一株堿蓬內生真菌的鑒定及促生活性產物的初步研究

于飛 谷玥 張奇 卜寧

（沈陽師范大學化學與生命科學學院，沈陽 110034）

一株堿蓬內生真菌的鑒定及促生活性產物的初步研究

于飛 谷玥 張奇 卜寧

（沈陽師范大學化學與生命科學學院，沈陽 110034）

對遼寧盤錦紅海灘的鹽生堿蓬內生真菌JP4-1進行鑒定并研究其促生活性產物成分。根據形態學特征及18S rDNA序列分析對菌種進行鑒定，運用過濾離心、超聲破碎、萃取、旋蒸等技術提取活性成分，并采用水培法研究該菌株發酵液對水稻幼苗的促生長活性。結果顯示，經鑒定，JP4-1菌株為小叢殼屬（Glomerella sp.），菌絲分枝，有隔，產孢；以正丁醇處理的JP4-1菌株胞外發酵液的小分子萃取物可使水稻幼苗的株高和葉片干重分別提高10.84%和14.67%，葉綠素含量提高44.22%，促生長效果明顯。堿蓬內生真菌JP4-1的胞外發酵產物對水稻幼苗具有明顯的促生長作用，其中以正丁醇萃取得到的小分子活性產物促生效果最為顯著。

堿蓬內生菌；鑒定；促生活性

植物內生菌是指一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內部而不使植物患病的真菌或細菌［1］。植物內生菌與其宿主植物互惠共生，協同進化，可以產生具有多種生物學功能的活性代謝產物［2］。1993年，Stierle等［3］從短葉紅豆杉Taxus brevifolia的韌皮部分離到一株產抗癌物質紫杉醇的內生真菌。從此掀起了對植物內生菌研究的熱潮。植物內生真菌產生的次生代謝產物具有豐富的生物學功能多樣性和化學結構多樣性，這些次生代謝產物從功能作用上可分為抑菌物質類、殺蟲物質類、植物生長調節劑類、抗腫瘤活性物質類及其他類型的活性產物［4］。目前，大多數研究認為，植物內生真菌代謝產物生物學活性作用機制在于其存在著與宿主植物相似的基因結構，誘導宿主基因的表達，調節宿主植物體內的代謝途徑，從而實現對宿主植物的促生作用［5］。

堿蓬（Suaeda salsa）是生長于高鹽堿土壤中的一種特殊植物，具有抗鹽堿、耐貧瘠，抗病蟲害同時可以適應高濕度環境等特點。堿蓬可以降低土壤含鹽量，增加土壤有機質含量［6］，加速潮灘土壤化過程，被譽為鹽堿地改造的“先鋒植物”［7］。對堿蓬的蛋白質組學分析表明，相關蛋白質點的表達使堿蓬可通過光合作用，能量代謝，離子運輸，脅迫防御等多種途徑的協同作用耐受一定程度的鹽堿脅迫［8］；從堿蓬中分離得到的植物內生菌具有豐富的多樣性且多為可以生存于鹽堿環境的極端微生物。這種極端微生物一般具有與其生長環境相適應的特殊的代謝機制，能產生特殊的代謝產物，并對宿主產生一定的影響［9］。Khan等［10］認為，植物內生菌可以產生與植物激素相類似的生物活性成分，從而實現對植物的促生長作用。但是微生物代謝產物對植物促生機制的研究仍然較少。

本實驗室已經從盤錦紅海灘鹽生堿蓬中共分離得到122株堿蓬內生真菌，證實了堿蓬內生真菌具有豐富的多樣性［11］。本研究以從122株堿蓬內生真菌中篩選的JP4-1為實驗菌株，對其進行形態學、分子生物學鑒 定及生物學特性研究。利用超聲破碎、萃取等技術手段，通過水培試驗及測量水稻幼苗株高、葉片干重及葉綠素含量等生理指標等評價其代謝產物的促生長作用及具有促生活性的物質成分。旨在探究極端內生真菌與植物互作的作用機理，為植物內生菌（資源）活性產物的研究與開發提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 堿蓬內生真菌JP4-1菌株，由沈陽師范大學化學與生命科學學院微生物實驗室提供。

1.1.2 水稻種子 常規水稻遼星1號，由遼寧省稻作研究所提供。

1.1.3 主要試劑 乙酸乙酯、正丁醇、石油醚、真菌基因組快速提取試劑盒購自生工生物（上海）股份有限公司、Hoagland營養液：含0.5 mol/L Ca（NO3）2、0.5 mol/L KNO3、0.25 mol/L MgSO4、0.2 mol/L KH2PO4；50 mmol/L H3BO3、0.6 mmol/L MnSO4、0.3 mmol/L CuSO4·5H2O、0.7 mmol/L ZnSO4·7H2O、0.6 mmol/L H2MoO4、0.6 mmol/L Na2MoO4、20 mmol/L Na-EDTA、20 mmol/L FeSO4·7H2O。

1.1.4 培養基 馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基（PSA）：含20%馬鈴薯、2%蔗糖、2%瓊脂，120℃滅菌20min。馬鈴薯蔗糖培養基（PSB）：含20%馬鈴薯、2%蔗糖，120℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 JP4-1菌株的鑒定

1.2.1.1 JP4-1菌株的形態學特征觀察

（1）菌株活化：挑取保存于4℃冰箱中的JP4-1菌株接種于PSA斜面培養基，于25℃培養箱中培養至長滿菌落以活化菌種，備用。

（2）菌落形態觀察：接種活化后的JP4-1菌絲于PSA平板上，25℃倒置培養數天。期間每24 h觀察并記錄菌落直徑、菌落形態，有無色素生成等菌絲生長狀態。

（3）菌絲形態觀察：利用小室培養法對JP4-1菌株的菌絲形態進行觀察。用無菌玻璃棒沾取少量液體狀態下的PSA培養基，滴于無菌蓋玻片。待培養基凝固后，用無菌牙簽挑取少量活化的JP4-1菌絲接種于培養基表面，將蓋玻片倒扣于單凹玻片上，用凡士林封片；25℃培養數天。于顯微攝影系統下觀察菌絲形態。

1.2.1.2 JP4-1菌株的18SDNA序列分析 用真菌基因組快速提取試劑盒提取JP4-1的DNA。以菌株JP4-1基因組DNA為模板，以18S-ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和18S-ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'為引物進行PCR擴增。采用20 μL PCR反應體系，反應條件為：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，共35個循環；72℃延伸10 min；4℃保存。擴增產物由生工生物（上海）股份有限公司進行純化與測序，將獲得的18S rDNA序列在GenBank中通過BLAST進行同源性序列比對，使用MEGA6.0構建系統進化樹。

1.2.2 JP4-1菌株促生活性產物的分離

1.2.2.1 JP4-1菌株胞內、胞外產物的分離 將對數期生長（培養120 h）的JP4-1菌液用過濾器過濾，分別收集菌絲和發酵液。超聲破碎菌絲體細胞，溶于無菌水制成胞內產物溶液，而過濾后的發酵液為胞外產物溶液。

1.2.2.2 JP4-1菌株大分子胞外產物與小分子胞外產物的分離 收集培養對數期生長的JP4-1菌株發酵液600 mL，加入3倍體積的95%乙醇，攪拌并離心，分別收集上清和多糖等大分子物質沉淀，沉淀用60℃烘干至恒重。用旋轉蒸發器除盡上清中的乙醇，所得粘稠液體為小分子活性產物。

1.2.2.3 小分子活性產物的萃取 根據相似相溶的原理，用3種不同極性（乙酸乙酯、正丁醇和石油醚）的有機溶劑對上述JP4-1菌株發酵液中小分子胞外活性產物部分進行萃?。盒》肿踊钚援a物與乙酸乙酯等體積混合于分液漏斗，劇烈震蕩10 min后靜置分層，分離有機相，水相反復用乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取所得有機相。上一步中所得水相改用正丁醇重復萃取3次，合并有機相。剩余水相用石油醚以同樣的方法萃取3次，合并有機相。旋蒸除盡上述所得各有機相中的有機溶劑。

1.2.3 JP4-1菌株促生活性產物作用的測定

1.2.3.1 水稻幼苗的培育和處理 取飽滿健康的水稻種子，加水沒過水稻種子并于28℃黑暗處24 h，將水稻種子平鋪于濕潤的濾紙上并用濕潤的6層紗布覆蓋，置于30℃，催芽48 h，期間保持紗布濕潤。取發芽的水稻種子10 g平鋪于覆蓋紗網并裝滿Hoagland營養液的塑料燒杯（容積600 mL）中央。于人工氣候培養箱培養發芽的水稻種子至兩葉期。培養條件：第一階段：16 h，濕度80%，溫度28℃，光照100%；第二階段：8 h，濕度80%，溫度26℃，光照0%。培養過程中，每天補充營養液。水稻幼苗培養5-7 d后，除去其中長勢較弱的幼苗，棄盡原有的營養液，盡量使每盆的水稻幼苗的長勢、數量相同。用容器總容積5%的菌株活性產物不同部分的溶液作用于水稻幼苗，剩余液體用Hoagland營養液補齊。實驗組分組為：A組：胞外產物與胞內產物；B組：胞外小分子產物與大分子產物；C組：乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、石油醚萃取物。分別用以上液體處理兩葉期水稻幼苗。以容器總容積5%的去離子無菌水處理的水稻幼苗做對照組（CK）。隨機擺放于人工培養箱按上述條件繼續培養5-7 d，期間每天補充營養液并不斷變換每盆幼苗的位置，盡量使其受光均勻。

1.2.3.2 JP4-1菌株促生活性產物作用的測定 （1）水稻幼苗生長指標的測定：隨機抽取處理后培養7 d的水稻幼苗，測量其株高、根長。分離地上部分與地下部分，80℃烘干至恒重，分別測量水稻幼苗地上部分干重。記錄原始數據。（2）水稻幼苗葉綠素含量的測定：取新鮮水稻幼苗葉片0.1 g，剪碎置于10 mL離心管，加入乙醇丙酮（V/V =1∶1）混合液5 mL，黑暗處浸泡24 h后搖勻，為提取液。吸取提取液1 mL加入2 mL乙醇丙酮混合液，混勻。以3 mL乙醇丙酮混合液為空白調零，用分光光度計分別測量470 nm，645 nm，663 nm處的OD值。按如下公式計算水稻幼苗葉綠素的含量：

葉綠素a含量（Ca）（mg/g）=（12.7 × OD663-2.69 × OD645）× Vt × 稀釋倍數 /FW

葉綠素b含量（Cb）（mg/g）=（22.9 × OD645-4.68 × OD663）× Vt ×稀釋倍數/FW

葉綠素總量 = Ca + Cb

其中，Vt表示提取液體積（mL），FW表示葉片鮮重（g）。

1.2.4 數據處理與分析 將所得數據用SPSS 20.0和Microsoft Excel 2007軟件進行整理，統計分析。

2 結果

2.1 JP4-1菌株的鑒定

話語(4)盡管在結構上是完整的，但是，即使我們搞清楚了指示詞this的所指，仍不能確定這種鋼材對做什么來說是不夠結實的。(4a)只表達了一個弱命題或命題基，不是(4)的確切隱意。要想弄清該句的準確隱意，必須根據語境補充完善特定信息來實現話語的真值條件，從而得出該句的隱意(4b)。這個過程不僅受語義限定，也受語用制約。

2.1.1 JP4-1菌株的形態學特征 內生真菌JP4在PSA培養基上平均生長速度為10 mm/d，菌落白色，致密，均勻，潮濕，邊緣整齊。菌落背面生長后期會出現紅色和黑色色素（圖1）。JP4-1的菌絲在光學顯微鏡下呈無色，菌絲分枝，有隔，產孢（圖2）。

2.1.2 JP4-1菌株的18SDNA序列系統發育學分析 菌株JP4-1的18S rDNA序列經BLAST比對，可鑒定JP4-1菌株為小叢殼屬（Glomerella sp.），基因同源相似度達99%。MEGA6.0構建菌株的系統進化樹如圖3所示。

圖1 JP4-1的菌落形態

圖2 JP4-1的菌絲形態

2.2 JP4-1菌株對水稻幼苗的促生活性研究

2.2.1 JP4-1菌株胞內、胞外產物的促生活性

2.2.1.1 水稻幼苗生長指標 分別用胞外產物溶液和胞內產物溶液處理兩葉期水稻幼苗5 d后，分別隨機測量10株水稻幼苗的株高和葉片干重。結果（表1）表明，用胞外產物處理的水稻幼苗株高比對照組提高了8%，干重增加了11.11%。用胞內產物溶液處理的水稻幼苗株高相比對照組僅提高了2%，干重增加了3%，增加不顯著?？梢?，JP4菌株的胞外代謝產物對水稻幼苗的生長指標有一定的促進作用。

表1 JP4-1胞內產物與胞外產物對水稻幼苗的促生長作用

圖3 基于18S rDNA序列構建的JP4-1的系統進化樹

2.2.1.2 水稻幼苗葉綠素含量的測定 用胞外產物和胞內產物溶液分別處理的水稻幼苗，隨機抽取10株幼苗測量470 nm、645 nm、663 nm處的OD值，計算葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量。結果（圖4）表明，胞外產物處理的水稻幼苗葉綠素a和葉綠素總量相對于用無菌去離子水處理的對照組相比提高了10.89%和11.48%，差異顯著，胞內產物處理的實驗組的葉綠素含量與對照組相比提高不顯著。

圖4 JP4-1的胞外產物和胞內產物對水稻幼苗葉綠素含量的影響

2.2.2 JP4-1菌株大分子胞外產物與小分子胞外產物的促生活性

2.2.2.1 水稻幼苗生長指標 用醇沉法對菌株的胞外代謝產物進一步分離，用分離得到的小分子上清和粗多糖沉淀分別處理水稻幼苗，隨機測量10株水稻幼苗的株高和葉片干重，所得結果如表2所示。其中，小分子產物處理的水稻幼苗與對照（水處理）相比，株高和干重分別提高了19.77%和19.51%；而粗多糖等大分子沉淀物質處理的水稻幼苗株高僅提高了4.46%，葉片干重提高相對于對照組不顯著。

表2 JP4-1發酵液胞外小分子和胞外大分子對水稻幼苗生長指標的影響

2.2.3 JP4-1菌株胞外發酵液的小分子萃取物的促生活性

2.2.3.1 水稻幼苗生長指標 對JP4發酵液的小分子成分用乙酸乙酯、正丁醇和石油醚進一步萃取分離，用所得3種萃取產物處理水稻幼苗后的結果（表3）表明，乙酸乙酯萃取物和石油醚萃取物處理的水稻幼苗的株高和葉片干重與對照組相比提高不顯著，正丁醇萃取物可使水稻幼苗的株高和干重分別提高10.84%和14.67%，促生長作用最為顯著。

圖5 JP4-1發酵液胞外小分子物質和胞外大分子物質對水稻幼苗葉綠素含量的影響

表3 JP4-1發酵液小分子上清不同萃取成分對水稻幼苗生長指標的影響

圖6 JP4-1發酵液小分子上清不同萃取成分對水稻幼苗葉綠素含量的影響

2.2.3.2 水稻幼苗葉綠素含量 正丁醇萃取物處理后的水稻幼苗，葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總含量相比于對照組分別顯著提高了43.18%、48.05%和44.22%（圖6），乙酸乙酯萃取物和石油醚萃取物處理后水稻幼苗的葉綠素含量與對照組相比沒有顯著差異。

3 討論

植物內生真菌具有豐富的多樣性，廣泛分布于宿主植物的各大器官［12］。堿蓬內生真菌JP4-1是從堿蓬葉部分離純化得到的一種菌群，其分子鑒定為小叢殼屬（Glomerella sp.）。團隊以往的研究表明，在盤錦紅海灘堿蓬組織中，共分離到122株植物內生真菌，共13屬；其中，小叢殼菌屬占12.9%，共分離到15株，屬于堿蓬內生真菌中的主要菌群［13］。這與鈕旭光等［14］的調查結果是一致的。

近年來，微生物的活性代謝產物越來越受到廣泛的關注，已經成為一種非常重要的微生物資源。利用微生物活性產物制成的微生物生長促進劑，正成為農業環境友好型且能夠促進可持續發展的新興科技手段。目前，黑龍江等農業大省正逐步將微生物菌劑應用于固氮、解磷等農業生產實踐，取得了良好的經濟效益［15］。但是植物與微生物互作的機制研究仍然較少，多集中于對微生物生長促進劑作用機制的研究。其中，比較多的一種說法是植物內生菌能夠分泌植物激素或類似物促進植物生長［16］。王國基等［17］從玉米根際分離到的262株PGPR菌株中，有15株菌株具有分泌IAA的能力，對玉米具有良好的促生長作用。王維［18］分離到的5株半夏內生真菌均可產生一定量的IAA，但是不同菌株間產生的量有一定的差異，并且對宿主植物的促生狀況也不相同。本試驗以水稻幼苗植株的株高、葉片干重和葉綠素含量作為測量依據討論了堿蓬內生真菌JP4-1代謝產物的促生活性，測量這些生長參數能夠直觀反應水稻幼苗的生長狀況，葉綠素含量還能反應植物的營養狀況和健康狀況［19］，具有一定的研究意義。研究發現，經過菌株JP4-1胞外發酵產物處理的水稻幼苗生長狀況明顯優于對照組，葉綠素含量顯著提高。說明JP4-1菌株對水稻幼苗具有一定的促生長作用。

通過超聲破碎，萃取等手段對JP4的發酵產物進行分離、分析，發現有效的促生長物質為正丁醇的萃取產物，其在株高、干重以及葉綠素總量方面有明顯的促進作用。將萃取產物的具體成分利用液相色譜法進行分析，并與植物激素標準樣進行比對，目前初步確定含有植物生長素類物質，如細胞分裂素、赤霉素、生長素、脫落酸等植物生長激素成分。這與袁志林［20］的研究結果基本一致。但具體的成分與含量需在后續試驗中利用液相色譜、質譜分析和核磁共振技術予以進一步探究。以探討其具體成分及是否有新型促生物質的存在，從而進行其促生長機制的研究。在本研究水培水稻幼苗過程中發現，利用上清液的各萃取成分分別處理的水稻幼苗長勢明顯弱于用上清液各種成分混合處理的水稻幼苗，即上清中各成分聯合作用的促生效果優于上清萃取后各單一成分的作用效果，其機制如何，有待進一步探究。

4 結論

堿蓬內生真菌JP4-1，經rDNA-ITS序列分析鑒定為小叢殼屬（Glomerella sp.），其胞外代謝產物作用于水稻幼苗可使幼苗的生長指標和葉綠素含量顯著提高，有助于水稻幼苗的生長和有機物的合成。胞外代謝產物中正丁醇的萃取成分為水稻幼苗促生長最有效的活性成分。

［1］Stone JK, Bacon CE, White JFJr. An overview of endophytic microbes：endopytism defined［J］. Microbial Endophytes, 2000, 3-29.

［2］李玲玉. 植物內生菌Myrothecium roriclum次生代謝產物研究［D］. 揚州：揚州大學, 2014.

［3］Stierle A, Strobel G, Stierle D, et al. Taxol and taxane productionby Taxus brevifolia. An endophytic fungus of pacific yew［J］. Science, 1993, 260（9）： 214-216.

［4］易曉華. 植物內生真菌次生代謝產物研究進展［J］. 中國農學通報, 2009, 25（21）：255-260.

［5］Soliman SS, Trobacher CP, Tsao R, et al. A fungal endophyte induces transcription of genes encoding a redundant fungicide pathway in its host plant［J］. BMC Plant Biology, 2013, 26：13-93.

［6］趙可夫, 范海, 江行玉, 等. 鹽生植物在鹽漬土壤改良中的作用［J］. 應用與環境生物學報, 2002, 8（1）：31-35.

［7］任立軍. 堿蓬［J］. 特種經濟動植物, 2004（4）：26-27.

［8］魏磊. 鹽堿脅迫角果堿蓬幼苗的蛋白質組學研究［D］. 哈爾濱：東北林業大學, 2012.

［9］唐永紅, 曹庸, 盧成瑛, 等. 特殊生境微生物及其活性代謝產物研究進展［J］. 微生物學通報, 2006, 33（4）：163-166.

［10］Khan AL, Waqas M, Khan AR, et al. Fungal endophyte Penicillium janthinellum LK5improves growth of ABA-deficient tomato under salinity［J］. World J Microbiol Biotechnol, 2013, 29：2133-2144.

［11］趙穎, 于飛, 郭明敏, 等. 堿蓬內生真菌JP3的分離、鑒定及促生作用研究［J］. 沈陽師范大學學報：自然科學版, 2015, 33（1）：116-120.

［12］禹樂樂. 玉米內生真菌多樣性及其宿主關系研究［D］. 鄭州：鄭州大學, 2012.

［13］趙穎. 堿蓬內生真菌生物多樣性及促生活性JP3菌株的研究［D］. 沈陽：沈陽師范大學, 2015.

［14］鈕旭光, 宋立超, 韓梅, 肖亦農. 鹽生植物翅堿蓬的內生真菌多樣性分析［J］. 微生物學通報, 2012, 39（10）：1388-1395.

［15］殷博, 何鑫, 曹亞彬. 黑龍江省微生物肥料現狀與問題［J］.中國環境管理干部學院學報, 2011, 21（1）：49-51.

［16］袁志林, 戴傳超, 楊啟銀. 微生物源的植物生長促進劑研究的新進展［J］. 土壤肥料, 2004, 6：41-46.

［17］王國基. 根際促生專用菌肥研制及其對玉米促生作用的研究［D］. 蘭州：甘肅農業大學, 2014.

［18］王維. 半夏內生菌的分離及其內生真菌對宿主生長影響的研究［D］. 楊凌：西北農林科技大學, 2010.

［19］關麗, 劉湘南, 程承旗. 土壤鎘污染環境下水稻葉片葉綠素含量監測的高光譜遙感信息參數［J］. 光譜學與光譜分析, 2009, 10：2713-2716.

［20］袁志林. 一株廣譜內生真菌B3對水稻生長及生理影響研究［D］. 南京：南京師范大學, 2005.

（責任編輯 李楠）

The Identification of a Fungal Endophyte of Suaeda salsa and Preliminarily Research on Active Products of Promoting Growth

YU Fei GU Yue ZHANG Qi BU Ning
（College of Chemistry and Life Sciences，Shenyang Normal University，Shenyang 110034）

The purposes of this work are to identify the endophyte fungus JP4-1 of Suaeda salsa in Red Beach of Panjin，Liaoning Province，and to research the growth promotion activity of its metabolites. Endophytic fungus JP4-1 was identified using its morphological features and 18S rDNA，and several technical means such as filtering centrifuge，ultrasonic crushing，extraction，and rotary evaporateion were used to extract its active components，and hydroponic experiments were taken to test the growth promotion activity of its fermentation broth to rice seedlings. The JP4-1 was identified as Glomerella sp. with hyphae branched，septate，and producing spores. The result of hydroponic experiment revealed that the micromolecular products extracted from fermented liquid with n-butanol promoted the plant height 10.84%，dry weight of leaves 14.67%，and chlorophyll content 44.22% of the rice seedlings，i.e.，the growth promotion effects were remarkable. In conclusion，the extracellular fermentation products by the endophyte fungus JP4-1 of S. salsa significantly promoted the growth of rice seedlings，and the micromolecular active products extracted by n-butanol had the most significant promotion effects.

fungal endophyte；identification；growth promotion activity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.020

2015-09-09

國家自然科學基金資助項目（31270369），沈陽師范大學實驗中心主任基金資助項目（SY201102）

于飛，女，碩士研究生，研究方向：資源與應用微生物；E-mail：qq-yf@126.com

卜寧，女，碩士生導師，研究方向：資源與應用微生物；E-mail：309226126@qq.com