人C-Src蛋白酪氨酸激酶真核表達、純化及活性檢測

徐嵐 肖斌 陳慧芹 李曉榮 郝文波

（南方醫科大學抗體工程研究所，廣州 510515）

人C-Src蛋白酪氨酸激酶真核表達、純化及活性檢測

徐嵐 肖斌 陳慧芹 李曉榮 郝文波

（南方醫科大學抗體工程研究所，廣州 510515）

旨在構建人C-Src蛋白酪氨酸激酶（Csk）基因真核表達系統。從HeLa細胞中提取總的RNA，通過RT-PCR獲得Csk基因全長cDNA序列，并將其克隆至真核表達載體pENTER中，構建重組質粒pENTER-Csk-his。重組質粒轉染293T細胞48 h后通過SDS-PAGE、Western blot檢測Csk蛋白表達情況，間接免疫熒光進行蛋白定位，通過鎳螯合的磁珠法純化Csk蛋白，hispulldown及CO-IP檢測表達蛋白的活性。結果顯示，經雙酶切及測序鑒定，真核表達載體pENTER-Csk-his正確沒有突變，SDSPAGE及Western blot均可檢測到大小約為51 kD的目的蛋白，說明Csk蛋白在293T細胞中表達成功，間接免疫熒光定位重組Csk蛋白在細胞質中表達，通過磁珠純化得到Csk蛋白，最后通過his-pulldown及CO-IP發現Csk能夠與IGF1R、SHC1相互作用，說明表達的Csk蛋白具有生物學活性。成功獲得Csk基因全長序列，并構建重組pENTER-Csk-his真核表達質粒，在真核細胞293T的細胞質中獲得高效表達且表達的蛋白具有生物學活性。

Csk基因；293T細胞；真核表達；純化；活性鑒定

C-Src蛋白酪氨酸激酶（C-Src tyrosine kinase，Csk）是Src激酶家族（SFKs）的成員，為SFKs的負調節蛋白［1］。Csk分子量為51 kD，屬于非受體酪氨酸激酶，其N末端有SH3和SH2結構域，C末端含有激酶結構域［2］。目前對于Csk的研究，多集中于Csk對SFKs的作用機制及其在免疫系統中的作用。研究發現，SFKs參與多種重要的生理過程，如細胞生長分化及黏附、蛋白的轉錄等［3］，同時在多種腫瘤如胃癌、非小細胞肺癌、前列腺癌等的發生發展中起到重要作用。據文獻［4，5］報道，通過抑制SFKs可以抑制肺癌的遷移。已有實驗表明，作為SFKs的負調節蛋白，Csk可以通過抑制SFKs激酶的磷酸化發揮抑制腫瘤的作用［6，7］。但Csk如何調控SFKs的具體機制尚不確定。Csk是非受體酪氨酸激酶，需跨膜受體如IGF1受體、EGF受體、T細胞受體［8，9］或跨膜銜接蛋白如CBP［10］等的幫助完成信號傳遞。推測Csk發揮功能與其同這些蛋白的相互作用有關。

為獲得有生物活性的Csk蛋白，進而研究Csk調控SFKs的分子機制，本研究從HeLa細胞中通過RT-PCR方法獲得目的基因，連接到高效真核表達載體pENTER上，構建重組真核表達質粒。將重組質粒轉染到293T細胞中進行蛋白表達，并用SDSPAGE、Western blot、his-pulldown及CO-IP等方法觀察和鑒定重組Csk蛋白表達情況和生物活性，旨在為進一步研究Csk蛋白通路及其對SFKs的調控作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細胞與載體 HeLa、293T細胞由南方醫科大學抗體工程研究所保存；TOP10感受態細胞購自TIANGEN天根生化科技（北京）有限公司；pENTER載體購自ViGene Biosciences。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清（FBS），DMEM培養基購自Gibco公司；RNA提取試劑盒，逆轉錄酶Reverse Transcriptase M-MLV購自Invitrogen公司；Prime STAR Max酶，限制性內切酶Mlu I，限制性內切酶AsiSⅠ，T4連接酶，DNA Marker DL5000購自TaKaRa公司；割膠回收試劑盒購自TIANGEN天根生化科技（北京）有限公司；質粒小提取試劑盒購自美國OMEGA公司；PolyJet DNA In Vitro Tranfection Reagent 購自Polyplus。兔源Csk、IGF1R抗體，鼠源抗His抗體，兔源GAPDH抗體，羊抗兔IgG-HRP，羊抗鼠IgG-HRP購自Bioworld公司。螯合鎳的磁珠購自海貍生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 從GenBank中獲取Csk基因序列（NM_004383），根據cDNA中的序列，利用Primer 5.0軟件進行引物設計，并在引物上游加入限制性內切酶位點以及保護堿基，上游引物：5'-CGCG ATCGCATGTCAGCAATACAGG CCG-3'（下劃線部分為AsiSⅠ酶切位點），下游引物：5'-TACGCGTTCAG GTGCAGCTCGTGGGTTT-3'（下劃線部分為MluⅠ酶切位點），擴增片段大小為1 367 bp。所有引物由艾基生物公司合成。

1.2.2 獲取目的基因Csk 用10% FBS的DMEM培養液常規培養HeLa細胞，利用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，按照MLV逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA，PCR體系為：cDNA模板5 μL，上、下游引物各1 μL，總體積50 μL。PCR反應條件：98℃ 5 min；98℃ 10 s，65℃ 5 s，72℃ 20 s，34個循環；72℃ 10 min，4℃保存。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并使用割膠回收試劑盒回收。

1.2.3 構建重組真核表達載體pENTER-Csk-his 將獲得的Csk基因片段與pENTER質粒進行Mlu I和AsiSⅠ雙酶切12 h，產物分別經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離并使用割膠回收試劑盒回收。用T4連接酶在16℃條件下連接Csk基因片段回收產物與pENTER回收產物6 h。連接產物轉化TOP10感受態細胞，轉化液涂板培養37℃ 16 h，挑取菌落搖菌培養，利用質粒提取試劑盒提取質粒。經Mlu I和 AsiSⅠ雙酶切鑒定為陽性克隆后，送到艾基生物測序鑒定。

1.2.4 細胞培養與重組質粒轉染 將293T細胞用含10% FBS的DMEM培養液在37℃，5% CO2條件下培養。當293T細胞生長狀態良好后，消化分板，細胞接種到6孔板中，每孔4×105細胞，培養24 h后細胞達到生長期，按照PolyJet DNA In Vitro Tranfection Reagent轉染試劑說明書，嚴格操作進行真核表達質粒轉染，每孔轉染操作如下，200 μL JetBuffer中加入1 μg pENTER-Csk-his重組質粒，輕柔混合后，按照比例1∶1、1∶2和1∶3分別加入1 μL、2 μL和3 μL PolyJet轉染試劑，輕柔混合，靜置15 min后，逐滴緩慢加入細胞中，輕輕搖勻，進行轉染。轉染后4 h更換新的含10%FBS的DMEM培養液，37℃，5% CO2條件下培養48 h。

1.2.5 Western blot鑒定Csk蛋白在細胞中的表達 分別收集加入1∶1、1∶2和1∶3不同比例的PolyJet轉染試劑轉染的293T細胞，棄去上清培養基后，每孔使用100 μL SDS-loading buffer直接加入細胞中，收集蛋白樣品，沸水中煮15 min，取出14 000 r/min室溫離心15 min。經12% SDS-PAGE進行蛋白電泳。用全濕法電轉移到0.22 μm的PVDF膜上，配置5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，去除封閉液后，加入1∶10 000的抗His抗體、1∶1 000的Csk抗體和1∶10 000的內參GAPDH抗體，4℃過夜；次日，去掉一抗后，用TBST工作液洗滌3次，每次10 min，加入1∶10 000的羊抗鼠二抗與1∶10 000的羊抗兔二抗，室溫孵育1 h；TBST工作液洗滌4次，每次10 min。使用GENE GNOME SYNGENE BIO IMAGING 儀器進行ECL顯影。

1.2.6 間接免疫熒光檢測Csk蛋白定位 按照上述最佳轉染方案，鋪板前在六孔板中放入高壓滅菌的玻璃片。將六孔板中已轉染48 h的轉染pENTERCsk-his的293T和轉染了pENTER空載體的293T細胞，用0.01 mol/L，pH7.4的PBS小心清洗3次每次3 min；4%的多聚甲醛固定爬片15 min后用PBS浸洗玻片3次，每次3 min；0.5%Triton X-100（PBS配制）室溫通透20 min，之后用PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS；在玻片上滴加血清，室溫封閉1 h；吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加入1∶2 000稀釋的His一抗并放入濕盒，4℃孵育過夜；PBST 浸洗爬片3次，每次3 min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加1∶10 000稀釋的羊抗鼠熒光二抗，濕盒中室溫孵育1 h最后再用PBST洗3次，每次3 min。滴加DAPI避光孵育5 min，對標本進行染核，使用PBST洗滌4次每次5 min；用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.7 SDS-PAGE鑒定293T細胞表達的重組蛋白Csk 將免疫印跡鑒定表達量比較高的樣品進行SDS-PAGE蛋白電泳，SDS-PAGE膠進行考馬斯亮藍染色，室溫條件下搖床上緩慢染色2 h。用考馬斯亮藍脫色液進行脫色處理至膠上蛋白條帶清晰，然后將膠片進行存照。

1.2.8 重組Csk-his蛋白的純化 按照上述轉染比例及轉染時間，進行10 cm皿轉染，分別收集4個轉染pENTER-Csk-his和pENTER空載體的293T細胞10 cm皿細胞，用4 mL細胞裂解液進行充分裂解，裂解后與4 mL Bingding Buffer（20 mmol NaH2PO4，0.5 mol NaCl，pH7.4） 混 合， 各 加 入400 μL用Bingding Buffer 洗滌3次后的鎳離子螯合的磁珠，在4℃垂直旋轉儀上反應1 h；使用Washing Buffer（20 mmol NaH2PO4，50 mmol咪 唑，0.5 mol NaCl，pH7.4）及磁力架進行洗滌，洗滌4次后將磁珠轉入新的1.5 mL EP管中，使用400 μL 含有100 mmol 咪唑的Elution Buffer（20 mmol NaH2PO4，100 mmol咪唑，0.5 mol NaCl，pH7.4）洗脫并收集純化的蛋白，再用含250 mmol咪唑的Elution Buffer洗脫并收集純化的蛋白。將收集的純化蛋白進行SDS-PAGE，用考馬斯亮藍進行染色鑒定純化結果。

1.2.9 His-pulldown及CO-IP檢測Csk的活性 據文獻報道，Csk與IGF1R相互作用［11］，與SHC1也有相互作用，為了檢測Csk的生物活性，進行his-pull down檢測IGF1R，運用CO-IP檢測SHC1［12］。

將0、1和2 mg純化的Csk蛋白（含有his-tag）分別與4×107的293T細胞裂解液混合反應4℃過夜，按照磁珠說明書進行his-pull down試驗，將收集的蛋白樣品按照1.2.5的步驟進行免疫印跡，其中一抗按照蛋白Marker大小在45-70 kD段孵育1∶1 000的Csk抗體，在70-130 kD處孵育1∶1 000的IGF1R抗體。

按照上述步驟構建pENTER-SHC1-his重組質粒。將細胞分別進行pENTER-Csk-his單轉293T、pENTER-Csk-his和 pENTER-SHC1-his共 轉 293T，48 h后收集細胞裂解液。用1 mL細胞裂解液進行充分裂解后，10 000×g，4℃離心30 min；取離心后上清各加入2 μg抗Csk的抗體，在4℃垂直旋轉儀上反應過夜；每管中加入40 μL用細胞裂解液洗滌5次的proteinG填料，在4℃垂直旋轉儀上反應1 h；再次用細胞裂解液將吸附蛋白的填料洗滌5次，轉入新的1.5 mL EP管中，離心后去掉上清，向填料內加入50 μL的2×SDS-loading buffer，按照1.2.5的步驟進行免疫印跡，其中一抗為1∶10 000的Histag抗體。

2 結果

2.1 Csk基因PCR產物的鑒定

利用設計的引物以cDNA為模板PCR擴增Csk目的基因全長，PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約1 367 bp的特異性單一條帶，大小與預期相符（圖1）。

圖1 Csk基因PCR產物電泳圖

2.2 重組質粒pENTER-Csk-his的鑒定

將Csk基因克隆進入pENTER載體后，轉化感受態TOP細胞，用限制性內切酶對重組質粒進行雙酶切鑒定（圖2）。在約1 367 bp和7 510 bp處分別可見Csk基因與pENTER質粒的條帶。測序結果比對正確，不存在突變。

圖2 重組質粒pENTER-Csk-his的雙酶切鑒定結果

2.3 Western blot鑒定不同PolyJet與重組pENTER

Csk-his載體比例的轉染效果

收集PolyJet與重組pENTER-Csk-his載體不同比例轉染293T 48 h后的細胞，Western blot鑒定結果（圖3-A）顯示，轉染了重組質粒pENTER-Cskhis的細胞中可見到51 kD左右的帶有his標簽的目的條帶，而轉染空載體的對照組細胞中未能檢測到特異性條帶，表明重組真核表達質粒pENTERCsk-his在293T細胞中成功表達，使用Csk抗體的Western blot結果（圖3-B）也顯示表達的重組蛋白為Csk蛋白。而轉染試劑與載體的比例會影響蛋白表達的量，pENTER-Csk-his∶PolyJet為1∶3時，Western blot條帶最明顯，因此1∶3為最佳轉染試劑比例。

圖3 Western blot檢測轉染pENTER-Csk-his的表達情況

2.4 間接免疫熒光檢測Csk蛋白定位

通過使用his-tag抗體進行間接免疫熒光檢測可以定位融合表達的Csk-his在細胞內的位置，結果（圖4）顯示Csk-his表達成功且主要在細胞質中表達。

2.5 SDS-PAGE鑒定重組蛋白Csk的高效表達與純化

將經Western blot鑒定表達量較高的樣品進行SDS-PAGE電泳，經考馬斯亮藍染色、脫色后，可明顯看到蛋白表達（圖5-A），說明pENTER-Csk-his重組載體能夠在293T中高效表達重組蛋白。使用鎳螯合的磁珠進行純化，純化后的蛋白樣品進行SDSPAGE電泳，可看到蛋白獲得有效純化（圖5-B）。

圖4 Csk蛋白間接免疫熒光檢測定位

圖5 考馬斯亮藍染檢測轉染pENTER-Csk-his的表達（A）及純化（B）情況

圖6 Csk生物活性的檢測

2.6 His-pulldown及CO-IP檢測Csk的活性

將純化的Csk蛋白（含his標簽）與293T細胞裂解液（固有表達IGF1R）共孵育進行his-pull down實驗，收獲蛋白進行Westblot分析，Csk抗體檢測到分子量在45-70 kD段的Csk蛋白，IGF1R抗體檢測到分子量在70-130 kD處的IGF1R蛋白，說明重組表達的Csk蛋白能夠與細胞裂解液中的IGF1R相互作用（圖6-A）。單轉Csk和共轉Csk、SHC1的蛋白樣品通過使用Csk抗體進行IP后，再使用his-tag抗體進行Western blot（圖6-B）分析，可見共轉染組中Csk抗體能夠拉下Csk和SHC1兩條帶，說明細胞共轉染的Csk與SHC1能夠相互作用。

3 討論

Src酪氨酸激酶家族與細胞內多條信號傳導途徑有關，其相關基因參與多種重要的生理過程如生長、分化、黏附、轉錄［3］以及某些病理過程如腫瘤的EMT［13］等。目前已有多種酪氨酸激酶抑制劑被嘗試用于疾病治療，如nintedanib［14］、FB2［15］和TKI［16］等，其中有些藥物已經進入臨床試驗階段。Csk作為SFKs的天然抑制劑，在細胞的增殖、凋亡、轉移等過程中起到重要作用，可以通過抑制SFKs的致癌活性發揮抑制腫瘤的作用。Nada等的實驗證明Csk缺失會導致鼠胚胎發育停滯，生長緩慢，還會因神經管缺陷使鼠胚胎死亡。Csk的過表達能抑制人結腸癌細胞的腫瘤生長［17］；使用慢病毒高表達Csk能夠抑制SRC激酶的活性從而降低結腸癌的轉移［18］，Csk的過表達通過與V-Crk的相互作用抑制成纖維細胞的轉化，起到負調控SFKs的作用［19］；Csk的減少會引起急性炎癥反應功能障礙［20］和T細胞分化［9］，還會引起表皮增生［21］、細胞黏附缺陷和遷移［22］等的增加。因此，Csk可能成為一種潛在的抗腫瘤候選蛋白，有必要對其功能及其抑制SFKs的機制進行深入研究。

目前對于Csk抑制SFKs的作用機制尚不明確，一種觀點認Csk和活化的SFKs同時結合到同一蛋白如CBP、Caveolin-1、Paxillin等［17，23］，由此使它們靠近并通過Csk使SFKs有效失活，從而達到Csk抑制SFKs的作用。也有研究［24］表明，SFKs是膜相關蛋白，而Csk是一個細胞質蛋白，因此需要與膜上的配體如Cbp或Cav-1結合，才能聚集到膜上來介導SFK的抑制。

獲得有活性的Csk蛋白是進一步研究其功能和作用機制的前提。本研究利用RT-PCR技術得到Csk基因，并將Csk基因連接到真核表達載體pENTER上，通過酶切鑒定和質粒測序結果證明融合蛋白真核表達載體成功。再利用瞬時轉染技術、免疫印跡的方法及考馬斯亮藍染色驗證Csk在真核細胞293T中正確表達。通過間接免疫熒光定位了表達的Csk蛋白，通過his-pulldown及CO-IP的方法鑒定出Csk與IGF1R、SHC1的相互作用，從而確定表達的Csk蛋白能夠參與到細胞的信號通路中，具有生物學活性，為后續研究Csk的作用機制奠定基礎。

4 結論

成功構建真核表達載體pENTER-Csk-his，并且重組蛋白在293T中得到高效表達。鑒定了Csk與IGF1R、SHC1的相互作用，說明表達的Csk蛋白具有生物學活性。

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（責任編輯 馬鑫）

Eukaryotic Expression，Purification and Activity Testing of Human C-Src Protein Tyrosine Kinase

XU Lan XIAO Bin CHEN Hui-qin LI Xiao-rong HAO Wen-bo
（Institution of Antibody Engineering in Southern Medical University，Guangzhou 510515）

The objective of this work is to construct a eukaryotic expression vector for the C-Src tyrosine kinase（Csk）gene from human. Total RNA was extracted from HeLa cells. The full-length cDNA sequence of Csk gene was isolated and amplified via RT-PCR，and cloned into a eukaryotic expression vector pENTER，the recombinant pENTER-Csk-his plasmid was constructed. The recombinant plasmid was transfected into 293T cells，after 48 hours，the expression levels of Csk protein were determined by SDS-PAGE and Western blot. The localization of Csk protein was detected via indirect immunofluorescence，and the protein Csk was purified by nickel chelate beads；in addition，the activity of the protein was measured via his-pulldown and CO-IP. Results showed that：Double digestion and sequencing reveled that recombinant plasmid pENTER-Csk-his was constructed properly without mutation. Both SDS-PAGE and Western blot detected a 51 kD protein，indicating that Csk protein was expressed successfully in the 239T cells. The indirect immunofluorescence confirmed the expression of Csk protein in cytoplasm. Finally，the purified protein Csk by nickel chelate beads interacted with the IGF1R and SHC1 by his-pulldown and CO-IP. Conclusively，this study successfully acquired the full-length sequence of Csk，the eukaryotic expression vector pENTER-Csk-his was constructed，and the gene was expressed efficiently in 293T cells，moreover，the expressed protein presented bioactivity.

Csk gene；293T cells；eukaryotic expression；purification；activity testing

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.010

2015-11-24

國家高技術研究發展計劃（“863”計劃）（2014AA020904）

徐嵐，女，碩士研究生，研究方向：蛋白質相互作用；E-mail：jiangnanlanny@126.com

郝文波，女，博士，教授，研究方向：病原體與宿主相互作用、免疫診斷技術及抗體工程；E-mail：haowa@126.com