馬鈴薯塊莖特異性啟動子驅動的人白細胞介素-12的遺傳轉化研究

楊加偉程小玲龍朝康

（1.遵義醫學院生物化學教研室，遵義 563000；2.遵義醫學院細胞生物學教研室，遵義 563000）

馬鈴薯塊莖特異性啟動子驅動的人白細胞介素-12的遺傳轉化研究

楊加偉1程小玲2龍朝康1

（1.遵義醫學院生物化學教研室，遵義 563000；2.遵義醫學院細胞生物學教研室，遵義 563000）

為獲得高效表達人白細胞介素-12（hIL-12）蛋白的轉基因馬鈴薯植株，利用根瘤農桿菌侵染法將前期構建的馬鈴薯塊莖特異性啟動子Ppatatin驅動的hIL-12植物表達載體導入馬鈴薯，通過共培養、篩選、分化等過程獲得轉基因植株，并結合PCR、RT-PCR、GUS染色及ELISA分析對轉基因植株進行鑒定。結果顯示，獲得12個馬鈴薯轉基因株系，PCR檢測表明其中的10個株系目的基因已導入馬鈴薯基因組，轉基因陽性率為83%；RT-PCR分析表明其中的7個株系外源基因在轉錄水平成功獲得表達，ELISA分析表明其中的5個株系有明顯的蛋白水平表達。對這7個株系后代的檢測表明外源基因成功表達且具有良好的遺傳穩定性。

Ppatatin啟動子；人白細胞介素-12；轉基因馬鈴薯；植物生物反應器

隨著基因工程技術的不斷發展，利用植物表達系統生產藥用蛋白已成為現代生物技術產業的研究熱點［1-3］。植物生物反應器由于具有操作簡便、產物活性高、成本低、易擴大規模等優點，在細胞因子、生長因子、抗體及疫苗等藥用蛋白表達生產領域獲得了廣泛的研究和應用［1］。人白細胞介素-12（hIL-12）是由單核細胞、巨噬細胞分泌的一種約為75 kD的糖蛋白細胞因子，由1個約35 kD的小亞基和1個約40 kD的大亞基通過二硫鍵連接［4］。hIL-12的生物學功能包括：增強細胞毒性反應，誘導INF-γ、IL-2及腫瘤壞死因子TNF-α的生成，以及抗血管生成和抗腫瘤效應等，在先天免疫和適應性免疫過程中起著關鍵作用［4-6］，在臨床上將有著廣闊的應用前景和巨大的應用價值。

利用植物生物反應器高效表達生產hIL-12，降低hIL-12的生產成本，具有潛在的應用價值。但是，相比微生物等表達系統的高效性，植物表達系統由于外源蛋白表達量相對較低，限制了發展［7］。對植物表達系統中驅動外源基因的啟動子進行優化，如選擇植物自身的組織特異性強啟動子等，是提高外源基因表達量的常用手段之一［8，9］。在本論文的前期研究中，克隆了馬鈴薯塊莖特異性的高效啟動子Ppatatin并構建其驅動的hIL-12植物表達載體［10］。本研究將前期構建的載體通過農桿菌介導轉化馬鈴薯，旨在獲得陽性轉基因植株，以期為下一步利用馬鈴薯高效表達生產hIL-12蛋白奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究用馬鈴薯材料中薯1號，農桿菌菌株EHA105及表達載體均為本實驗室保存

1.2 方法

1.2.1 表達載體導入根瘤農桿菌 將-80℃保存的農桿菌菌株EHA105取出活化并接種培養至OD600=0.5，5 000 r/min離心5 min后去除培養基。向菌體加入預冷的0.1 mol/L CaCl2（含10%甘油）洗滌兩次后置于冰上。將0.1 mL 細胞與10 ng質粒DNA混勻后冰浴30 min，-70℃放置10 min，42℃水浴熱激1 min，最后冰浴2 min，加入800 mL YM液體培養基，175 r/min 28℃搖床培養2 h后取少量涂在含25 μg/mL卡那霉素+利福平的LB平板上，28℃培養2 d。挑取單菌落至LB液體培養基培養后，提取質粒，利用前期工作中啟動子克隆時所用的引物［10］Ppatatin-f 5'-TGCGTATTAGTTTTAGCGACGA-3'和 Ppatatin-r 5'-GTTGGTGCTTTGAGCATATAAC-3'引物進行PCR鑒定。

1.2.2 馬鈴薯遺傳轉化 馬鈴薯遺傳轉化參照文獻［11］并加以改進。將陽性重組農桿菌于28℃振蕩培養過夜，菌體離心沉淀后用適量MS液體培養基重新懸浮。將馬鈴薯無菌苗置于22℃光照8 h黑暗16 h的人工氣候箱中進行試管薯誘導，2-3個月后將生長至直徑約0.5 cm的試管薯取出，倒入MS液體培養基浸泡20 min。用刀片將薯球橫切至1-2 mm左右厚的薄片，置于菌液中輕微搖動5-10 min后，取出薄片，吸干菌液，轉入共培養基上（MS+AS 50 mg/L）培養2 d。培養后將薯片轉至篩選分化培養基上（MS+100 μg/mL卡那霉素+ 500 μg/mL羧芐青霉素+5 μmol/L IAA）在22℃光照16 h黑暗8 h的條件下培養，待分化出苗后轉移至MS培養基上進行生根壯苗和移栽。

1.2.3 基因組DNA提取與PCR鑒定 參照文獻［12］的方法提取馬鈴薯葉片基因組DNA，以基因組DNA為模板，利用引物npt-F：5'-TATTCGGCTATGACTGGGCAC-3'和npt-R：5'-GTCGATGAATCCAGAAAAGCG-3'進行擴增。反應體系為：20 ng模板、2 μL 10×PCR buffer、0.5 μL dNTPs（1 0 mmol/L）、0.5 μL引物（10 μmol/L）、1 U Taq酶，并補水至20 μL。PCR擴增程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環；72℃充分延伸5 min。

1.2.4 RT-PCR分析 切取馬鈴薯幼苗葉片或塊莖置于2 mL離心管，加入500 μL GUS染色液（北京奧博萊），37℃避光染色24 h后，將葉片置于1.5 mL 75%乙醇中常溫脫色24 h，拍照保存染色結果。用植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN）提取馬鈴薯塊莖總RNA后進行反轉錄獲得cDNA。反轉錄體系和過程如下：總RNA 2 μg，oligo（dT）（100 ng/μL）1 μL，5×buffer 4 μL，dNTP（10 mmol/L）2 μL，RNase inhibitor 20 U，反轉錄酶M-MLV（北京博邁德）1 μL，加DEP C處理水至20 μL，42℃反應1 h后，-20℃保存備用。以cDNA為模板，以啟動子引物Ppatatin-f和Ppatatin-r檢測確定有無基因組DNA污染，以hIL-12-F：5'-GCTGATGGATCCTAAGAGGC-3'和 hIL-12-R：5'-TTAGGAAGCATTCAGATAGC-3'為引物進行擴增檢測hIL-12基因的表達。以組成型基因GAPDH 作為內參，擴增引物為GAPDH-F：5'-ATGAAGGACTGGAGAGGTGG-3'和GAPDH-R：5'-GAAAATGCTTGACCTGCTGT-3'。PCR擴增程序為：預變性94℃ 2 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，26-30循環；72℃延伸10 min。

1.2.5 ELISA分析 切取馬鈴薯塊莖約0.5 g，加入3 mL可溶性蛋白提取液（0.1 mol/L Tris-HCl，50 mmol/L EDTA，1%蛋白酶抑制劑），冰上研磨至勻漿，12 000 r/min離心10 min，上清液即為可溶性蛋白提取液。利用BCA法測定蛋白質濃度，將待測樣品稀釋50倍后用人IL-12 Elisa檢測試劑盒（上海生工）測定樣品中hIL-12的含量，按照試劑盒說明書進行操作。主要步驟包括將蛋白質樣品（包括標準品與待測樣）、生物素標記抗體及酶試劑加入hIL-12包被的酶標板，混勻后37℃保溫1 h，洗板后加入顯色液，5 min后加入終止液于520 nm測量OD值。

2 結果

2.1 馬鈴薯遺傳轉化

將前期構建的馬鈴薯塊莖特異性啟動子Ppatatin驅動的hIL-12表達載體轉化根瘤農桿菌EHA105，挑選5個轉化后的單菌落重組子提取質粒并進行PCR鑒定。結果顯示，所挑取的5個轉化子均能提取出質粒（圖1-A），且均能擴增出大小為1 000 bp的Ppatatin啟動子條帶，表明表達載體成功導入農桿菌。接著，以馬鈴薯無菌薯球為外植體（圖1-B），用刀片將其切至1-2 mm厚度薯片后，置于含表達載體的農桿菌菌液中進行侵染，共培養2 d后轉至篩選分化培養基。結果（圖1-C）顯示，大部分侵染后的外植體在篩選分化培養基上生長良好，在培養約一周后開始出現綠點，2-3周左右長出再生芽。

圖1 農桿菌質粒鑒定及馬鈴薯遺傳轉化階段圖

2.2 馬鈴薯轉基因植株培養與陽性檢測

將篩選分化培養基上長出的馬鈴薯再生芽轉至MS培養基繼續培養，3-4周后幼苗長至7-8 cm高度（圖2-A），共得到12個獨立的轉化再生單株。從轉化再生植株幼苗的葉片提取基因組DNA，以npt-F和npt-R為引物擴增卡那霉素抗性基因，檢測轉基因植株的陽性率。結果（圖2-B）顯示，在12株轉化再生的植株中，有10株能擴增出大小約為600 bp的卡那霉素抗性基因片段條帶，表明為陽性，轉基因陽性率為83%。由于導入的表達載體T-DNA區還含有CaMV35S啟動子驅動的GUS基因［9］，因此本研究首先利用GUS染色檢測外源基因在陽性轉基因馬鈴薯中的表達情況。切取10株陽性植株的幼苗葉片，放入GUS染液中37℃染色24 h后用75%酒精脫色。結果（圖2-C）顯示，這10株陽性植株葉片有7株染色成功，進一步表明表達載體已導入馬鈴薯基因組且報告基因在這7株馬鈴薯植株中獲得了表達。

2.3 外源基因在轉基因馬鈴薯塊莖組織中的表達檢測

將所獲得的7株表達了外源基因的馬鈴薯幼苗取出煉苗3 d，種植在溫室中3個月左右后獲得轉基因馬鈴薯塊莖。首先選取每株植株的1個塊莖進行GUS染色和RT-PCR分析，檢測外源基因的表達情況。結果（圖3-A）顯示，7株陽性植株的塊莖均能很明顯的染色，初步表明外源基因在這7株馬鈴薯植株塊莖中獲得了表達。提取這7株馬鈴薯植株塊莖RNA并反轉錄成cDNA。首先利用啟動子DNA引物Ppatatin-f和Ppatatin-r檢測確定無基因組DNA污染后，利用RT-PCR檢測hIL-12基因的表達情況。結果（圖3-B）顯示，與GUS染色結果一致，hIL-12基因在這7株馬鈴薯植株均有明顯的表達。為進一步確定外源基因在轉錄后的蛋白質表達情況，提取7株馬鈴薯塊莖總蛋白，利用hIL-12抗體進行ELISA檢測，結果（圖3-C）顯示，7株馬鈴薯植株中，3、8、9、10、11號植株塊莖中有明顯的hIL-12蛋白表達，其中，3號植株的馬鈴薯塊莖hIL-12表達量最高，達到3.74 μg/g可溶性蛋白。最后，為檢測外源基因在一株植株所有后代中表達的一致性，選取表達量最高的3號植株的所有8個馬鈴薯薯球進行GUS染色和RT-PCR分析，結果（圖3-D、3-E）顯示GUS基因和hIL-12基因在3號植株的所有8個塊莖均有明顯的表達。

圖2 馬鈴薯轉基因植株培養與陽性檢測圖

圖3 hIL-12基因在轉基因馬鈴薯塊莖中的表達檢測圖

2.4 外源基因遺傳穩定性初步檢測

選取7個轉基因單株后代的一部分薯球進行繁殖，取一片每個株系后代的幼苗葉片，放入GUS染液中進行染色分析，結果（圖4）顯示所有的葉片均能著色，表明轉基因植株在一次無性繁殖后，外源基因的表達穩定。

3 討論

利用外源重組表達系統生產的生物技術藥物已在癌癥、心腦血管疾病、糖尿病等重大疾病的治療方面起著舉足輕重的作用［13］。目前大多數的生物技術藥物都是以微生物或者動物細胞系進行表達和生產［14-17］。對于白細胞介素這一類的糖蛋白，大腸桿菌系統由于缺乏糖基化等翻譯后修飾，對其生物學活性有很大影響，某些產品在商品化前往往需要額外的處理，生產成本增大。而動物細胞系由于操作麻煩，細胞培養條件苛刻且培養費用高，也不是生產重組白細胞介素的理想表達系統［1，18］。因此，科學家們一直在尋找一種低成本同時又高效的表達系統來生產白細胞介素及其它藥用蛋白。自1998年Magnuson等［19］首次報道用煙草懸浮細胞表達了具有活性的人IL-2和IL-4以來，現已有多種白細胞介素先后在植物中成功表達。由于植物細胞具有和哺乳動物細胞相似的轉錄、翻譯及翻譯后加工修飾系統，所以植物系統表達的重組白細胞介素一般能進行正確的折疊及二聚化、糖基化等修飾，更易具有生物學活性［20，21］。而馬鈴薯由于具有遺傳轉化體系完善、轉化周期較短、無性繁殖技術成熟、生長容易產量高等優勢，被廣泛用來進行藥用蛋白表達研究［1，9，22-24］。

圖4 GUS染色法檢測第二代馬鈴薯轉基因植株外源基因的表達

但是，相比于商業化的生物反應器的高效性，植物生物反應器的外源蛋白表達量較低。Gutie'rrez-Ortega等［25］早在2004年便在煙草中成功表達了具有生物學活性的hIL-12蛋白，但表達量僅為30 ng/g鮮重；在本實驗室的前期研究中，利用組成型的CaMV35S啟動子驅動hIL-12基因在馬鈴薯中表達，獲得了具有生物學活性的重組蛋白，但表達量非常低［26，27］。因此，如何提高外源蛋白在植物中的表達量引起不少研究者的關注。常用的手段包括：利用植物自身的組織特異性強啟動子驅動外源基因［9］；將外源蛋白帶上不同亞細胞定位的標簽增加其表達等［24］。如：Park等［9］利用Ppatatin啟動子驅動IL-2的表達，表達量得到大大提高；而Ma等［24］則在需要表達的IL-4基因后融合細胞質定位的KDEL標簽，也達到了提高表達量的目的。在本論文前期研究中選擇的Ppatatin啟動子，其下游基因表達產物是一類分子量約為40 kD的糖蛋白，其在馬鈴薯塊莖可溶性總蛋白中的含量高達40%，而在其它組織中的含量極少［28］，因此該啟動子是馬鈴薯塊莖組織中高效特異啟動子。本研究選用前期構建好的表達載體［9］，利用農桿菌介導的方式，將表達載體轉入馬鈴薯細胞中，得到了10個陽性轉基因馬鈴薯株系。RT-PCR分析結果顯示10個陽性株系中的7個株系成功在轉錄水平表達了hIL-12基因。ELISA分析表明，其中5個株系在蛋白水平有大量的表達，在每克可溶性蛋白中重組蛋白的表達量最高可達到3.7 μg。另外，還有兩個株系在RNA水平檢測到了hIL-12表達但在蛋白水平的表達不明顯，可能是由于外源mRNA表達量較低影響了外源基因的翻譯，現已和其它株系一并種植并擬對其下一代進一步進行檢測。此外，3號植株的所有8個馬鈴薯薯球均能檢測到外源基因的表達，初步表明同一株植株的所有塊莖中，外源基因的表達具有一致性。

植物基因組遺傳的復雜性，外源基因在轉基因植物中的遺傳穩定性頗受關注，而藥用蛋白基因的遺傳穩定性是影響植物生物反應器生產效率的決定因素之一［7］。由于馬鈴薯的繁殖方式以無性繁殖為主，因此選擇馬鈴薯作為生物反應器也可以在一定程度上避免因有性繁殖帶來的遺傳穩定性問題。為驗證本研究實驗材料的遺傳穩定性，利用GUS染色對無性繁殖的第二代植株的外源基因表達情況進行了檢測。結果顯示，所檢測的所有材料均能明顯染色，初步表明本研究的外源基因在馬鈴薯植株中具有非常好的遺傳穩定性。

4 結論

本研究利用農桿菌介導的遺傳轉化方式獲得了轉hIL-12基因的陽性馬鈴薯植株，GUS染色、RTPCR分析和ELISA分析均表明大部分植株中均有外源基因的表達，且經過一次繁殖后其表達穩定。

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（責任編輯 馬鑫）

Genetic Transformation of Human IL-12 Driven by Tuber-specific Promoter from Potato（Solanum tuberosum）

YANG Jia-wei1CHENG Xiao-ling2LONG Chao-kang1
（1. Department of Biochemistry，Zunyi Medical University，Zunyi 563000；2. Department of Cellular Biology，Zunyi Medical University，Zunyi 563000）

To obtain transgenic potato plants that express human interleukin 12（hIL-12）protein，the early-constructed plant expression vector driven by Ppatatin of potato tuber-specific promotor was transformed into potato by Agrobacterium-mediated transfection，followed by co-cultivation，screening and differentiation，and the transgenic plants were acquired. Techniques of PCR，RT-PCR，GUS staining，and ELISA analysis were performed for the identification of transgenic plants. The results showed that 12 transgenic lines were obtained，and in the 10 transgenic lines the target gene was in the potato genome，i.e.，positive rate was 83%. RT-PCR analysis illustrated that exogenous genes expressed successfully in 7 transgenic lines at mRNA level，moreover，ELISA data showed that 5 transgenic lines presented the high level of hIL-12 protein expression. In addition，the expression of hIL-12 was genetically stable in these 7 transgenic potato lines.

promoter Ppatatin；human IL-12；transgenic potato；plant bioreactor

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.029

2015-07-20

貴州省科學技術基金項目（黔科合J字［2013］2324），遵義醫學院博士啟動基金項目（F-587）

楊加偉，男，博士，副教授，研究方向：醫藥生物技術；E-mail：yangjw@zmc.edu.cn