三疣梭子蟹腺苷酸轉移酶（ANT）基因的克隆與分析

李冰玥 朱冬發 邱錫爾 周彥琦 柳志業 謝熙

（寧波大學海洋學院，寧波 315211）

三疣梭子蟹腺苷酸轉移酶（ANT）基因的克隆與分析

李冰玥 朱冬發 邱錫爾 周彥琦 柳志業 謝熙

（寧波大學海洋學院，寧波 315211）

腺苷酸轉移酶（Adenine nucleotide translocase，ANT）是線粒體內膜上負責能量分子傳導的轉運蛋白，在能量代謝中起著關鍵作用。為了研究ANT基因在甲殼動物蛻皮中的作用，采用RT-PCR和cDNA末端快速擴增技術（RACE技術）克隆得到三疣梭子蟹ANT基因的序列全長（GenBank登錄號：KM921660），該序列全長1 414 bp，包括132 bp的5'端非編碼區，352 bp的3'段非編碼區，具有930 bp的完整開放閱讀框（ORF），編碼309個氨基酸。將該ANT基因序列推導的氨基酸序列與已公布的其他物種ANT序列進行系統進化樹分析發現，三疣梭子蟹ANT基因與其他甲殼動物ANT基因聚為一支，其中與擬穴青蟹ANT一致性高達96%。通過氨基酸序列比對發現，三疣梭子蟹ANT序列具有3個保守的線粒體穿膜功能結構域，是形成能量分子傳導的轉運通道，催化細胞質中ADP和線粒體內ATP間進行跨膜交換。采用實時熒光定量PCR技術，分析三疣梭子蟹ANT基因的組織差異表達，結果表明ANT基因在三疣梭子蟹肌肉（Ms）中的表達量最高，在其他組織中表達量均較低，具顯著差異（P<0.05）；在三疣梭子蟹蛻皮周期中，肌肉中ANT基因的表達量A期最高（P<0.05），然后下降，至C期最低，隨后又逐漸上升至D1期，在D1期出現第2個峰值后再逐漸下降。研究結果說明ANT基因與三疣梭子蟹肌肉活動密切相關，可能在蛻皮調控中發揮重要作用。

三疣梭子蟹；腺苷酸轉移酶；克??；能量轉運；表達水平

腺苷酸轉移酶（Adenine nucleotide translocase，ANT）屬于真核細胞線粒體內膜上的轉運蛋白家族成員［1-3］，作為代謝物載體參與線粒體的各種活動［2，4，5］。ANT在線粒體內膜上分布最為豐富，約占細胞線粒體總蛋白的1%-10%［6］，其主要功能是催化細胞質中ADP和線粒體內ATP間進行跨膜交換，是保持細胞內能量平衡的關鍵成分［7］。近年來的研究表明，ANT 在線粒體內膜的穿膜孔洞的形成和細胞凋亡誘導過程中起重要作用［8-10］，是各種細胞凋亡因子或凋亡抑制因子的作用靶位［11-14］。生物體大約1/3-1/2的基礎電子傳遞由ANT催化，它是保持細胞內能量代謝的關鍵蛋白［15，16］，另也有研究表明，ANT 參與了腫瘤壞死因子誘導的細胞凋亡［17］。

ANT 蛋白通過兩個分別含有ATP/ADP 結合位點的亞基的構象變化來實現細胞質中ADP和線粒體內ATP 間的跨膜交換［18］，是生物體內能量產生和消耗的重要連接［19］。大多數真核生物至少有2個不同的ANT基因［16］，目前已從凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）、斑節對蝦（Penaeus monodon）、擬穴青蟹（Scylla paramamosain）等甲殼動物中克隆到其同源基因，它們在進化上高度保守。但至今尚未見三疣梭子蟹ANT基因的相關報道。

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）是我國沿海的重要經濟蟹類，蛻皮是甲殼動物蛻去舊的外骨骼，個體增大后新甲殼迅速硬化為外骨骼的過程。但是，到目前為止，對其蛻皮發生的機制仍然不是很清楚，特別是其蛻皮周期的分子調控機理。因此，本研究克隆了三疣梭子蟹ANT的cDNA序列，并對其組織差異表達和蛻皮周期中的表達變化進行了分析，旨在對闡明三疣梭子蟹蛻皮的分子調控機理提供一定的基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗取材的三疣梭子蟹暫養于寧波市寧?？h得水育苗場。采用形態觀察法將三疣梭子蟹的蛻皮周期分為蛻皮后期（A期和B期）、蛻皮間期（C期）、蛻皮前期（D0、D1、D2、D3和D4亞期）和蛻皮期（E期）4個階段［20］。解剖取C期三疣梭子蟹大顎器、Y器、肌肉、腦、心臟、眼柄、胸神經節、腸、表皮和肝胰腺用于組織表達差異性分析，采集各期（除E期外）三疣梭子蟹肌肉組織進行蛻皮周期中ANT基因的表達差異變化分析。蛻皮周期各期均選取4只螃蟹做平行實驗，由于E期的時間較短不利于采集到適合做統計分析的樣本，故只采集了其他各期的樣本。解剖獲得的新鮮組織暫時浸泡于RNA保護液（生工生物工程（上海）有限公司）中，置于-20℃暫存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 將保存在RNA保護液中的樣品轉移至Trizol（生工生物工程（上海）有限公司）溶液中，按說明書所述步驟提取各個樣品中的總RNA。

1.2.2 cDNA的合成 取Ms組織提取的總RNA，按 照 PrimeScriptRTreagent Kit（Perfect Real Time，TaKaRa）試劑盒說明書步驟，反轉錄得到第一鏈cDNA。3'-RACE擴增所需的3'-RACE-cDNA以AP（表1）為接頭引物，參照上述方法反轉錄獲得；5'-RACE擴 增 所 需 的5'-RACE-cDNA按 照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒說明書合成。cDNA均置于-20℃下保存備用。

1.2.3 三疣梭子蟹ANT基因核心片段的擴增 根據NCBI已公布的甲殼動物ANT核苷酸序列，利用primer5.0軟件設計并篩選出一對引物ANT-F，ANT-R（表1）。以第一鏈cDNA為模板，進行PCR擴增（體系為25 μL，擴增條件：95℃預變性5 min；95℃ 50 s，57℃ 50 s，72℃ 50 s，34個循環；72℃充分延伸5 min，反應結束）。擴增產物經過電泳、瓊脂糖凝膠回收并純化，與pMD18-T載體連接再轉入E.coli DH5α感受態細胞。經過菌落PCR檢測后挑選陽性克隆菌落，擴大培養后將菌液送至生工生物工程（上海）有限公司測序。

1.2.4 三疣梭子蟹ANT基因3'RACE和5' RACE的擴增 根據已測得的核心序列和AP接頭分別設計特異性引物ANT-3F1、ANT-3F2、ANT-3F3和3'outer、3'inner（表1），進行巢氏PCR擴增。第一輪PCR以3'RACE-cDNA為 模 板，ANT-3F1、ANT-3F2和3'outer為上下游引物進行PCR擴增（體系為25 μL，擴增條件：95℃預變性5 min；95℃ 50 s，56℃ 50 s，72℃ 50 s，34個循環；72℃充分延伸5 min，反應結束）。第二輪以第一輪擴增產物為cDNA模板，ANT-3F2、ANT-3F3和3'inner為上下游引物進行PCR擴增（體系為25 μL，擴增條件：95℃預變性5 min；95℃ 50 s，57℃ 50 s，72℃ 50 s，34個循環；72℃充分延伸5 min，反應結束）。

3'RACE產物的測序結果，按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit 說明合成5' RACE-cDNA并設計下游特異性引物ANT-5R1、ANT-5R2、ANT-5R3，以5'outer、5'inner（表1）為上游引物，同理進行兩輪PCR擴增。后續操作參照1.2.3。

表1 PCR引物序列

1.2.5 序列分析 利用Vector NTI 10.0測序軟件將核心序列和3'RACE和5'RACE的測序結果進行拼接，獲得三疣梭子蟹ANT基因的cDNA全長。利用NCBI 在線ORF Finder工具確定ANT基因的開放閱讀框（ORF）序列，并翻譯成氨基酸序列；利用ClustalX軟件將該氨基酸序列與已公布的ANT氨基酸序列進行同源性比對分析，并用MEGA 4.0軟件構建系統進化樹；利用ExPASy Proteomics Server（http://ca.expasy.org/）所提供的ProtParam tool蛋白質分析軟件分析氨基酸序列；使用Signal 3.0 Server（http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）預測信號肽，TMHMM在 線 工 具 （http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/）預測氨基酸跨膜區域。

1.2.6 實時熒光定量（qRT-PCR） 取需要的組織利用與1.2.1相同的 Trizol 法抽取總RNA后，取1.0 μg RNA用 PrimeScript Rtreagent Kit（Perfect Real Time）試劑盒反轉錄得到cDNA。根據 ANT cDNA 全長設計一對特異性引物ANTYG-F1和ANTYG-F2（表1）檢測ANT基因在不同組織中的表達量，以β-actin作為內參。qRT-PCR的反應條件：95℃ 2 min；95℃ 5 s，55.3℃ 20 s，68℃ 20 s，共40個循環；95℃ 15s，55℃ 15 s，升溫25 min，95℃ 15 s。用SPSS17.0統計分析軟件對獲得的數據進行分析。

2 結果

2.1 三疣梭子蟹ANT基因cDNA全長與序列分析

基于ANT基因的同源核苷酸序列，利用primer5.0設計兩對引物ANT-F和ANT-R進行PCR克隆得到1 091 bp的核心序列。3'RACE 以ANT-3F1、ANT-3F2、ANT-3F3和 3'outer、3'inner為 引物，擴增獲得903 bp的3'端片段；5'RACE以ANT-5R1、ANT-5R2、ANT-5R3和5'outer、5'inner為引物，擴增得535 bp的5'端片段。通過拼接后獲得總長為1 414 bp的ANT序列cDNA全長，GenBank登錄號：KM921660。5'端非編碼區為132 bp，3'端非編碼區為352 bp，開放閱讀框（ORF）長度為930 bp，編碼309個氨基酸。利用ExPASy網站在線ProtParam tool預測其分子式為C4185H6958N1414O1752S351，分子量大小約為116 368.7 Da，預測等電點為4.98，富含Gly（27.9%）、Cys（24.8%）、Thr（23.8%）、和Ala（23.5%）等。不穩定系數為42.42，說明三疣梭子蟹ANT蛋白并不穩定。該氨基酸親水性總和G RAVY（Gran d average of hydropathicity）為0.765，屬于親水性蛋白。

在線Signal軟件（http:// www.cbs.dtu.dk/ser vices/ SignalP）對其編碼區氨基酸序列進行分析，未 發現有信號肽，說明三疣梭子蟹ANT不屬于分泌蛋白。在線TMHMM工具分析發現該氨基酸序列沒有跨膜結構。NCBI在線Conserved Domain Search工具對氨基酸序列進行結構域分析，發現ANT蛋白具有3個重復的同源的線粒體跨膜結構域，分別在第148-441位、466-756位、754-1044位（圖1）。在NCBI上將該序列編碼區氨基酸序列進行BLAST搜索比對，BLAST結果發現，與已公布的其他物種ANT氨基酸序列相比，PtANT與擬穴青蟹（S. paramamosain）的ANT一致性最高，達到96%，與凡納濱對蝦（L. vannamei）、斑節對蝦（P. monodon）和日本囊對蝦（M. japonicus）的ANT也均達到90%左右，與昆蟲和脊椎動物的ANT也有較高的一致性，達到68%以上（圖2）。從NCBI蛋白序列數據庫中選取具有代表性的甲殼動物、昆蟲和脊椎動物ANT氨基酸序列，用MEGA 4.0軟件的鄰位法（Neighbor-Joining）構建系統進化樹，設置重復次數（Replications）為1 000。從進化樹結果（圖3）來看，三疣梭子蟹與擬穴青蟹親緣關系最近，而后與凡納濱對蝦、斑節對蝦、日本囊對蝦等甲殼動物聚為一支；肩突硬蜱（Ixodes scapularis）、黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）等昆蟲聚為一大支后與脊椎動物的ANT1、ANT2、ANT3三種亞型聚為一大支，最后脊椎動物的ANT4亞型單獨聚為一支，符合生物進化上的地位關系。

圖1 三疣梭子蟹ANT全長cDNA核苷酸序列和編碼區氨基酸序列

2.2 ANT基因在三疣梭子蟹不同組織中的表達差異分析

采用熒光定量PCR檢測了三疣梭子蟹ANT基因在心臟、肝胰腺、表皮、胸腺神經節、腦、肌肉、Y器、眼柄、大顎器和腸共10個組織中的表達相對量。結果（圖4）顯示，該基因在肌肉（Ms）中的表達量最高（P<0.05），大顎器等9種組織中的表達量均較低。

文中在研究Minimax算法的基礎上，通過將Minimax算法轉化為可以求解的非線性規劃問題對多口徑多波束反射面天線進行賦形。為說明問題，設定參數建模設計了一個四口徑多波束天線，將口徑面的相位值作為優化對象，由口徑場法根據口徑面的電場值和設定的相位值，求得遠區場的場值。將其中的邊緣波束增益和副瓣電平值作為目標函數，通過優化得到賦形后的口徑面相位值，然后離散化反射面得到賦形后反射面上任一點的位置信息，得到重構后的反射面，從而達到提高天線C/I值的目的。賦形后的反射面其C/I值相比于賦形前提高2 dB，達到了比較好的目的，具有一定的工程應用的價值。

2.3 ANT基因在蛻皮周期的表達水平分析

組織表達結果顯示，ANT基因在三疣梭子蟹Ms中表達量最高，所以選擇Ms為實驗材料進行ANT基因在蛻皮周期中的表達水平變化分析。qRT-PCR的結果（圖5）表明三疣梭子蟹Ms中的ANT基因在整個蛻皮周期中均有表達，在蛻皮A期最高，降低至C期最低，再逐漸升高在D1期達到第二個小高峰，隨后又逐漸下降，最終在D4期降至最低。

圖2 三疣梭子蟹與其它物種ANT氨基酸序列多重比對結果

3 討論

線粒體是細胞內主要的ATP生產中心，ANT在催化細胞質中ADP和線粒體內ATP進行跨膜交換時起著重要的作用，是保持細胞內能量平衡的關鍵成分。本實驗克隆得到了三疣梭子蟹ANT的全長cDNA序列（PtANT），該序列全長1 414 bp，包含一個930 bp的開放閱讀框（ORF），編碼309個氨基酸。PtANT主要由3個同源的線粒體跨膜結構域組成，分別在其第6-104位、113-209位和208-305位，每個結構域含2個跨膜區。這與目前已知許多物種的腺苷酸轉移酶具有相似的結構功能域。BLAST結果發現，與已公布的其他物種ANT氨基酸序列相比，PtANT與擬穴青蟹的ANT一致性最高，達到96%，與凡納濱對蝦、斑節對蝦和日本囊對蝦的ANT也均達到90%左右，與昆蟲和脊椎動物的ANT也有較高的一致性，達到68%以上。該結果表明各物種間的ANT具有良好的一致性，各物種ANT可能具有相似的功能。值得注意的是，進化樹結果顯示哺乳動物的ANT4單獨聚為一大支，而其他ANT亞型則與甲殼及昆蟲的ANT聚在一起，這說明本研究克隆得到的PtANT以及現有甲殼動物及昆蟲的ANT應該不屬于ANT4，但PtANT究竟屬于其他一種ANT還有待進一步研究。

圖3 三疣梭子蟹ANT氨基酸序列系統進化樹

圖4 ANT基因在三疣梭子蟹各組織中的相對表達水平

組織表達結果顯示PtANT在三疣梭子蟹各個組織中均有表達，其在肌肉中表達量最高，顯著高于其他各個組織。這可能與肌肉對線粒體提供的能量需求較大有關，再一次表明了ANT在保持細胞內能量平衡時的重要作用。該結果與孫文文等［20］在研究斑節對蝦ANT（PmANT）的結果相似。但斑節對蝦中PmANT在心臟中也有很高的表達，擬穴青蟹的ANT也在心臟中表達量最高，而本研究中PtANT在心臟中表達水平較低，這表明本研究克隆獲得的PtANT與斑節對蝦及擬穴青蟹的ANT在功能上可能并不一致。

圖5 Ms中ANT基因在三疣梭子蟹蛻皮周期中的相對表達差異

肌肉中的ANT基因在三疣梭子蟹蛻皮周期中的表達也有所差異。三疣梭子蟹ANT在蛻皮A期轉錄水平最高，這可能與三疣梭子蟹剛完成蛻皮過程有關。三疣梭子蟹蛻皮時肌肉消耗了大量能量；另一方面在蛻皮后仍需要繼續吸水增大體積［21］，還要消耗較多的能量，腺苷酸轉移酶的表達量也就相對較高。而在蛻皮間期（C期），三疣梭子蟹體內的含水量下降，營養物質開始積累，為下一次的蛻皮做物質準備，此時因為新表皮還沒有形成，能量消耗較少，所以ANT的表達量最低。D0期時，新殼開始分泌但還未成形，ANT的表達量開始逐漸升高，并保持在一個較高水平，從D1到D3，都處于新殼在不斷分泌的過程，所以腺苷酸轉移酶的相對表達量都較C期有所升高，為新表皮的生成提供所需的能量。

4 結論

本研究克隆了三疣梭子蟹ANT基因的cDNA全長，其氨基酸序列與擬穴青蟹的同源性最高。該基因在三疣梭子蟹心臟、肝胰腺、表皮、胸腺神經節、大腦、肌肉、Y器、眼柄、大顎器、腸組織中均有表達，在肌肉組織中的表達量最高。ANT基因在蛻皮后期A期中表達量最高，在蛻皮間期C期中表達量最低。說明ANT基因可能在蛻皮周期的能量轉運中起著重要的作用。

［1］Monica S, Cecilia L, Cecilia S. The evolution of the adenine nucleotide translocase family［J］. Gene, 2004, 333：51-59.

［2］Bof M, Brandolin G, Satre M, et al. The mitochondrial adenine nucleotide translocator from Dictyostelium discoideum, functional characterization and DNA sequencing［J］. Eur J Biochem, 1999, 259（3）：795-800.

［3］Martin DB, Julian LP, Augustine O, et al. The basal proton conductance of mitochondria depends on adenine nucleotide translocase content［J］. Biochem J, 2005, 392：353-362.

［4］Santamaria M, Lanave C, Saccone C. The evolution of the adenine nucleotide translocase family［J］. Gene, 2004, 333：51-59.

［5］Brand MD, Pakay JL, Ocloo A, et al. The basal proton conductance of mitochondria depends on adenine nucleotide translocase content［J］. Biochemical Journal, 2005, 392：353-362.

［6］Niu BL, Weng HB, He LH, et al. Cloning and analysis of adenine nucleotide translocase gene in Helicoverpa armigera［J］. Hereditas, 2008, 30（1）：81-86.

［7］Atlante A, Bobba A, De Bari L, et al. Caspase-dependent alteration of the ADP/ATP translocator triggers the mitochondrial permeability transition which is not required for the low-potassium-dependent apoptosis of cerebellar granule cells［J］. J Neurochem, 2006, 97（4）：1166-1181.

［8］Walther T, Tsch?pe C, Sterner-Kock A, et al. Accelerated mitochondrial adenosine diphosphate/adenosine triphosphate transport improves hypertension-induced heart disease［J］. Circulation, 2007, 115（3）：333-344.

［9］Halestrap A. Biochemistry：a pore way to die［J］. Nature, 2005, 434：578-579.

［10］Kantrow SP, Tatro LG, Piantadosi CA. Oxidative stress and adenine nucleotide control of mitochondrial permeability transition［J］. Free Radical Biology and Medicine, 2000, 28（2）：251-260.

［11］Garcia N, Mart Nez-abundis E, Pav NN, et al. Copper induces permeability transition through its interaction with the adenine nucleotide translocase［J］. Cell Biological International, 2007, 31（9）：893-899.

［12］Monkkonen H, Auriola A, Lehenkari P, et al. Anew endogenous ATP analog（ApppI）inhibits he mitochondrial adenine nucleotide translocase（ANT）and is responsible for the apoptosis induced by nitrogen-containing bisphosphonates［J］. British Journal of Pharmacology, 2006, 147：437-445.

［13］Atlante A, Bobba A, De Bari L, et al. Caspasedependent alteration of the ADP/ATP translocator triggers the mitochondrial permeability transition which is not required for the low-potassium-dependent apoptosis of cerebellar granulecells［J］. Journal of Neurochemistry, 2006, 97（4）：1166-1181.

［14］Klingebberg M. Transport viewed as a catalytic process［J］. Biochimie, 2007, 89（9）：1042-1048.

［15］Zhang YQ, Roote J, Brogna S, et al. Stress sensitive Bencodes an adenine nucleotide translocase in Drosophila melanogaster［J］. Genetics, 1999, 153（2）：891-903.

［16］Brustovetsky N, Klingenberg M. Mitochondrial ADP/ATP carrier can be reversibly converted into a large channel by Ca2+［J］. Biochemistry, 1996, 35：8483-8488.

［17］Yang Z, Cheng W, Hong L, et al. Adenine nucleotide（ADP/ATP）translocase 3 participates in the tumor necrosisfactor induced apoptosis of MCF-7 cells［J］. Molecular Biology of the Cell, 2007, 18（11）：4681-4689.

［18］Thuswaldner S, Lagerstedt J O, Rojas-Stutz M, et al. Identification, expression, and functional analyses of a thylakoid ATP/ADP carrier from Arabidopsis［J］. Journal of Biochemistry, 2007, 282：8848-8859.

［19］Doerner A, Pauschinger M, Badorff A, et al. Tissue-specific transcription pattern of the adenine nucleotide translocases isoforms in humans［J］. FEBS Letters, 1997, 414：258-262.

［20］孫文文, 周發林, 黃建華, 等. 斑節對蝦腺苷酸轉移酶（PmANT）基因的cDNA 克隆與表達分析［J］. 上海海洋大學學報, 2013, 22（1）：7-16.

［21］沈潔, 朱冬發, 胡則輝, 等. 三疣梭子蟹蛻皮周期的分期［J］.水產學報, 2001, 35（10）：1481-1487.

（責任編輯 李楠）

Cloning and Analysis of Gene for Adenine Nucleotide Translocase in Portunus trituberculatus

LI Bing-yue ZHU Dong-fa QIU Xi-er ZHOU Yan-qi LIU Zhi-ye XIE Xi
（School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211）

Adenine nucleotide translocase（ANT）is a transport protein responsible for the conduction of energy molecules in the inner membrane of mitochondria，playing a vital role in the energy metabolism. In order to study the role of ANT gene in the molting of crustacean，a full-length cDNA of ANT gene（GenBank access number：KM921660）was cloned from Portunus trituberculatus using RT-PCR and RACE. Sequence analysis showed that it was 1 414 bp long，including a 132 bp 5' non-coding region，a 352 bp 3' non-coding region，and a 930 bp coding region，and encoded 309 amino acids. The phylogenetic comparison of ANT gene sequence between P. trituberculatus and other species revealed that ANT gene from P. trituberculatus and other species clustered as one same branch，and the similarity with Scylla paramamosain was up to 96%. Amino acid alignment proved that it had 3 conserved mitochondrial transmembrane domains，forming a channel for the conduction of energy molecules，and catalyzing transmembrane exchange between ATP in mitochondria and ADP in cytoplasm. Real-time PCR results indicated that ANT gene expressed in all 10 different tissues with the highest expression in muscle，while quite low in all other tissues，and there were significant differences among the expressions of the tissues（P<0.05）. During the whole molting process，the level of ANT in muscle reached the maximum at postmolt（stage A），then began to decline until the least during intermolt（stage C），and then gradually rose until the second peak at stage D1，then declined again. The combined result indicated that ANT gene was closely correlated with the activity of muscle of P. trituberculatus，and might play an essential role in the molting.

Portunus trituberculatus；ADP/ATP translocases（ANT）；clone；energy transportation；expression level

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.016

2015-06-08

國家自然科學基金項目（41376152），浙江省自然科學基金項目（LY13C190006）

李冰玥，女，研究方向：甲殼動物發育生物學；E-mail：15757828736@163.com

朱冬發，男，博士，教授，研究方向：甲殼動物發育生物學；E-mail：zhudongfa@nbu.edu.cn