梅花鹿發情期陰道細胞形態變化與最適輸精期

韓歡勝，趙列平，柴孟龍，徐　馨，高　利（.東北農業大學動物醫學學院，黑龍江哈爾濱5000；.黑龍江省農墾科學院哈爾濱特產研究所，黑龍江哈爾濱5008；.黑龍江省獸醫科學研究所，黑龍江齊齊哈爾6006）

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梅花鹿發情期陰道細胞形態變化與最適輸精期

韓歡勝1，2，趙列平2，柴孟龍2，徐馨3，高利1
（1.東北農業大學動物醫學學院，黑龍江哈爾濱150030；2.黑龍江省農墾科學院哈爾濱特產研究所，黑龍江哈爾濱150038；3.黑龍江省獸醫科學研究所，黑龍江齊齊哈爾161006）

摘要：為了對梅花鹿進行準確的發情鑒定和適時輸精，本試驗對梅花鹿發情期陰道細胞進行涂片檢查和發情時期劃分，并按劃分時期進行了輸精試驗。通過研究形成了梅花鹿發情前期、發情盛期、發情末期與間情期陰道細胞檢查圖譜，總結出了各時期陰道細胞變化規律。發情期各階段輸精結果，發情盛期的Ⅰ期到Ⅲ期受胎率分別是83.3%、86.5%、79.1%，受胎率明顯高于發情期輸精總的受胎率71.5%，確定梅花鹿普通凍精輸精最適時期是發情盛期（Ⅰ期-Ⅲ期）。研究表明，梅花鹿陰道細胞發情鑒定是提高梅花鹿人工授精受胎率的一種新的有效方法。

關鍵詞：梅花鹿；發情期；陰道細胞；形態變化；最適輸精

準確的發情鑒定對提高動物繁殖生產意義重大。目前，哺乳動物發情鑒定方法有行為觀察法、公獸試情法、陰道細胞學檢查法、陰道電阻測定法、生殖激素含量測定法、唾液結晶檢查法等多種方法[1-5]。梅花鹿屬季節性周期多次發情動物，發情鑒定目前主要采用公鹿試情行為觀察的方法，由于其生性膽小，發情行為隱蔽，采用該法一般很難確定發情所處階段，給適時配種或輸精增加了難度。為進一步提高情期受胎率，本研究對梅花鹿發情不同階段陰道細胞進行了形態學檢查和時期劃分，并按劃分時期進行了輸精試驗。

1　材料

1.1實驗動物用于發情期陰道細胞檢查和人工輸精的鹿，北京市懷柔區喇嘛溝門西府營鄉梅花鹿場提供56頭，富?？h梅花鹿場提供83頭。

1.2試驗器械、藥品載玻片、醫用棉簽、75%酒精、生理鹽水、光學顯微鏡（帶顯微攝像頭）、鹿眠寶、鹿醒寧（青島漢河集團）、消毒毛巾、日式輸精槍、梅花鹿常規凍精。

2　試驗方法

2.1梅花鹿陰道細胞檢查及時期劃分用公鹿試情方法進行母鹿發情鑒定，將發情的母鹿每隔2 h進行1次麻醉，用消毒毛巾擦凈外陰，用生理鹽水將消毒后的棉簽蘸濕，順著陰道上側壁，邊捻轉邊插入，到10 cm左右深度時，貼著陰道上側壁捻轉3～4次，順著上側壁慢慢拉出。然后在潔凈的載玻片上從一邊開始，轉動棉簽將陰道黏液均勻的涂抹在載玻片中央，自然風干后在16×40倍顯微鏡下檢查發情期陰道細胞形態，并結合發情行為和細胞形態特點劃分發情時期。

2.2梅花鹿輸精適期確定用陰道細胞檢查方法對發情期各階段進行凍精人工輸精試驗，每次輸0.25 mL細管凍精1支，解凍后有效精子數≥1 000萬個，活力≥0.3。然后根據各時段輸精母鹿的受胎率情況來確定最適輸精時間。

3　結果與分析

3.1梅花鹿發情期各階段陰道細胞變化按副基細胞、有核角化細胞、無核角化細胞出現和轉化情況將發情期分為發情前期、發情盛期和發情末期，并對各期進行了Ⅰ期到Ⅲ期的具體細化，總結了發情期各期細胞變化特點。為區別對照發情期與間情期細胞變化，對間情期陰道細胞形態變化也進行了檢查。

3.1.1發情前期陰道細胞變化發情前期Ⅰ期，母鹿處于發情前期的早期，剛接受公鹿爬跨，溜圈，陰道細胞特征是副基細胞散在稀疏，主要是小中間細胞（圖1左圖箭頭表示）。發情前期Ⅱ期，母鹿處于發情前期的中期，接受公鹿爬跨，外逃，陰道細胞特征是副基細胞增多，小中間細胞多于大中間細胞（圖1中圖箭頭所示），血小板增多，均勻分布。發情前期Ⅲ期：母鹿處于發情前期的晚期，接受公鹿爬跨，外逃，陰道細胞特征是副基細胞增多，其中大中間細胞（圖1右圖箭頭所示）多于小中間細胞，血小板密集。在160～640倍顯微鏡下，血小板可檢查到，但圖像經過轉換后血小板在圖片上呈現不清晰，與細胞分層觀察有關，以下各期圖片效果相同。

3.1.2發情盛期陰道細胞變化發情盛期Ⅰ期：母鹿處于發情盛期的早期，接受公鹿爬跨，陰道細胞特征是有核角化細胞（圖2左圖箭頭所示）開始出現增多，副基細胞多于有核角化細胞，并以大中間細胞為主，血小板密集。發情盛期Ⅱ期，母鹿處于發情盛期的中期，接受公鹿狀態為一爬一走，陰道細胞特征是有核角化細胞（圖2中圖長箭頭所示）多于副基細胞，副基細胞以大中間細胞（圖2中圖短箭頭所示）為主，血小板開始減少。發情盛期Ⅲ期：母鹿處于發情盛期的晚期，拒絕公鹿爬跨，陰道上皮細胞特征是出現大量紅細胞（2右圖箭頭所示），大量有核角化細胞，少量副基細胞（大中間細胞為主），血小板散在稀疏。

3.1.3發情末期陰道細胞變化發情末期Ⅰ期：母鹿處于發情末期的早期，拒絕公鹿爬跨，陰道細胞特征是中量紅細胞，中量無核角化細胞（圖3左圖長箭頭所示），極少量副基細胞（以大中間細胞為主），血小板特別稀疏。發情末期Ⅱ期：母鹿處于發情末期的中期，拒絕公鹿爬跨，陰道細胞特征是中量無核角化細胞（圖3中圖長箭頭所示），副基細胞（小、大中間細胞）又開始增多，少量紅細胞（圖3中圖短箭頭所示），細胞開始聚集。發情末期Ⅲ期：母鹿處于發情末期的晚期，拒絕公鹿爬跨，陰道細胞特征是副基細胞（小、大中間細胞）中量，少量無核角化細胞，出現少量細胞碎片，細胞聚集呈云霧狀。

圖1　發情前期陰道細胞變化（×640）

3.1.4間情期陰道細胞變化間情期，母鹿拒絕公鹿爬跨，性興奮轉為安靜，陰道細胞特征是零星的副基細胞，且主要是大中間細胞（圖4左圖），或只見細胞碎片（圖4右圖），或零星的副基細胞與細胞碎片同時出現（圖4中圖）。

3.2最適輸精時間梅花鹿普通凍精輸精發情期各階段受胎情況見表1，輸精受胎集中時間是發情前期Ⅲ期到發情末期的Ⅱ期，受胎率依次是31.3%、83.3%、86.5%、79.1%、53.3%、20.0%，其中輸精受胎率最高階段是發情盛期的Ⅰ期至Ⅲ期，受胎率分別是83.3%、86.5%、79.1%，比總受胎71.5%分別高15.0%、7.6%，說明發情盛期的Ⅰ期至Ⅲ期是梅花鹿普通凍精輸精最適時間。

圖3　發情末期陰道細胞變化（×640）

4　討論

圖4　間情期陰道細胞變化（×640）

表1　發情期各階段人工輸精效果

4.1梅花鹿排卵過程與陰道細胞變化關系試驗認為梅花鹿陰道細胞的來源，主要由陰道上皮細胞和排卵過程中產生的細胞組成。細胞形態的變化主要由生殖激素雌激素和孕激素作用引起。梅花鹿發情期陰道內細胞變化本研究認為由兩條途徑調節，一條途徑是，排卵過程引起的細胞變化。鹿進入發情季節，卵泡雌激素分泌增多，在雌激素的反饋作用下，垂體前葉LH分泌增加，FSH分泌減少，使排卵前出現LH峰，進而激發卵泡產生一系列的理化變化，最終引發卵泡膜變薄、充血、破裂與排卵，通過分泌物引起陰道內細胞的變化，在陰道細胞檢查中出現的紅細胞、血小板就是由卵泡充血滲出血液（主要是血小板）和破裂時流出的液體引起的。另一條途徑是，通過血液中雌激素和孕激素周期的改變引起陰道上皮細胞變化。

4.2低倍鏡下不規則圖像出現原因陰道分泌物涂片在低倍顯微鏡（16×10倍）肉眼觀察到不規則形狀出現原因。涂片在低倍顯微鏡視野內細胞會出現散點狀、雪松狀、雪花狀、云霧狀等圖像。本試驗認為與“血小板衛星現象”有關[6]?！把“逍l星現象”是在涂片中血小板粘附于白細胞周圍，在顯微鏡下呈現簇狀聚集的現象。在鹿陰道細胞檢查中當臨近排卵前后，卵巢組織受損，白細胞增多，發情前期和發情盛期出現了嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、嗜中性粒細胞和單核細胞；另外卵泡血液滲出或排卵出血時，會出現大量的血小板，這樣血小板和白細胞的按不同比例混合，經過“血小板衛星現象”，形成了各種觀察圖像。

4.3輸精劑量與受胎率的關系梅花鹿是陰道射精型動物，精子到達輸卵管壺腹部受精，需穿過子宮頸、宮管連接部、輸卵管壺腹部和狹部連接部等柵欄，本交射精上億個但到達壺腹部的精子只有幾百個。人工輸精時精子數不能低于某一限度，才可保證壺腹部有足夠的用以受精的精子。綿羊正常一次射精約有30億個精子，但通過子宮頸者卻少于100萬個[1]；在牛的繁殖上每次輸精劑量是≥800萬有效精子[7]；目前，鹿冷凍精液還沒有國標，趙列平等輸精試驗表明[8]，梅花鹿性控凍精（解凍后有效精子數100～120萬）與普通凍精（有效精子數≥1 000萬）輸精情期受胎率60.76 %、61.63 %，兩者間無顯著差異（P>0.05），說明梅花鹿人工輸精有效精子數120萬就可保證受胎。本試驗使用的凍精有效精子數≥1 000萬，輸精部位躍過子宮頸，這樣保證了有足夠的精子到達輸卵管壺腹部，并受精。

4.4最適輸精時間最適輸精時間由排卵時間、精子受精能力、精子獲能時間等多個因素共同決定，使用凍精輸精，準確的發情鑒定是確定最適輸精時間的關鍵[9-13]。目前，梅花鹿人工輸精主要采取公鹿試情結合行為觀察或采用同期發情定時輸精的方法，往往因個體差異，采用上法很難確定最佳時間，本研究通過陰道細胞檢查方法，增強了發情鑒定判定的準確性，結合公鹿試情可明顯提高梅花鹿受胎率。

5　結論

本試驗形成了梅花鹿發情期陰道細胞檢查圖譜，總結出了陰道細胞檢查發情鑒定規律。應用陰道細胞發情鑒定技術確定了梅花鹿普通凍精輸精最適時期是發情盛期（Ⅰ期-Ⅲ期），陰道細胞發情鑒定技術作為一種新的方法可應用于梅花鹿繁殖生產。

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Vaginal Cell Morphological Changes in Estrus and the Best Inseminating Timeon Sika Deer

HAN Huan-sheng1，2，ZHAO Lie-ping2，CHAI Meng-long2，XU Xin3，GAO Li1
（1.College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.Harbin Specialty Research Institute，Heilongjiang Academy of Land Reclamation Sciences，Harbin 150038，China；3.Heilongjiang Institute of Veterinary Science，Qiqihar 161006，China）

Abstract：To identify estrus accurately and start artificing insemination timely on the sika deer，we performed a complete study on the observation of sika deer vaginal cell smear using microscop . Our results summarized the vaginal cell examination plates and transformation law in proestrus，vigorous estrus，and late estus and diestrus.We showed that artificing insemination time of the sika deer was in vigorous estrus stage from ItoIII，and the conception rates of artificial insemination were 83.3%，86.5%，and 79.1% from I stage toIII，respectively，which are obviously higher conception rate in each vigorous estrus stage than the general conception rate（71.5%）in estres period.These data indicate that it is a new effective method to improve the conception rate of arti?ficial insemination by identifying the vaginal cells on estrus sika deer.

Key words：Sika Deer；Estrus；Vaginal Cell；Morphological Changes；The Best Inseminating Time

中圖分類號：S825

文獻標志碼：A

文章編號：0529-6005（2016）05-0028-04

收稿日期：2015-05-26

基金項目：黑龍江省應用技術研究與開發計劃項目（GC13B-（GC13B407）；黑龍江省農墾總局攻關項目（HNKIV-08-12A，HNK125B-12-05）；哈爾濱市科技創新項目（2015RQQYJ033）

作者簡介：韓歡勝（1978-），男，副研究員，碩士，從事動物醫學工作，E-mail：hanhuansheng@aliyun.com

通訊作者：高利，E-mail：gaoli43450@163.com

Corresponding author：GAO Li