GC夾對三種食源性致病菌的rpoB-PCR-DGGE圖譜的影響

廖超張昭寰姚鑫謝晶張煒佳，3潘迎捷，3趙勇，3

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室，上海 201306；3.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306）

GC夾對三種食源性致病菌的rpoB-PCR-DGGE圖譜的影響

廖超1，2張昭寰1，2姚鑫1，2謝晶1張煒佳1，2，3潘迎捷1，2，3趙勇1，2，3

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室，上海 201306；3.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306）

旨在探討不同的GC夾以及GC夾連接引物的不同位置對3種食源性致病菌的DGGE圖譜結果的影響，合成6對RNA聚合酶β亞基編碼基因rpoB引物（rpoB 1-6），含3種不同GC夾（GC-1，GC-2，GC-3），且每種GC夾分別連接于正反引物5'端。應用rpoB-PCR-DGGE 對副溶血性弧菌（5株），單增李斯特菌（5株）和沙門氏菌（3株）進行分析，并與V3-PCR-DGGE和ERIC-PCR的圖譜及聚類分析結果進行比較。結果顯示，GC-3夾連接于反引物上的rpoB-PCR-DGGE分辨效果最好，分辨力指數達0.9，與ERIC-PCR相同，高于V3-PCR-DGGE。GC夾序列和連接引物位置均對rpoB-PCR-DGGE圖譜結果產生影響。選擇或設計無連續鳥嘌呤（G）排列的GC夾序列且將其連接于反引物5'端，均能有效提高rpoB-PCR-DGGE對食源性致病菌檢測與分型的效果。

副溶血性弧菌；單增李斯特菌；沙門氏菌；GC夾；rpoB-PCR-DGGE

近年來隨著分子生物學技術的迅速發展，出現了一系列的食源性致病菌流行病學調查方法，如脈沖電場凝膠電泳（PFGE）［1］、擴增片段長度多態性（AFLP）［2］、隨機擴增多態性（RAPD）［3］、重復元素多態性（REP-PCR）［4］，以及多位點序列分型（MLST）［5］等技術。其中，ERIC-PCR是基于“腸道細菌基因間重復序列”（Enterobacterial repetitive intergenic conse-nsus，ERIC）的分型方法，具有分辨率較高、準確性好、簡便快捷、無需特殊儀器等優點［6］。此外，變性梯度凝膠電泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）是一種廣泛應用于不同領域的微生物群落多樣性分析和種群動態監測的分子生物學技術。近幾年，DGGE技術也被應用于食源性致病微生物的快速檢測與分型［7］。

基于16S rDNA中V3區的PCR-DGGE常用于微生物群落多樣性分析和食源性致病菌的快速檢測與分型的研究［8，9］。但此方法同時存在一定的缺陷，如單一菌可能在DGGE指紋圖譜中含有多譜帶［10］。然而，RNA聚合酶β亞基的編碼基因rpoB具有高度的保守性，單拷貝以及更高分辨率的特點，與PCRDGGE技術相結合使得單一菌在DGGE指紋圖譜中只存在單譜帶，從而使得PCR-DGGE方法用于研究微生物群落 多樣性，微生物檢測與分型的結果更為準確［11］。為提高DGGE技術對DNA片段序列差異分辨率，通常在一 側引物5'端連接一段30-50 bp富含G、C堿基的DNA片段（GC夾）。Sheffield等［12］發現40 bp的GC夾足夠滿足DGGE對微生物多樣性的研究。然而，目前關于GC夾的變化對微生物群落多樣性和檢測分型結果影響的研究較少。

本研究以5株副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus），5株單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）和3株沙門氏菌（Salmonella spp.）為研究對象，討論不同GC夾和GC夾的不同引物連接位置（正反引物的5'端）對3種（13株）食源性致病菌的rpoBPCR-DGGE檢測與分型結果的影響，并與V3-PCRDGGE和ERIC-PCR兩種方法的結果進行比較。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 5株副溶血性弧菌：3株來源于美國典型菌種保藏中心（ATCC）：ATCC 33846、ATCC 33847、ATCC17802；1株來源于實驗室分離：F18；1株來源于臨床分離：O3：K6。5株單增李斯特菌均來自于ATCC：ATCC 19112、ATCC 19114、ATCC 19115、ATCC 19116、ATCC 19118。3株 沙 門 氏菌：2株來源于中國醫學微生物菌種保藏管理中心（CMCC）：腸炎沙門氏菌 CMCC 50041、乙型副傷寒沙門氏菌 CMCC 50094；1株來源于中國工業微生物菌種保藏中心（CICC）：鼠傷寒沙門氏菌 CICC 21484。

1.1.2 主要儀器與試劑 PCR擴增儀，德國Eppendorf公司；DGGE電泳儀The DcodeTMUniversal Mutation Detection System，美國Bio-Rad公司；TIANamp Bacteria DNA Kit，北京Tiangen公司；Premix rTaq，寶生物工程（大連）有限公司。胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、溶菌肉湯（LB）、腦心浸液（BHI）、弧菌選擇性瓊脂（TCBS）、李斯特菌選擇性瓊脂（PALCAM）、沙門氏菌選擇性瓊脂（BS），北京路橋技術責任有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌DNA提取 將13株菌種（5株副溶血性弧菌，5株單增李斯特菌，3株沙門氏菌）分別劃線接種于選擇性培養基TCBS、PALCAM、BS上，于37℃恒溫培養箱下培養18-24 h。依次挑取單菌落接種于TSB（含3% NaCl）、BHI、LB中，于37℃恒溫搖床培養16 h，連續活化2次。收集菌體沉淀，使用TIANamp Bacteria DNA Kit進行細菌DNA提取，詳細步驟見試劑盒說明書。其中，蛋白酶K處理時間延長至1 h，溶菌酶處理時間延長至0.5 h［13］。

1.2.2 PCR擴增 本研究所用的引物由上海生物工程技術有限公司合成，詳細序列見表1和表2。

PCR擴增體系溶液總體積為25 μL，其中包含Premix TaqTMDNA聚合酶12.5 μL（其中，Taq酶0.625 U；2× dNTP各0.4 mmol/L；2× Taq Buffer 4 mmol/L Mg2+），正反引物各1 μL（各20 μmol/L），DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。rpoB降落PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃ 1 min，53-48℃ 30 s，72℃1 min（其中每個循環后復性溫度下降0.5℃）；10個循環后進入第二個循環程序：94℃ 1 min，50℃ 30 s，72℃ 1 min，25個循環后；72℃持續7 min。V3-PCR反應程序：95℃預變性 3 min；95℃ 1 min，55℃1 min，72℃ 30 s，共30個循環；最后72℃持續5 min。ERIC-PCR反應程序：95℃預變性7 min；94℃1 min，52℃ 1 min，65℃ 8 min，共30個循環；最后65℃維持16 min。檢測方法：取5 μL PCR反應產物用2%（rpoB-PCR，V3-PCR）和1%（ERIC-PCR）瓊脂糖凝膠，于5 V/cm電壓下電泳30 min后于凝膠成像儀下觀察結果。

表2 三種食源性致病菌檢測與分型方法的相關基因和不同GC夾子

1.2.3 變性梯度凝膠電泳（DGGE） DGGE指紋圖譜構建采用DcodeTM系統（Bio-Rad）。V3區擴增產物在8%聚丙烯酰胺凝膠中分離，變性梯度為40%-60%。其運行條件：1×TAE電泳緩沖液，溫度60℃，電壓60 V，時間16 h，每個樣品點樣量為15 μL PCR產物，電泳結束后用15 mL 1×SYBR Green染色，在紫外燈下用凝膠成像儀拍照成像。rpoB基因擴增產物在8%聚丙烯酰胺凝膠中分離，變性梯度為35%-55%。其運行條件：1×TAE電泳緩沖液，60℃，100 V，10 h，每個樣品點樣量為15 μL PCR產物，電泳結束后用15 mL 1×SYBR Green染色，在紫外燈下用凝膠成像儀拍照成像。

1.2.4 DGGE圖譜和ERIC-PCR圖譜分析 應用Quantity One（Bio-Rad）凝膠圖譜分析軟件對成像所得DGGE圖譜和ERIC-PCR圖譜進行分析，通過泳道和條帶的檢測與匹配，獲得條帶相對電泳距離值（Rf values），從而構建圖譜泳道之間的相似性矩陣。然后應用PAST ver.1.79分析軟件選擇Paired group算法對圖譜進行聚類分析［18］。使用Hunter和Gaston的方法計算出分型方法的分辨力指數［19］。公式如下：

其中，N表示實驗中總菌株數，S表示聚類分析的總類型數，表示第j個類型中含有的菌株總數。

2 結果

2.1 三種GC夾、兩種連接位置的rpoB-PCR-DGGE指紋圖譜的構建及分析

總體觀察指紋圖譜（圖1），rpoB-PCR-DGGE能將3種食源性致病菌完全區分開。然而，5株副溶血性弧菌中，只有ATCC 33846被區分開。對于5株單增李斯菌，則情況不一。最多分為4類：如圖1-C和圖1-F所示。最少分為3類：如圖1-A，1-B，1-D，1-E所示。且圖1-A和1-B中，ATCC 19112沒有譜帶出現。對于3株沙門氏菌，圖1-A，1-C，1-E中沒有區分開，而圖1-B，1-D，1-F中 CICC 21484被區分開。

縱向比較圖1-A、1-C、1-E以及圖1-B、1-D、1-F發現，基于不同GC夾連接于引物的相同位置的rpoB-PCR-DGGE，對5株副溶血性弧菌和3株沙門氏菌的分辨效果無顯著差別。但是，對于5株單增李斯特菌，其分型效果差別較大。菌株ATCC 19115和ATCC 19116始終處于同一水平位置上，菌株ATCC 19118譜帶位置處于前兩株菌株的上方。另外兩株菌ATCC 19112和ATCC 19114譜帶位置存在變化?；贕C-2連接于正引物（圖1-C）和GC-3連接于反引物（圖1-F）的rpoB-PCR-DGGE將5株單增李斯特菌區分成了四類。

圖1 三種食源性致病菌的rpoB-PCR-DGGE指紋圖譜

橫向比較圖1-A和1-B、圖1-C和1-D，圖1-E和1-F觀察到，基于相同GC夾連接于引物不同位置的rpoB-PCR-DGGE，對5株副溶血性弧菌分型效果無任何影響。而對5株單增李斯特菌，影響較大。其中，菌株ATCC 19115、ATCC19116和 ATCC 19118的譜帶在DGGE圖譜中的位置無變化，菌株ATCC 19112和ATCC 19114的譜帶位置變化明顯。對于3株沙門氏菌，基于GC連接于正引物的rpoB-PCR-DGGE（圖1-A、1-C、1-E）未將其區分開，且譜帶均呈彌散狀態。而基于GC連接于反引物的DGGE圖譜中（圖1-B、1-D、1-F），菌株CICC 21484被區分開，譜帶無彌散。

經以上比較與分析，可知應用rpoB-PCR-DGGE對13株食源性致病菌檢測與分型效果最好的圖譜為圖1-F，即GC-3連接于rpoB的反引物上。

2.2 V3-PCR-DGGE的指紋圖譜的構建及分析

13株食源性致病菌基于V3-PCR-DGGE所構建的圖譜（圖2）顯示，副溶血性弧菌和沙門氏菌中出現單一菌株存在多條譜帶的現象，然而，單增李斯特菌單一菌株都只對應1條譜帶。5株副溶血性弧菌株中，在DGGE圖譜上只出現1條譜帶的是O3：K6，出現2條譜帶的是ATCC 33846和ATCC 17802，出現3條譜帶的是ATCC 33847，出現5條譜帶的是F18。對于3株沙門氏菌，菌株CMCC 50041只出現1條譜帶，菌株CMCC 50094出現約8條譜帶，菌株CICC 21484出現5條譜帶。DGGE圖譜中，5株副溶血性弧菌的譜帶位置與3株沙門氏菌譜帶位置約處于同一水平線上。而5株單增李斯特菌的譜帶位置一致，且位于其它兩種菌的譜帶上方。

圖2 三種食源性致病菌的V3-PCR-DGGE指紋圖譜

2.3 ERIC-PCR指紋圖譜的構建及分析

13株食源性致病菌經ERIC-PCR擴增，結果（圖3）表明，得到了譜帶豐富，分辨率較好的DNA指紋圖譜。5株副溶血性弧菌的譜帶最為豐富，為9-12條。5株單增李斯特菌譜帶數為4-7條。3株沙門氏菌譜帶數為7-10條。種間比較，3種食源性致病菌的指紋圖譜之間差距大。種內比較，5株副溶血性弧菌的指紋圖譜之間差別不明顯，而5株單增李斯特菌和3株沙門氏菌的指紋圖譜間差別較顯著。

圖3 三種食源性致病菌的ERIC-PCR指紋圖譜

2.4 rpoB-DGGE、V3-DGGE和ERIC-PCR指紋圖譜聚類分析

運用PAST ver. 1.79軟件對上述3種方法的指紋圖譜（圖1-F、圖2、圖3）進行聚類分析（圖4），凡相似度大于80%者為同一基因型，小于80%者為不同的基因型［18］。如圖4-A所示，13株食源性致病菌可被rpoB-PCR-DGGE至少分為8個基因類型，菌株2、3、4、5為同一型，菌株8、9為同一型，菌株11、12為同一型，其他菌株各為不同型。使用Hunter和Gaston的方法計算出此分型方法的分辨力指數為0.90。圖4-B顯示，13株食源性致病菌可被V3-PCR-DGGE至少分為6個型，菌株1、2、4、5為同一型，菌株6、7、8、9、10為同一型，其它菌株各為不同型。此分型方法的分辨力指數為0.80。圖4-C顯示，13株食源性致病菌可被ERIC-PCR至少分為8個型，菌株1、2、3、4、5為同一型，菌株8、10為同一型，菌株11、13為同一型，其他菌株各為不同型。此分型方法的分辨力指數為0.90。

3 討論

3.1 不同GC夾及相同GC夾的不同引物連接位置對rpoB-PCR-DGGE的影響

本研究采用3種不同的GC夾（GC-1、GC-2、GC-3），并且將同種GC夾分別連接在正反引物上，共合成6對rpoB引物。針對3種（13株）食源性致病菌進行rpoB-PCR-DGGE分析，獲得6張DGGE指紋圖譜。Rettedal等［20］研究表明GC夾中序列的變化，會引起GC%和Tm的變化，從而引起PCR結果的改變。本研究中，GC-1與GC-2的序列存在16個堿基的差異，GC-1和GC-3存在15個堿基的差異。最終獲得的DGGE圖譜間都存在一定的差異。Sheffield等［12］報道稱堿基序列中存在多個毗連的鳥嘌呤（G）會影響DNA序列合成或是PCR反應的結果。Murphy等［21］研究表明多個相鄰的鳥嘌呤（G）易導致形成畸形的空間結構，而且該結構能抑制DNA聚合酶η的作用。GC-1中存在2次兩個連續，2次三個連續和1次四個連續的堿基G；GC-2中只存在1次兩個連續的堿基G；而GC-3中則不存在連續的堿基G。因此，圖1-F顯示DGGE的分型效果最好與上述具有一定的相關性。另外，相同的GC夾子分別連接在正反引物上，同樣對rpoB-PCRDGGE圖譜產生了一定的影響，如連接于正引物上沙門氏菌譜帶彌散，而連接于反引物上沙門氏菌譜帶正常且使菌株CICC 21484與其它兩株沙門氏菌區分開。近來，并未有相關研究對此現象進行解釋。但可能仍與序列中存在多個連續的鳥嘌呤有關。因為正引物rpoB（1698 f）中出現1次兩個連續的G，而反引物rpoB（2041 r）則未出現，分別與GC夾連接后進行PCR而產生不同的反應結果。本研究中，基于GC-3連接在ropB基因反引物上的DGGE圖譜的分辨效果最佳（圖1-F），因此在選擇或設計GC夾時，應當避免序列中出現連續的鳥嘌呤（G）以及連接于反引物的5'端。

圖4 三種食源性致病菌的三種分型方法指紋圖譜聚類分析

3.2 rpoB-PCR-DGGE與V3-PCR-DGGE結果比較分析

PCR-DGGE技術已被廣泛應用于微生物群落多樣性的研究，該技術?；?6S rDNA中保守區域片段，如V1-V3區［22］、V3區［23］、V6-V8區［24］。近年來，PCR-DGGE也被應用于食源性致病菌的檢測與分型［25］。但根據文獻［26］報道，單一菌的16S rDNA存在多拷貝或異源雙鏈，導致DGGE圖譜中單一菌出現多條譜帶，從而使得微生物群落多樣性的結果評價過高或者檢測結果不準確。本實驗應用了V3-PCR-DGGE對13株食源性致病菌進行分型研究。結果（圖2）表明，4株副溶血性弧菌和2株沙門氏菌在DGGE圖譜中均出現了多譜帶現象。而5株單增李斯特菌均只有單譜帶出現。對于多譜帶的單一菌，基于16S rDNA V3區PCR-DGGE具有重復性好的特點，不同菌株譜帶數目與位置具有特異性。因此，該方法可針對性作為一種潛在的分型方法。但對于副溶血性弧菌與沙門氏菌的混合樣品，可能無法將二者同時準確檢測出。

編碼RNA聚合酶β亞基基因（rpoB）是一種單拷貝的管家基因，與DGGE技術相結合，逐漸被應用于微生物群落多樣性的研究中［27］。因此，基于rpoB的PCR-DGGE圖譜中，一種菌只有單譜帶，比基于16S rDNA的PCR-DGGE更為準確地反映微生物群落多樣性。然而，未見有文獻報道關于rpoBPCR-DGGE技術對食源性致病菌進行快速分型的研究。本研究應用rpoB-PCR-DGGE技術對13株食源性致病菌進行檢測與分型，同時與V3-PCR-DGGE的結果進行比較。從本研究的圖譜（圖1-F，圖2）與圖譜聚類分析結果（圖4-A，4-B）明顯看出，rpoBPCR-DGGE檢測和分型的效果優于V3-PCR-DGGE?；趓poB的DGGE圖譜中，13種菌各均只有單譜帶。與此同時，副溶血性弧菌、單增李斯特菌及沙門氏菌的譜帶都能較好地被區分開，同種菌的不同亞種也被不同程度的區分。根據Hunter和Gaston的分辨力指數計算方法可知，rpoB-PCR-DGGE分辨力（0.90）高于V3-PCR-DGGE分辨力（0.80）。

3.3 rpoB-PCR-DGGE與ERIC-PCR分子分型結果比較與分析

研究發現，腸道細菌中ERIC序列是一段長126 bp的反向重復序列，位于基因組內可轉錄的非編碼區域或與轉錄有關的區域［28］。ERIC序列分布于整個基因組中，具有極強的保守性，用ERIC-PCR得到的DNA譜帶特征能反映出細菌整個基因組結構的差異能區別包含有ERIC序列的不同細菌的種和株，因此具有很強的鑒別種乃至菌株的能力［29］。與其它分子分型方法相比，ERIC-PCR具有操作簡單，結果重復性好，分辨力強的優勢。本研究中，同樣應用了ERIC-PCR對13株食源性致病菌進行了分型的研究，并與rpoB-PCR-DGGE的結果進行比較。對圖譜結果（圖1-F，圖3）和圖譜聚類分析結果（圖4-A，4-C）分析可知，ERIC-PCR圖譜中每株菌的譜帶呈現出不同的多態性，副溶血性弧菌譜帶數最多，沙門氏菌次之，單增李斯特菌最少。ERIC-PCR的分辨力指數為0.9，與rpoB-PCR-DGGE分辨力相同。以上結果說明與ERIC-PCR相比，rpoB-PCR-DGGE同樣具有操作簡單，結果重復性好，分辨力強的特點。并且，對于實際樣品，后者能直接進行快速檢測與分型，而前者需要先分離出單一菌株。

4 結論

不同序列的GC夾以及GC夾不同的引物連接位置均會對13株食源性致病菌的rpoB-PCR-DGGE檢測與分型結果產生影響，其分辨力與ERIC-PCR的相等并優于V3-PCR-DGGE。因此，本研究得到了基于特定GC夾以及GC夾連接引物特定位置的rpoBPCR-DGGE能有效提高食源性致病菌進行快速檢測與分型效果的結論，從而為提高食品安全質量起到積極的促進作用。

［1］Karami N, Helldal L, Welinder-Olsson C, et al. Sub-typing of extended-spectrum-β-Lactamase-producing isolates from a nosocomial outbreak：application of a 10-Loci generic Escherichia coli multi-locus variable number tandem repeat analysis［J］. PLoS One, 2013, 8（12）：e83030.

［2］Parisi A, Latorre L, Fraccalvieri R, et al. Occurrence of Listeria spp. in dairy plants in Southern Italy and molecular subtyping of isolates using AFLP［J］. Food Control, 2013, 29（1）：91-97.

［3］Al-Harthi OM, Abdelkader HS, Halawani EM. Molecular typing of Salmonella enterica serovars typhimurium and enteritidis isolated from Taif area of Saudi Arabia by random amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction（RAPD-PCR）［J］. African Journal of Microbiology Research, 2015, 9（9）：651-661.

［4］Taylor J, Doyle D, Blackall P, et al. Use of REP-PCR and 16S rRNA gene sequencing for comparison of Mannheimia haemolytica isolates obtained from fatal cases of bovine respiratory disease in the USA and Australia［J］. Aust Vet J, 2014, 92（1-2）：15-23.

［5］Boonsilp S, Thaipadungpanit J, Amornchai P, et al. A single multilocus sequence typing（MLST）scheme for seven pathogenic Leptospira species［J］. PLoS Negl Trop Dis, 2013, 7（1）：e1954.

［6］Fendri I, Hassena AB, Grosset N, et al. Genetic diversity of foodisolated Salmonella strains through Pulsed Field Gel Electrophoresis（PFGE）and Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus（ERIC-PCR）［J］. PLoS One, 2013, 8（12）：e81315.

［7］Vashin I, Stoyanchev T, Iliev M, et al. Application of polymerase chain reaction and denaturing gradient gel electrophoresis assay of the flagellin gene for direct detection and subtyping of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in avian faecal samples［J］. Bulgarian Journal of Veterinary Medicine, 2012, 15（1）：22-29.

［8］Lan WQ, Xie J. Characterization of the dynamic changes of microorganisms in cutlassfish（Trichiurus haumela）under thecold storage with composite natural preservatives based on culturedependent and 16S rRNA-DGGE technology［J］. Advanced Materials Research, 2012, 554：1498-1506.

［9］Wen CQ, Lai XT, Xue M, et al. Molecular typing and identification of Bdellovibrio-and-like organisms isolated from seawater shrimp ponds and adjacent coastal waters［J］. Journal of Applied Microbiology, 2009, 106（4）：1154-1162.

［10］Kang Y, Cheng J, Mei L, et al. Multiple copies of 16S rRNA gene affect the restriction patterns and DGGE profile revealed by analysis of genome database［J］. Microbiology, 2010, 79（5）：655-662.

［11］Shu QL, Jiao NZ. Developing a novel approach of rpoB gene as a powerful biomarker for the environmental microbial diversity［J］. Geomicrobiology Journal, 2013, 30（2）：108-119.

［12］Sheffield VC, Cox DR, Lerman LS, et al. Attachment of a 40-basepair G+ C-rich sequence（GC-clamp）to genomic DNA fragments by the polymerase chain reaction results in improved detection of single-base changes［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1989, 86（1）：232-236.

［13］Liao C, Peng ZY, Li JB, et al. Simultaneous construction of PCRDGGE-based predictive models of Listeria monocytogenes and Vibrio parahaemolyticus on cooked shrimps［J］. Letters in Applied Microbiology, 2015, 60（3）：210-216.

［14］Muyzer G, De Waal EC, Uitterlinden AG. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA［J］. Applied and Environmental Microbiology, 1993, 59（3）：695-700.

［15］Dahll?f I, Baillie H, Kjelleberg S. rpoB-based microbial community analysis avoids limitations inherent in 16S rRNA gene intraspecies heterogeneity［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66（8）：3376-3380.

［16］Cocolin L, Comi G. Use of a culture-independent molecular method to study the ecology of Yersinia spp. in food［J］. International Journal of Food Microbiology, 2005, 105（1）：71-82.

［17］Jer?ek B, Gilot P, Gubina M, et al. Typing of Listeria monocytogenes strains by repetitive element sequence-based PCR［J］. Journal of Clinical Microbiology, 1999, 37（1）：103-109.

［18］劉海泉, 朱穎, 姜文潔, 等. ERIC-PCR 技術對單增李斯特菌的溯源分析［J］. 食品工業科技, 2013, 34（8）：49-51.

［19］Hunter PR, Gaston MA. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems：an application of Simpson’s index of diversity［J］. J Clin Microbiol, 1988, 26（11）：2465-2466.

［20］Rettedal EA, Clay S, Br?zel VS. GC-clamp primer batches yield 16S rRNA gene amplicon pools with variable GC clamps, affecting denaturing gradient gel electrophoresis profiles［J］. FEMS Microbiology Letters, 2010, 312（1）：55-62.

［21］Murphy CT, Gupta A, Armitage BA, et al. Hybridization of G-quadruplex-forming peptide nucleic acids to guanine-rich DNA templates inhibits DNA polymerase η extension［J］. Biochemistry, 2014, 53（32）：5315-5322.

［22］Probst M, Walde J, Pümpel T, et al. Lactic acid fermentation within a cascading approach for biowaste treatment［J］. Applied microbiology and Biotechnology, 2015, 99：2029-2040.

［23］張振華, 鮑王波, 余冉, 等. 鵪鶉腸道微生物PCR-DGGE方法的優化［J］. 生物技術通報, 2015, 31（1）：73-78.

［24］蘭阿峰, 楊曼, 郭素芬, 等. 免培養法對大鯢腸道微生物多樣性的研究［J］. 微生物學通報, 2014, 41（7）：1342-1349.

［25］Xiao J, Liu Y, Wang M, et al. Detection of Mycoplasma pneumoniae P1 subtype variations by denaturing gradient gel electrophoresis［J］. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 2014, 78（1）：24-28.

［26］Wu B, Zhang Q, Liu Z, et al. Bacterial communities in alfalfa and corn silages produced in large-scale stack and bunker silos in China［J］. Grassland Science, 2014, 60（4）：247-251.

［27］Perumbakkam S, Craig AM. Design and in vitro evaluation of new rpoB-DGGE primers for ruminants［J］. FEMS Microbiology Ecology, 2011, 76（1）：156-169.

［28］Versalovic J, Koeuth T, Lupski R. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to finerpriting of bacterial enomes［J］. Nucleic Acids Res, 1991, 19（24）：6823-6831.

［29］Chen W, Xie Y, Xu J, et al. Molecular typing of Vibrio parahaemolyticus isolates from the middle-east coastline of China［J］. Int J Food Microbiol, 2012, 153（3）：402-412.

（責任編輯 馬鑫）

Effects of GC Clamps on RpoB-PCR-DGGE Fingerprint of Three Types of Food Borne Pathogens

LIAO Chao1，2ZHANG Zhao-huan1，2YAO Xin1，2XIE Jing1ZHANG Wei-jia1，2，3PAN Ying-jie1，2，3ZHAO Yong1，2，3
（1. College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306；2. Laboratory of Quality ＆ Safety Risk Assessment for Aquatic Production on Storage and Preservation，Ministry of Agriculture，Shanghai 201306；3. Shanghai Engineering Research Center of Aquatic Product Processing ＆ Preservation，Shanghai 201306）

This work is to investigate the effect of different GC clamps and different positions of primers connected with GC clamps on the DGGE fingerprint of food borne pathogens. We synthesized 6 pairs of primers encoding RNA polymerase β subunit（rpoB 1-6）containing 3 different GC clamps（GC-1，GC-2 and GC-3）that linked to 5'endings of both forward and reverse primers，respectively. Then，rpoB-PCRDGGE was used to analyze Vibrio parahaemolyticus（5 strains），Listeria monocytogenes（5 strains），and Salmonella spp.（3 strains）. The results of fingerprint analysis were compared with that of V3-PCR-DGGE and ERIC-PCR. GC-3 clamp linked with reverse primer presented the best discriminating effect，and the discriminating index of rpoB-PCR-DGGE reached 0.9 that was equal to ERIC-PCR and greater than V3-PCR-DGGE. In conclusion，both of the different GC clamp sequences and linked positions of primers with GC clamp affected the result of rpoBPCR-DGGE fingerprint. Choosing or designing GC clamp without continuous guanine（G base）and linked with 5'ending of reverse primer will improve the detecting and typing effect of rpoB-PCR-DGGE for food borne pathogens.

Vibrio parahemolyticus；Listeria monocytogenes；Salmonella spp.；GC clamps；rpoB-PCR-DGGE

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.028

2015-07-22

國家自然科學基金面上項目（31271870），上海市科委科技創新行動計劃項目（14DZ1205100，14320502100），上海市科技興農重點攻關項目（滬農科攻字2014第3-5號、2005第4-8號），上海市水產品加工及貯藏工程技術研究中心（11DZ2280300）

廖超，男，碩士研究生，研究方向：食品微生物風險評估；E-mail：liaochao2499@126.com

趙勇，男，教授，博士，研究方向：食品微生物風險評估；E-mail：yzhao@shou.edu.cn