯氨酸的含量（μg/g·FW）變化

2.4 轉基因植株具有較低的丙二醛含量

干旱脅迫條件下，玉米葉片失水萎蔫，葉片細胞內活性氧含量上升，使細胞膜脂成分發生氧化，脂質過氧化產物為丙二醛（MDA），MDA能與蛋白質等交聯導致酶失活或膜系統受損，因此，植物體內MDA含量的高低可在一定程度上反映玉米植株在干旱脅迫條件下膜脂過氧化的程度的大小。結果表明：在干旱脅迫處理前，各株系的丙二醛含量差別較小，且隨著干旱脅迫處理時間的延長而升高（圖5，表2）。相同處理時間下轉基因株系與對照株系相比測定值要低。如在干旱脅迫處理第3天時，L2和L9的MDA含量分別為18.8 nmol/g FW，14.0 nmol/g FW，而WT的測定值達到了21.5 nmol/g FW。這些結果表明，在干旱脅迫下轉P5CS基因植株的細胞膜損傷較輕，有利于植株的生長，使轉基因植株抗旱性得到提高。

圖5 干旱脅迫引起的玉米幼苗丙二醛含量的變化

表2 不同株系在不同處理時間條件下丙二醛的含量（nmol/g·FW）變化

3 討論

環境中，植物常常遭受干旱脅迫。植物通過激活一系列信號途徑來響應脅迫，使植物能抵御或適應干旱脅迫。干旱可以產生細胞傷害和次生脅迫，如滲透和氧化脅迫。通過信號感知和轉導，啟動下游信號程序和轉錄調控機制，激活脅迫響應機制（如脯氨酸參與的滲透保護）以重建平衡，保護和修復受傷害蛋白和各種膜，從而賦予植物脅迫耐性［24］。

干旱是影響植物生長發育的重要因素，通過滲透脅迫影響植物細胞膨壓從而導致植物的不良生長。在滲透脅迫下，植物將產生一些滲透調節物質抵抗該脅迫，包括脯氨酸和甜菜堿。脯氨酸主要來源于谷氨酸合成途徑［25］。研究表明，由P5CS基因編碼的Δ1-吡咯琳-5-羧酸合成酶是滲透脅迫時植物體內合成脯氨酸的關鍵酶，單獨轉化P5CS基因的植株可以提高脯氨酸的含量，起到抗旱的作用［26］。

自從1992年第一個高等植物的P5CS基因從豇豆中克隆以來，在許多植物中克隆出該基因。據不完全統計，僅從2010年以來就從20多種植物中成功克隆了P5CS基因［27-53］。同時，利用豇豆P5CS基因轉化高羊茅［16］、冰草［54］、白三葉［17］，多年生黑麥草P5CS基因轉化擬南芥［55］，普通菜豆PvP5CS1基因轉化擬南芥［56］、PvP5CS2基因轉化煙草［56］，朝鮮堿茅P5CS基因轉化紫花苜蓿［57］，新牧一號苜蓿MvP5CS基因轉化棉花［58］，擬南芥P5CS1基因轉化羽衣甘藍［47］和馬鈴薯［59］均獲得成功。

實驗證實，轉化P5CS基因可顯著提高多種植物的脯氨酸水平［60-63］。轉基因植株比對照植株最低也高達20.0%［17］，有的高達12倍［61］，耐旱性也有不同程度的提高。研究還發現，脯氨酸在調控植物體內蛋白合成和細胞周期轉換中起重要作用，脯氨酸可以保護遭受滲透傷害的發育中的細胞［49］。脯氨酸合成不足會導致周期蛋白基因和其他細胞周期相關基因的表達下調，暗示脯氨酸可以作為植物發育中的信號分子參與細胞信號轉導過程［64］。

為進一步探討植物抗旱的生理機制，Singh等［65］比較了兩種棉花的干旱耐性相關基因的差異表達譜和生理表現。結果顯示，在干旱條件下，生理指標諸如凈光合速率、蒸騰、氣孔導度、葉綠素熒光、相對含水量（RWC）和水勢都會發生變化，而脯氨酸、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）含量會隨著其相關基因表達改變而增加。中度脅迫下，耐旱品種保持較低的水勢可能是由于與敏感品種相比具有的較高脯氨酸含量?；虮磉_分析顯示，耐旱品種通過上調天冬酰胺合成酶調節（AS）、谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）和甲基乙二醛（glyI）基因表達增強解毒機制，同時，耐旱品種通過上調Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）基因增強脯氨酸，一種滲透調節物質的積累［65］。研究也發現，玉米在長期遭受非生物逆境脅迫尤其是干旱脅迫條件下，細胞內離子平衡遭到破壞，從而影響一系列代謝通路，導致多種生理活動出現紊亂，最終對植物生長發育產生抑制作用［3］。

為了提高玉米對干旱脅迫的適應能力，將來自豇豆的P5CS基因轉化玉米。首先通過不同植物生長調節劑組合，建立了基于玉米幼胚的遺傳轉化體系；其次采用基因槍轉化法將P5CS基因轉化到玉米基因組中，并通過PCR和Northern blot檢測，驗證了目的基因已轉入到玉米基因組中并得到表達。

另外，通過探討轉基因植株在干旱脅迫條件下的生理生化變化對其抗旱性進行了初步研究。測定了轉基因植株和對照植株的脯氨酸含量。從本實驗的結果來看，干旱脅迫下，轉基因玉米植株中脯氨酸含量的增加明顯高于對照植株，如干旱脅迫處理3 d后，轉基因株系L9植株脯氨酸含量為66.1 μg/g·FW，顯著高于WT植株的51.3 μg/g·FW（圖4，表1），說明轉基因植株的細胞能夠維持較低的溶質勢，抵御干旱脅迫能力較強。

水分脅迫會造成植物細胞原生質膜的損傷，破壞質膜的結構，使其穩定性降低，透性增大，干旱脅迫也會使細胞膜脂成分發生氧化，脂質過氧化產物主要是丙二醛（MDA）。MDA（丙二醛）含量越高，反映植物抗旱性越弱，反之，則植物抗旱性強。質膜傷害度增值與抗旱性為顯著負相關［66］。轉基因植株和對照植株的MDA含量測定結果顯示，相同處理時間下轉基因株系的MDA比對照株系的要低。在干旱脅迫處理第3天時，L9的MDA含量分別為14.0 nmol/g·FW，而WT的測定值達到了21.5 nmol/g·FW。表明干旱脅迫下，與對照植株相比，轉基因植株的膜脂過氧化程度較輕，細胞膜穩定性較高，抗旱性較強（圖5，表2）。在干旱脅迫下轉P5CS基因植株可以通過降低細胞膜損傷提高干旱耐性。以上實驗結果表明轉P5CS基因玉米的抗旱性得到了一定提高。后續將對轉基因植株進行田間抗旱性分析，篩選抗旱性較強的轉基因玉米新材料，為玉米抗旱育種提供中間材料。

近年來，P5CS基因對提高植物抗旱能力在抗逆基因工程上的應用不斷得到研究探討與證實，這些研究應用將為抗旱植物的培育及真正運用于大田生產奠定堅實的基礎。目前，我國玉米產量和品質雖有一定提高但仍繼續進行改良，考慮到目前轉基因玉米的應用主要集中在抗蟲、抗除草劑方面，而對于中國北方大面積的缺水現狀而言，利用不同遺傳背景的P5CS基因轉化玉米，增加玉米的抗旱性，獲得具有優良性狀并能穩定遺傳的耐旱玉米新品種將具有重要的經濟和實踐意義，因而具有廣闊的應用前景。

4 結論

本實驗的研究表明，豇豆P5CS基因已整合進轉基因玉米基因組中并能夠在植株中表達。干旱脅迫下，轉P5CS基因玉米植株的脯氨酸含量比對照高，而丙二醛含量比對照要低，轉基因玉米植株的抗旱性得到提高。

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（責任編輯 狄艷紅）

The Transformation of Drought-resistant Gene into Maize by Microprojectile Bombardment

LI Zhi-liang1，2，5WU Zhong-yi2YANG Qing3ZHANG Xi-tai4YE Jia1，5XING Hao-chun1，5CHEN Jian-zhong1，5HUANG Cong-lin2
（1. College of Life Sciences and Engineering，Handan University，Handan 056005；2. Beijing Research Center of Agro-Biotechnology，Beijing 100097；3. College of Life Sciences，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095；4. Handan Academy of Agricultural Sciences in Hebei Province，Handan 056001；5. Application Technology Research and Development Center of Wild Resource Plants in Taihang Mountain Area of Southern Hebei for Hebei Institutions of Higher Education，Handan 056005）

A drought-resistance function gene，VaP5CS，was cloned from mothbean（Vigna aconitifolia）. Plant expression vector pBPC-P5CS-F129A was constructed using gene engineering strategy，then the genetic transformation of young embryo callus in maize inbred line Jing 501 was performed by microprojectile bombardment. Further，the transformed explants were directly selected on the medium containing 10 mg/L glufosinate，and the glufosinate-resistant plantlets were confirmed by PCR amplification and Northern blot identification. Finally，the different drought resistance indexes of P5CS-transgenic maize plants were analyzed. The results showed that the transgenic plants presented the improved drought resistance comparing to control plants. Under drought stress，the proline content in the P5CS-transgenic maize plant was higher than that in the control，while the MDA content was lower than that in the control.

Zea mays；callus；microprojectile bombardment；glufosinate；genetic transformation；drought resistance

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.008

2015-08-05

國家轉基因生物新品種培育重大專項資助項目（2009ZX08003-009B），邯鄲市科學技術研究與發展計劃項目（1322101065），邯鄲學院自然科學研究項目（13208）

李志亮，男，博士，副教授，研究方向：植物生理、植物細胞工程和分子生物學；E-mail：zhiliangli09@126.com

黃叢林，男，博士，研究員，研究方向：植物抗旱、抗寒、耐鹽分子生物學及基因工程改良；E-mail：huangconglin@hotmail.com