戊型肝炎病毒長爪沙鼠感染模型的初步研究

朱光澤屈勇剛李一權蘭添范園園胡寧寧張諾娜李霄金寧一

（1.長春中藥大學附屬醫院檢驗科，長春 130021；2.軍事醫學科學院軍事獸醫研究所，長春 130122；3.石河子大學動物科技學院，石河子 832003）

戊型肝炎病毒長爪沙鼠感染模型的初步研究

朱光澤1，2屈勇剛2，3李一權2蘭添2范園園2胡寧寧2張諾娜2李霄2金寧一2

（1.長春中藥大學附屬醫院檢驗科，長春 130021；2.軍事醫學科學院軍事獸醫研究所，長春 130122；3.石河子大學動物科技學院，石河子 832003）

旨在探索應用長爪沙鼠（Meiiones unguiculataus）構建戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）動物模型的可行性，從豬糞便稀釋懸液中提取HEV RNA并鑒定，經腹腔和口服接種HEV于長爪沙鼠，并每周采集血液、相關器官（心、肝、脾、肺、腎、腸系膜淋巴結、脾臟）及糞便。用反轉錄PCR（RT-PCR）和免疫組化等檢測方法分析各個樣品。結果表明，感染后第7天開始，可從血液、腎臟、脾臟、腸系膜淋巴結、肝臟、肺、糞便中檢測到HEV RNA；通過免疫組化和組織病理學觀察，發現HEV可在肝臟中進行表達，并且能引起肝組織病理變化，但感染HEV后長爪沙鼠均缺乏較明顯的臨床表現癥狀。結果提示，長爪沙鼠對 HEV具有易感性，感染后肝臟出現小葉性肝炎的病理變化，具有作為HEV感染動物模型的潛在價值。

戊型肝炎病毒；長爪沙鼠；動物模型

病毒性肝炎是一個全球性的健康問題，尤其是戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）引起的戊型肝炎［1，2］。戊型肝炎病毒為單鏈RNA，無包膜病毒，屬于肝炎病毒科肝炎病毒屬［3-6］。以往的研究提出了4種HEV的傳播途徑，分別為糞-口傳播、食源性傳播、輸血和母嬰垂直傳播［7］。感染戊型肝炎病毒可導致體內長期的凝血和膽汁淤滯，并且還會提高孕婦的死亡率［8-10］。近年來研究還表明，戊型肝炎病毒感染除了提高孕婦的死亡率之外，還會導致男性和非妊娠婦女的死亡［11］。 在孕婦中產生高死亡率的原因尚不明確，也沒有具體的治療方法，同時，HEV促進疾病進展的細胞蛋白質和途徑仍不明確。這些都歸根于HEV難以分離及純化、同時缺乏穩定的HEV細胞感染培養系統，阻礙了對HEV生物學的理解。

1983年首次用戊肝患者的糞便提取物成功感染了2只獼猴，成為了戊型肝炎動物實驗的先例［12］。此后國內外學者陸續發現有10多種靈長類動物品系和豬對HEV易感，適宜于做動物模型。但靈長類動物具有昂貴、來源有限、實驗條件要求高等缺點。隨后，研究人員發現野鼠可自然感染HEV，但選用野鼠作為動物模型也具有一定的風險，并且其來源也相對有限。

長爪沙鼠（Meiiones unguiculataus）亦稱蒙古沙鼠，是一種具有廣闊開發前景的多功能性嚙齒類實驗動物，并且在醫學研究領域里作為實驗動物已有20-30年的歷史。其某些特有的生理學、解剖學和行為學特征對于多種疾病的研究具有重要價值，如腦血管疾病、營養代謝病和自發性腫瘤等［13］。長爪沙鼠不僅對多數病原易感，而且在 某些病原感染下，會表現出與人類相似的病理特征和臨床癥狀。因此，長爪沙鼠作為一種“多能”性實驗動物，具有非常重要的開發利用價值。

本研究擬用豬源HEV病毒感染長爪沙鼠，通過RT-PCR檢測，組織病理學觀察等方法，探索將長爪沙鼠作為HEV感染模型的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 豬HEV陽性糞便采自長春某豬場，經RT-PCR鑒定為陽性、屬基因Ⅳ型，-70℃保存。

將陽性糞便用PBS制成1∶10的懸液，4℃，4 000 r/min離心20 min，取上清，用0.22 μL無菌濾器濾過除菌，測定RT-PCR滴度后備用。

1.1.2 實驗動物 40-50日齡的長爪沙鼠獲贈于浙江省疾病預防控制中心。

1.1.3 檢測試劑盒 雙抗原夾心ELISA檢測試劑盒購自北京萬泰生物藥業公司；TRIZOL Reagent購自Invitrogen公司；UltrasensitiveTMS-P超敏試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.2 方法

1.2.1 長爪沙鼠人工感染實驗 選取檢測為HEV陰性的健康長爪沙鼠24只。每只沙鼠分別以腹腔接種及口服接種的途徑接種方法1.1.1中處理后的HEV陽性材料0.5 mL，并連續觀察50 d。分別在7、14、21、28、35和50 d無痛處死2只長爪沙鼠，并采血及分離血清檢測HEV抗體和檢測HEV RNA，同時采集心、肝、脾、肺、腎、腸系膜淋巴結、脾臟、小腸、回腸、直腸檢測HEV RNA。

1.2.2 HEV抗體檢測 使用北京萬泰生物制藥公司提供的抗-HEV抗體酶聯免疫試劑（雙抗原夾心法），按照說明書檢測血清中抗-HE V抗體并判斷結果。

1.2.3 HEV RNA的RT-PCR檢測

1.2.3.1 引物設計 根據GenBank中注冊的HEV各基因型的保守區序列，設計一套簡并引物，以M1、M2為外引物；M3、M4為內引物。

M1：5'-AAC（T）TATGCA（C）CAGTACCGGGTTG-3'（5 725-5 746 bp）；M2：5'-CCCTTATCCTGCTGAGCATTCTC-3'（6 433-6 455 bp）；M3：5'-GTC（T）ATGC（T）TGCATACATGGCT-3'（6 010-6 031 bp）；M4：5'-AGCCGACGAAATC（T）AATTCTGTC -3'（6 336-6 357 bp）。

1.2.3.2 HEV正鏈RNA的RT-PCR檢測 按照TRIZOL Reagent說明書提取HEV RNA。取RNA 14 μL加1 μL的Oligo（dT），于75℃加熱5 min后迅速冰浴10 min，然后加入5×M-MLV buffer 6 μL，dNTP 1.5 μL，RNasin 1 μL，M-MLV 1 μL，雙蒸水6.5 μL，混勻后42℃ 1 h，95℃ 5 min，-20℃ 30 min。

取上述合成的cDNA進行兩輪PCR。首輪使用的引物為M1和M2，PCR擴增條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，30個循環；72℃延伸10 min。第二 輪使用的引物為M3和M4，PCR擴增條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，30個循環；72℃延伸10 min。

1.2.3.3 HEV負鏈RNA的RT-PCR檢測 對檢測到HEV 正鏈的RNA的樣品，進行HEV負鏈RNA的RT-PCR檢測。

1.2.4 免疫組織化學觀察 先將組織制成常規石蠟切片，經脫蠟和脫水后對組織抗原進行相應的修復。加過氧化酶阻斷液，室溫下孵育10 min。然后在每張切片中先后加入50 μL正常非免疫動物血清、50 μL兔抗p293（ORF2 aa382-674）抗體（1∶1 000）及50 μL生物素標記的二抗，分別在室溫下孵育1 h、1 h及10 min。再往切片加入50 μL鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫孵育10 min。最后往切片加入100 μL DAB溶液，作用3 min左右后，沖洗干凈，蘇木素復染，再沖洗干凈；切片經過梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固后顯微鏡下觀察。

1.2.5 病理組織學觀察 將待觀察的病料用10%中性甲醛溶液固定及石蠟包埋后，以3.5 μm 的厚度連續切片，經常規蘇木素-伊紅染色后顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 糞便懸液的RT-PCR滴度測定

糞便懸液經10遞倍稀釋后，RT-PCR檢測結果見表1。計算結果表明，接種用豬糞便懸液的RTPCR滴度為10-6.78。

表1 接種用豬糞便懸液中HEV RNA 的RT-PCR滴度

2.2 ELISA檢測人工感染長爪沙鼠HEV抗體

長爪沙鼠在接種糞便懸液之后 ，在接種后的前2 d內表現出精神不振，但之后的未再出現明顯的臨床癥狀。血清抗體最早于感染后的第21天轉為陽性，可持續到感染后第50天（表2）。

表2 感染沙鼠HEV抗體的ELISA檢測

2.3 人工感染長爪沙鼠的HEV正鏈RNA RT-PCR檢測

感染后第7天可從血液、心、腎臟、脾臟、腸系膜淋巴結、肝臟、肺等臟器或糞便中檢測到HEV正鏈RNA，最長的可持續到感染后第50天（圖1和表3）。

圖1 長爪沙鼠感染21 d后組織樣品正鏈RNA 的RT-PCR檢測

表3 長爪沙鼠感染組織樣品的正鏈RNA1 RT-PCR檢測

2.4 人工感染長爪沙鼠的HEV負鏈RNA RT-PCR檢測

感染長爪沙鼠的負鏈RNA RT-n-PCR檢測結果見圖2和表4。

表4 長爪沙鼠感染組織樣品的負鏈RNART-n-PCR檢測

2.5 病理組織學觀 察

觀察發現大部分臟器組織中缺少典型的病理變化。而肝臟的主要病變為廣泛肝細胞變性、空泡變性、濁腫、水樣變性而致氣球樣變，肝細胞胞漿疏松、空泡變性、胞核大小不等，出現雙核、肝竇擴張或變窄，病理符合小葉性肝炎（圖3）。

圖2 長爪沙鼠感染21 d后組織樣品的負鏈RNA RT-PCR檢測

2.6 免疫組織化學觀察

免疫組織化學觀察可見在細胞質中有HEVAg大量分布，細胞核與周圍邊的細胞界限清晰可見（圖4）。

圖4 人工感染長爪沙鼠的免疫組織化學照片（100×）

3 討論

目前，可實驗感染HEV的動物主要有非人靈長類動物和豬，其中以非人靈長類動物最為常用［14］。自1983年Balayan等［12］首次使用戊肝患者的糞便提取物成功感染2只獼猴以來，許多非人靈長類動物模型（黑猩猩、恒河猴、梟猴、短尾猴、小絹猴、非洲綠猴等）逐步的建立了起來，其中較為常用的還是獼猴模型。豬作為基因Ⅲ型、Ⅳ型的自然宿主，也可應用于HEV感染的研究。1990年Balayan等［15］首次用1株亞洲人HEV成功感染豬，實現了HEV豬模型的制作。然而以非人靈長類動物或豬作為實驗動物模型具有繁殖周期長、飼養管理繁、價格昂貴及來源有限等缺點［16］。

長爪沙鼠因其獨特的生物學特性在病毒學領域、細菌學領域及寄生蟲學領域中應用廣泛。如在病毒學領域方面，廣泛應用于腎綜合征出血熱［17］、流行性出血熱病毒［18］和乙型肝炎病毒［19］等研究。說明，其在研究人類疾病及新藥開發領域具有重要的價值。

本研究首先將HEV陽性豬糞便稀釋懸液接種于長爪沙鼠，并每周采集血清和多種組織（心、肝、脾、肺、腎、腸系膜淋巴結、脾臟、小腸、回腸、直腸），隨后通過ELISA和RT-PCR、免疫組織化學及病理組織學觀察進行了感染后檢測。

結果發現長爪沙鼠不僅可感染HEV，并且能產生HEV抗體，并且在血液、心、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腸系膜淋巴結、糞便中檢測到了HEV RNA。再通過對負鏈RNA的檢測，發現在肝、脾、肺、腸系膜淋巴結中存在HEV負鏈RNA，進而表明HEV可以在以上組織中進行復制，其中病毒在肝臟中殘留時間最久。Kasorn-dorkbua等［20］用HEV陽性樣品接種至SPF豬體內，結果發現直接接種在心、胰組織的SPF豬未感染HEV，而直接接種在肝組織的SPF豬成功感染HEV，表明豬體內肝臟是HEV復制的主要器官；Lee等［21］使用原位雜交技術檢測機體內不同組織中的HEV RNA，結果發現存在于肝臟部位的HEV RNA雜交信號最強。以上研究結果與本研究結果均說明肝臟是HEV復制的主要器官部位［22］。

在接種后的前2天內長爪沙鼠表現出了精神不振等癥狀，但之后的未再出現較為明顯的臨床癥狀，這與趙素元等［23］使用子午沙鼠作為HEV動物模型的結果相似，說明嚙齒類動物模型在具有可大量用于實驗，以降低偶然因素帶來的影響，增加實驗數據的穩定性和可靠性等優勢之外，在臨床表現方面還存在一些不 足之處。但在HEV免疫組化染色發現，細胞質中有大量戊型肝炎病毒抗原（HEV-Ag）的分布，同時在組織病理學觀察發現，除肝臟之外大部分臟器組織中缺少典型的病理變化，肝臟的主要病變為廣泛肝細胞變性、空泡變性、濁腫、水樣變性而致氣球樣變，肝細胞胞漿疏松、空泡變性、胞核大小不等，出現雙核、肝竇擴張或變窄，病理現象均與小葉性肝炎相符合。有研究表明，在發展中國家大約有一半HEV感染患者表現出急性肝炎的癥狀［24］，病理學觀察可發現肝細胞排列紊亂、匯管區有多形核細胞和淋巴細胞浸潤等現象［25］。Ji等［26］用Ⅳ型豬HEV通過靜脈注射感染獼猴后，肝組織病理學檢查后發現，肝細胞有輕到中度水腫、肝門周圍存在淋巴細胞浸潤等與人急性肝炎病理學現象相似的病變。說明長爪沙鼠在感染HEV后所顯示的病變與人及非靈長類動物具有一定的相似性，這一結果說明長爪沙鼠具備作為HEV動物模型的潛在價值。我們有必要進一步對最佳接種途徑、時間、環境及對不同基因型HEV的易感性、系統比較病理學觀察等進行研究。長爪沙鼠HEV感染模型的建立，將為今后的HEV研究提供一種更為理想的途徑，加速HEV的研究進程。

4 結論

本實驗探索了使用長爪沙鼠作為HEV感染模型的可行性。通過實驗發現，長爪沙鼠具有可感染HEV及體內復制病毒的能力，同時還發現其組織病理學特征與人類具有相似性，說明其具有作為HEV動物模型的潛在價值。

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（責任編輯 馬鑫）

A Preliminary Study on Infection Model of Mongolian Gerbil by Hepatitis E Virus

ZHU Guang-ze1，2QU Yong-gang2，3LI Yi-quan2LAN Tian2FAN Yuan-yuan2HU Ning-ning2ZHANG Nuo-na2LI Xiao2JIN Ning-yi2
（1. The Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine，Changchun 130021；2. Institute of Veterinary Science，The Academy of Military Medical Sciences，Changchun 130122；3. College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi 832003）

To explore the feasibility of using Mongolian gerbils（Meiiones unguiculataus）to construct an animal model of hepatitis E virus（HEV），HEV RNA was extracted from the diluted suspension of swine feces，then Mongolian gerbils were experimentally inoculated with the HEV via intraperitoneal and oral. Subsequently，the samples of blood，relevant organs（heart，liver，spleen，lungs，kidneys，mesenteric lymph nodes，and spleen）and feces were collected weekly. Samples were detected by RT-PCR and immunohistochemistry. As a result，from day 7 after infection，HEV RNA was detected from the blood，kidney，spleen，mesenteric lymph nodes，liver，lung and feces. The analysis of immunohistochemistry discovered that HEV was expressed in the liver，and caused the pathological changes in liver tissue，but it was lack of obvious clinical manifestations in Mongolian gerbils after HEV infection. All above results suggest that Mongolian gerbils have susceptibility to HEV，and have pathological changes of lobular hepatitis in the liver after HEV infection，indicating that Mongolian gerbils have a potential value to be the animal model of HEV infection.

hepatitis E virus；Mongolian gerbils；animal model

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.032

2015-07-20

朱光澤，男，博士，教授，研究方向：分子病毒學；E-mail：zhuguangze820@126.com

金寧一，男，研究員，博士生導師，研究方向：分子病毒學；E-mail：ningyiK@126.com